PMCA prionien korkean suorituskyvyn havaitsemiseen UIP400MTP Sonicatorin avulla

UIP400MTP monikuoppalevyinen sonikaattori tarjoaa tehokkaan ratkaisun korkean suorituskyvyn näytteen valmistukseen proteiinien väärin taittuvassa syklisessä monistuksessa (PMCA). Tuottamalla tasaisen energian jakautumisen useisiin kuoppiin ja ylläpitämällä tarkkoja sonikaatioparametreja tämä järjestelmä mahdollistaa lukuisten näytteiden samanaikaisen käsittelyn, jolla on poikkeuksellinen toistettavuus. Nämä ominaisuudet ovat kriittisiä PMCA: n optimoimiseksi prionien havaitsemiseksi pieninä pitoisuuksina haastavissa biologisissa näytteissä, kuten syljessä, jossa määrityksen estäjät voivat peittää tulokset.

Prionitaudit, kuten hirvieläinten CWD-tauti (CWD) ja ihmisillä Creutzfeldt-Jakobin tauti (CJD), ovat väärin laskostuneiden prioniproteiinien (PrP) aiheuttamia hermoston rappeutumissairauksia^Sc). Näihin sairauksiin liittyy usein alhainen määrä tarttuvia prioneja kehon nesteissä, kuten syljessä, veressä ja virtsassa, mikä vaikeuttaa diagnoosia ja tutkimusta. CWD:n horisontaalinen siirtyminen ympäristömatriiseissa olevien prionien kautta vaikuttaa erityisen merkittävästi luonnonvaraisten eläinten hoitoon ja ekologiseen terveyteen. Samoin Creutzfeldt-Jakobin taudin kaltaisissa sairauksissa väärin laskostuneiden prioniproteiinien luotettava monistaminen ihmisnäytteistä on ratkaisevan tärkeää diagnostiikan edistämiseksi ja taudin etenemisen ymmärtämiseksi.

Muokatun PMCA-protokollan soveltaminen mahdollistaa yleisten määritysten estäjien (esim. syljen musiinien) ohittamisen ja suuren herkkyyden saavuttamisen prionien havaitsemisessa, jotka olisivat muuten havaitsemattomia tai moniselitteisiä käyttämällä tekniikoita, kuten reaaliaikainen maanjäristyksen aiheuttama muunnos (RT-QuIC). Nämä edistysaskeleet parantavat prionien havaitsemista eri sairauksissa, mikä tekee PMCA:sta korvaamattoman työkalun prionitutkimuksessa ja diagnostiikassa. Monikuoppalevyinen sonikaattori helpottaa UIP400MTP suuren suorituskyvyn PMCA: ta, joka sonikoi lukuisia näytteitä mikrolevyissä (esim. 6-, 24- tai 96-kuoppalevyissä) tai injektiopulloissa putkitelineessä.

PMCA-protokolla (High-Throughput Protein Misfolding Cyclification (PMCA)

Seuraava protokolla mahdollistaa suuren näytemäärän tehokkaan käsittelyn täsmälleen samoissa olosuhteissa luotettavien tutkimustulosten saavuttamiseksi.

Näytteen valmistelu

Lähtöaine:
Valmistele näytteet seuraavasti:

• Sarkosyyliuuttopellettien uudelleensuspensio PMCA-substraattiin.
• Suoraan piikittävät aivohomogenaatit tai verinäytteet prionin siemenillä.

Substraatti:

• Käytä 10-prosenttista (paino/tilavuus) aivohomogenaattia, joka on valmistettu siirtogeenisistä hiiristä, jotka ilmentävät liikaa PrP:tä^C (esim. Tg-hiiret).
• Homogenoi aivokudos:
  – 1× PBS.
  – 150 mM NaCl.
  – 1% Triton X-100.
• Säilytä alustaa -80 ºC:ssa käyttöön asti.

Näytteen asettaminen mikrolevyyn tai putkiin:
Putket:

• Lisätään 90 μl aivohomogenaattisubstraattia ja siemen sekä 10 μl näytettä (esim. verta, aivohomogenaattia tai sarkosyylipellettiä).
• Aseta 3 teflonhelmeä (halkaisija 1,59 mm tai 2,38 mm) jokaiseen 0,2 ml:n putkeen.
• Asenna putket telineeseen, joka on yhteensopiva UIP400MTP sonicatorin kanssa.

6-kuoppainen mikrolevy:

• Lisätään 5 ml aivohomogenaattisubstraattia ja siemeniä 500 μl:lla näytettä kuoppaa kohti.
• Lisää 3 teflonhelmiä kuhunkin kuoppaan.

PMCA-menettely

Sijoittelu:
Aseta putkiteline tai 6-kuoppainen mikrolevy UIP400MTP sonicatoriin valmistajan ohjeiden mukaisesti.

Pyöräilyohjelma:
Suorita 144 PMCA-sykliä seuraavasti:

• Inkubointi: 29 minuuttia ja 30 sekuntia 37 °C:ssa.
• Sonikaatio: 30 sekuntia 60%: n amplitudilla.
• Tarkkaile lämpötilaa: Käytä kytkettävää lämpötila-anturia näytteen lämpötilan valvontaan ja ohjelmoi UIP400MTP enintään 48–50 °C:n lämpötilaan.

Seuraavat kierrokset:
Kun ensimmäinen 144 syklin kierros on suoritettu, siirretään osa monistetusta materiaalista:

• Laimennetaan 10-kertaiseksi tuoreeseen siirtogeeniseen hiiren aivojen homogenaattisubstraattiin.
• Suorita 96 PMCA-sykliä seuraaville kierroksille säilyttäen samat sonikaatioparametrit.
• Jatka haluttu määrä kierroksia (yleensä enintään 5).

PrP: n havaitseminen^Sc

1. Proteinaasi K -pilkkominen:
   – Näytteitä käsitellään proteinaasi K:lla (50 μg/ml) 37 °C:ssa 1 tunnin ajan.
   – Lopeta ruoansulatus lisäämällä SDS-näytepuskuria ja keittämällä 10 minuuttia.
2. Western Blot -analyysi:
   – Analysoi pilkotut näytteet käyttämällä:
   – 6H4- tai PRC1-anti-PrP-vasta-aineet.
   – Suorita SDS-PAGE ja siirrä PVDF-kalvoille havaitsemista varten.

 

 

Käsittele enemmän näytteitä luotettavampien tulosten saamiseksi

UIP400MTP monikuoppalevyinen sonikoija parantaa merkittävästi proteiinien virheellisen laskostumisen syklisen monistuksen (PMCA) tehokkuutta ja skaalautuvuutta, mikä vastaa menettelyn perinteisesti aikaa vievään luonteeseen. Sallimalla jopa 96 näytteen samanaikaisen käsittelyn 96-kuoppalevyssä järjestelmä virtaviivaistaa PMCA-työnkulkuja säilyttäen samalla tarkat ja yhtenäiset sonikaatio-olosuhteet kaikissa kaivoissa. Tämä suuri suorituskyky minimoi manuaalisen käsittelyn, vähentää työvoimavaltaisia vaiheita ja varmistaa toistettavuuden, mikä tekee siitä välttämättömän työkalun prionitutkimuksessa. Olipa kyse kroonisesta näivetystaudista tai Creutzfeldt-Jakobin taudista, UIP400MTP helpottaa laajamittaisia tutkimuksia tehokkaammin, jolloin tutkijat voivat vastata nykyaikaisten diagnostisten ja tieteellisten sovellusten vaatimuksiin.

---

---

Kirjallisuus / Viitteet

• FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
• Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
• De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
• Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
• Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
• Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
• Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.