Amyloidifibrillin muodostuminen käyttämällä UIP400MTP mikrolevyn sonikaattoria

Amyloidifibrillit, aivan kuten kitteet, muodostuvat ytimien muodostumisen ja myöhemmän kasvun kautta. Nukleaation korkean vapaan energian esteen vuoksi spontaani amyloidifibrillin muodostuminen tapahtuu kuitenkin vasta pitkäaikaisen viivevaiheen jälkeen. Ultrasonication on noussut tehokkaaksi työkaluksi amyloidinukleaatioiden indusoimiseksi, mikä nopeuttaa merkittävästi fibrillin muodostumista. Yhdistettynä tioflaviini T (ThT) -fluoresenssia käyttävään mikrolevynlukijaan ultraääni mahdollistaa amyloidifibrillien korkean suorituskyvyn havaitsemisen useissa näytteissä samanaikaisesti.

Ultraäänellä indusoitu amyloidifibrillin muodostuminen UIP400MTP mikrolevyn sonikaattorilla

UIP400MTP monikuoppaisella levysonikaattorilla samanlaatuiset amyloidifibrillit suurina määrinä voidaan syntetisoida nopeasti tutkimustarkoituksiin. Tämä tehokas lähestymistapa mahdollistaa proteiinien amyloidogeenisuuden tutkimisen. Tämä tekniikka helpottaa nopeaa ja toistettavaa amyloidivärinää, kuten on osoitettu β2-mikroglobuliinilla (β2-m), amyloidogeenisellä proteiinilla, joka liittyy dialyysiin liittyvään amyloidoosiin.

Yksinkertainen kokeellinen lähestymistapa: ultraäänellä indusoitu amyloidivärinä

Fibrillin muodostumisen aikaansaamiseksi UIP400MTP monikuoppaisen levysonikaattorin keskelle asetettiin 96-kuoppainen mikrolevy, joka varmistaa tasaisen ultraäänialtistuksen kaikissa kuopissa. Koeolosuhteet olivat seuraavat:

1. Jokainen kuoppa sisälsi 0,2 ml β2-mikroglobuliiniliuosta (0,3 mg/ml, pH 2,5), johon oli lisätty 5 μM ThT.
2. Levylle tehtiin ultraäänijaksoja, kuten 1 minuutin ultraääni, jota seurasi 9 minuutin tauko.
3. Sonikoinnin jälkeen ThT-fluoresenssi mitattiin mikrolevynlukijalla.

(vrt. So et al., 2011)

Vertailu tavanomaiseen sekoitukseen

Perinteisiin sekoitusmenetelmiin verrattuna ultraääni vähensi huomattavasti fibrillin muodostumisen viivevaihetta. Tavanomaisissa mikrolevyjen ravisteluolosuhteissa vain 1 kuopassa 10:stä osoitti lisääntynyttä ThT-fluoresenssia 20 tunnin kuluttua. Sitä vastoin käytettäessä sykliä ultrasonicationia (15 minuutin sonikaatio ja 5 minuutin lepotila) havaittiin merkittävä ThT-fluoresenssin nousu heti ensimmäisen sonikaatiohoidon jälkeen.

Värinäkinetiikan nopea kiihtyminen

(2011) osoittivat, että β2-mikroglobuliinin spontaania fibrillimuodostumista pH:ssa 2,5 voidaan nopeuttaa useista tunneista vain 10–15 minuuttiin ultraäänellä.
Atomivoimamikroskopiakuvat (AFM) vahvistivat, että 10 minuutin ultraäänellä 15 minuutin välein syntyneet fibrillit olivat morfologisesti erottamattomia niistä, jotka muodostuivat 1 minuutin ultraäänellä 10 minuutin välein. Tämä korostaa ultraäänellä indusoidun amyloidivärinän toistettavuutta ja kestävyyttä.

AFM-kuvat amyloidifibrilleistä, jotka on tuotettu 1 minuutin ultraäänellä 10 minuutin välein (i), 10 minuutin sonikaatiolla 15 minuutin välein (ii) ja kylvöreaktiolla ilman ultraääntä (iii). Valkoinen asteikkopalkki edustaa 1 μm.
Tutkimus ja kuvat: ©So et al., 2011

Värinä neutraaleissa pH-olosuhteissa

Jopa neutraaleissa pH-olosuhteissa fibrillin muodostuminen saavutettiin 1,5 tunnin viiveen jälkeen, mikä osoittaa, että ultraääni alentaa merkittävästi energeettistä estettä nukleaatiolle ja kasvulle. Tämä tukee edelleen hypoteesia, että amyloidivärinä on ensisijaisesti fysikaalinen reaktio, jota rajoittaa suurelta osin nukleaatioenergiaeste, jota ultraääni vähentää tehokkaasti.

Vaikutus amyloideihin liittyvien sairauksien tutkimukseen

Amyloidifibrillien helpolla ja luotettavalla muodostumisella UIP400MTP mikrolevyn sonikaattorilla on merkittäviä vaikutuksia Alzheimerin taudin (AD) tutkimukseen ja muihin amyloidiin liittyviin sairauksiin, kuten Parkinsonin tautiin, tyypin II diabetekseen ja systeemisiin amyloididoosiin. Alzheimerin taudin hoidossa amyloidi-β (Aβ) aggregaatio on keskeinen patologinen tunnusmerkki, mutta sen värinäkinetiikan tutkiminen on edelleen haastavaa pitkien viivevaiheiden ja perinteisten menetelmien vaihtelun vuoksi. Ultraääniohjattu fibrillin muodostuminen nopeuttaa nukleaatiota, mikä varmistaa korkean toistettavuuden ja vähentyneen vaihtelun, mikä on ratkaisevan tärkeää mahdollisten estäjien seulonnassa ja amyloidogeenisten mekanismien ymmärtämisessä. Lisäksi UIP400MTP:n korkea suorituskyky mahdollistaa laajamittaiset tutkimukset proteiinien laskostumisesta ja aggregaatiosta, mikä helpottaa sellaisten terapeuttisten aineiden löytämistä, jotka voivat moduloida fibrillin muodostumista ja mahdollisesti lieventää hermoston rappeutumista.

Tämä tutkimus vahvistaa ultraäänen käyttämällä UIP400MTP monikuoppaista levysonikaattoria erittäin tehokkaana menetelmänä amyloidifibrillin muodostumisen nopeuttamiseksi. Tämän lähestymistavan tärkeimpiä etuja ovat:

• Värinän viiveen dramaattinen lyheneminen.
• Tasainen ultraäänialtistus kaikissa kuopissa, mikä mahdollistaa toistettavan fibrillin muodostumisen.
• Korkean suorituskyvyn seulontakyky, joten se soveltuu proteiinien amyloidogeenisuuden genominlaajuisiin etsintöihin.

Integroimalla ultraääni ThT-fluoresenssitunnistukseen tämä menetelmä tarjoaa nopean, skaalautuvan ja luotettavan alustan amyloidivärinän tutkimiseen. Koska tämä lähestymistapa on tehokas ja suorituskykyinen, se voi helpottaa amyloidifibrillien helppoa synteesiä biofysikaalista ja farmaseuttista tutkimusta varten, mikä tarjoaa lupaavan työkalun amyloideihin liittyviin tutkimuksiin ja lääkkeiden seulontaan.