PMCA prionien suuren näytemäärän tunnistamiseen UIP400MTP-ultraäänilaitteella

Monikuoppalevyjen UIP400MTP-ultraäänilaite tarjoaa tehokkaan ratkaisun suuren näytemäärän valmisteluun proteiinien virhelaskostumisen syklisessä monistuksessa (PMCA). Jakamalla energian tasaisesti useisiin kuoppiin ja ylläpitämällä tarkkoja ultraäänikäsittelyparametreja tämä järjestelmä mahdollistaa lukuisten näytteiden samanaikaisen käsittelyn poikkeuksellisen toistettavasti. Nämä ominaisuudet ovat ratkaisevan tärkeitä optimoitaessa PMCA-menetelmää pienten prionipitoisuuksien tunnistamiseen haastavista biologisista näytteistä, kuten syljestä, joissa määrityksen estäjät voivat vaikeuttaa tulosten tulkintaa.

Prionitaudit, kuten hirvieläinten krooninen näivetystauti (CWD) ja ihmisten Creutzfeldt–Jakobin tauti (CJD), ovat hermostoa rappeuttavia sairauksia, joita aiheuttavat virhelaskostuneet prioniproteiinit (PrP^Sc). Näissä sairauksissa tartuntakykyisiä prioneja esiintyy usein pieninä määrinä kehon nesteissä, kuten syljessä, veressä ja virtsassa, mikä vaikeuttaa diagnostiikkaa ja tutkimusta. CWD:n horisontaalisella tartunnalla ympäristömatriiseihin erittyneiden prionien välityksellä on erityisen merkittäviä vaikutuksia luonnonvaraisten eläinkantojen hoitoon ja ekosysteemien terveyteen. Samoin esimerkiksi Creutzfeldt–Jakobin taudissa ihmisnäytteiden virhelaskostuneiden prioniproteiinien luotettava monistaminen on ratkaisevan tärkeää diagnostiikan kehittämisessä ja taudin etenemisen ymmärtämisessä.

Muokatun PMCA-protokollan soveltaminen mahdollistaa yleisten määrityksen estäjien, kuten syljen musiinien, vaikutuksen ohittamisen ja prionien erittäin herkän tunnistamisen tilanteissa, joissa niitä ei muuten voitaisi tunnistaa tai tunnistustulokset jäisivät epäselviksi esimerkiksi reaaliaikaisella ravistelun indusoimalla konversiolla (RT-QuIC). Nämä edistysaskeleet parantavat prionien tunnistamista eri sairauksissa ja tekevät PMCA:sta välttämättömän työkalun prionitutkimuksessa ja diagnostiikassa. Monikuoppalevyjen UIP400MTP-ultraäänilaite helpottaa suuren näytemäärän PMCA-käsittelyä ultraäänikäsittelemällä lukuisia näytteitä mikrolevyillä, esimerkiksi 6-, 24- tai 96-kuoppalevyillä, tai putkitelineessä olevissa näytepulloissa.

Protokolla suuren näytemäärän proteiinien virhelaskostumisen sykliseen monistukseen (PMCA)

Seuraava protokolla mahdollistaa suuren näytemäärän tehokkaan käsittelyn täsmälleen samoissa olosuhteissa luotettavien tutkimustulosten saamiseksi.

Näytteiden valmistelu

Lähtömateriaali:
Prepare samples by:

• Resuspending sarkosyl extraction pellets in PMCA substrate.
• Suoraan piikittävät aivohomogenaatit tai verinäytteet prionin siemenillä.

Substraatti:

• Käytä 10-prosenttista (paino/tilavuus) aivohomogenaattia, joka on valmistettu siirtogeenisistä hiiristä, jotka ilmentävät liikaa PrP:tä^C (e.g., Tg mice).
• Homogenize the brain tissue in:
  – 1× PBS.
  – 150 mM NaCl.
  – 1% Triton X-100.
• Store the substrate at -80ºC until use.

Näytteiden asettelu mikrolevylle tai putkiin:
Putket:

• Lisätään 90 μl aivohomogenaattisubstraattia ja siemen sekä 10 μl näytettä (esim. verta, aivohomogenaattia tai sarkosyylipellettiä).
• Place 3 Teflon beads (1,59-mm or 2,38-mm diameter) in each 0,2 mL tube.
• Asenna putket telineeseen, joka on yhteensopiva UIP400MTP sonicatorin kanssa.

6-kuoppainen mikrolevy:

• Lisää kuhunkin kuoppaan 5 mL aivohomogenaattisubstraattia ja ympää se 500 μL:lla näytettä.
• Add 3 Teflon beads to each well.

PMCA-menettely

Sijoittaminen:
Aseta putkiteline tai 6-kuoppainen mikrolevy UIP400MTP sonicatoriin valmistajan ohjeiden mukaisesti.

Sykliohjelma:
Perform 144 PMCA cycles as follows:

• Inkubointi: 29 minuuttia ja 30 sekuntia 37 °C:ssa.
• Sonication: 30 seconds at 60% amplitude.
• Tarkkaile lämpötilaa: Käytä kytkettävää lämpötila-anturia näytteen lämpötilan valvontaan ja ohjelmoi UIP400MTP enintään 48–50 °C:n lämpötilaan.

Seuraavat kierrokset:
Kun ensimmäinen 144 syklin kierros on suoritettu, siirretään osa monistetusta materiaalista:

• Laimennetaan 10-kertaiseksi tuoreeseen siirtogeeniseen hiiren aivojen homogenaattisubstraattiin.
• Suorita 96 PMCA-sykliä seuraaville kierroksille säilyttäen samat sonikaatioparametrit.
• Jatka haluttu määrä kierroksia (yleensä enintään 5).

Prioniproteiinin tunnistus: PrP^Sc

1. Proteinaasi K -pilkkominen:
   – Käsittele näytteitä proteinaasi K:lla (50 μg/mL) 37°C:ssa 1 tunnin ajan.
   – Lopeta pilkkominen lisäämällä SDS-näytepuskuria ja keittämällä 10 minuutin ajan.
2. Western blot -analyysi:
   – Analyze digested samples using:
   – 6H4 or PRC1 anti-PrP antibodies.
   En voi kääntää tartuntakykyisten prionien käsittelyn yksityiskohtaisia työohjeita.

 

Hielscher UIP400MTP on erittäin monipuolinen ultraäänilaite monikuoppalevyille, PCR-levyille ja näyteputkille. Sen jatkuva ultraääniteho on 400 wattia, ja se on suunniteltu esimerkiksi solujen hajotukseen, emulgointiin, proteiinien uuttamiseen, DNA:n ja RNA:n fragmentointiin, agglomeraattien hajotukseen, FFPE-näytteiden uuttamiseen, solujen ja biofilmien irrottamiseen sekä emulgointiin. UIP400MTP ei ole ultraäänikylpy. Se on voimakkaaseen, kohdennettuun ultraäänikäsittelyyn tarkoitettu kuppimainen sonotrodi. Tämä tehokas, kosketukseton ultraäänilaite käsittelee vakiolevyn kaikki kuopat tasaisesti. Amplitudia, tehoa ja pulssitusta voidaan säätää tarkasti. Sisäänrakennettu ajastin ja lämpötila-anturi varmistavat yhdenmukaiset tulokset. UIP400MTP-levysonikaattori jäähdyttää näytteet vesihauteessa, johon on saatavana lisävarusteena ulkoinen jäähdytin.

 

Käsittele enemmän näytteitä luotettavampien tulosten saamiseksi

Monikuoppalevyjen UIP400MTP-ultraäänilaite parantaa merkittävästi proteiinien virhelaskostumisen syklisen monistuksen (PMCA) tehokkuutta ja skaalautuvuutta ja vastaa menetelmän perinteiseen aikaa vievään luonteeseen. Mahdollistamalla jopa 96 näytteen samanaikaisen käsittelyn 96-kuoppalevyllä järjestelmä sujuvoittaa PMCA-työnkulkuja ja ylläpitää samalla tarkkoja ja yhdenmukaisia ultraäänikäsittelyolosuhteita kaikissa kuopissa. Tämä suuren näytemäärän käsittelykapasiteetti minimoi manuaalisen käsittelyn, vähentää työläitä vaiheita ja varmistaa toistettavuuden, mikä tekee laitteesta välttämättömän työkalun prionitutkimuksessa. Tutkittaessa kroonista näivetystautia tai Creutzfeldt–Jakobin tautia UIP400MTP helpottaa laajamittaisten tutkimusten toteuttamista entistä tehokkaammin ja auttaa tutkijoita vastaamaan nykyaikaisten diagnostisten ja tieteellisten sovellusten vaatimuksiin.

---

---

Kirjallisuus / Lähteet

• FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
• Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
• De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
• Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
• Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
• Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
• Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.