Amyloidifibrillien muodostuminen mikrolevyjen ultraäänikäsittelylaitteella UIP400MTP

Amyloidifibrillit muodostuvat kiteiden tavoin nukleaation ja sitä seuraavan kasvun kautta. Nukleaation korkean vapaan energian esteen vuoksi amyloidifibrillien spontaani muodostuminen tapahtuu kuitenkin vasta pitkän viivevaiheen jälkeen. Ultraäänikäsittelystä on tullut tehokas väline amyloidin nukleaation käynnistämiseen, mikä nopeuttaa merkittävästi fibrillien muodostumista. Yhdistettynä tioflaviini T:n (ThT) fluoresenssia mittaavaan mikrolevylukijaan ultraäänikäsittely mahdollistaa amyloidifibrillien havaitsemisen suurella näytekapasiteetilla useista näytteistä samanaikaisesti.

Ultraäänellä indusoitu amyloidifibrillien muodostuminen mikrolevyjen ultraäänikäsittelylaitteella UIP400MTP

Monikuoppalevyjen ultraäänikäsittelylaitteella UIP400MTP voidaan syntetisoida nopeasti suuria määriä samanlaatuisia amyloidifibrillejä tutkimustarkoituksiin. Tämä tehokas lähestymistapa mahdollistaa proteiinien amyloidogeenisuuden tutkimisen. Menetelmä mahdollistaa amyloidifibrillien nopean ja toistettavan muodostumisen, kuten on osoitettu β2-mikroglobuliinilla (β2-m), joka on dialyysiin liittyvään amyloidoosiin yhdistetty amyloidogeeninen proteiini.

Yksinkertainen kokeellinen lähestymistapa: ultraäänellä indusoitu amyloidifibrillien muodostuminen

Fibrillien muodostumisen käynnistämiseksi 96-kuoppainen mikrolevy asetettiin monikuoppalevyjen ultraäänikäsittelylaitteen UIP400MTP keskelle. Laite varmistaa tasaisen ultraäänialtistuksen kaikissa kuopissa. Koeolosuhteet olivat seuraavat:

1. Kukin kuoppa sisälsi 0,2 ml β2-mikroglobuliiniliuosta (0,3 mg/ml, pH 2,5), johon oli lisätty 5 μM ThT:tä.
2. Levylle tehtiin ultraäänikäsittelyjaksoja, kuten 1 minuutin ultraäänikäsittely, jota seurasi 9 minuutin tauko.
3. Ultraäänikäsittelyn jälkeen ThT-fluoresenssi mitattiin mikrolevylukijalla.

(vrt. So et al., 2011)

Vertailu tavanomaiseen sekoittamiseen

Tavanomaisiin sekoitusmenetelmiin verrattuna ultraäänikäsittely lyhensi huomattavasti fibrillien muodostumisen viivevaihetta. Tavanomaisissa mikrolevyn ravisteluolosuhteissa vain 1 kuopassa 10:stä havaittiin lisääntynyttä ThT-fluoresenssia 20 tunnin kuluttua. Sen sijaan jaksottaista ultraäänikäsittelyä käytettäessä (15 minuutin ultraäänikäsittely, jota seurasi 5 minuutin lepojakso) havaittiin merkittävä ThT-fluoresenssin lisääntyminen heti ensimmäisen ultraäänikäsittelyn jälkeen.

Fibrillien muodostumiskinetiikan nopea kiihtyminen

So et al. (2011) osoittivat tuloksillaan, että β2-mikroglobuliinin spontaania fibrillien muodostumista pH:ssa 2,5 voidaan nopeuttaa ultraäänikäsittelyllä useista tunneista vain 10–15 minuuttiin.
Atomivoimamikroskopialla (AFM) otetut kuvat vahvistivat, että 15 minuutin välein tehdyllä 10 minuutin ultraäänikäsittelyllä muodostetut fibrillit eivät eronneet morfologialtaan fibrilleistä, jotka muodostettiin 10 minuutin välein tehdyllä 1 minuutin ultraäänikäsittelyllä. Tämä korostaa ultraäänellä indusoidun amyloidifibrillien muodostumisen toistettavuutta ja robustisuutta.

AFM-kuvia amyloidifibrilleistä, jotka tuotettiin 1 minuutin ultraäänikäsittelyllä 10 minuutin välein (i), 10 minuutin ultraäänikäsittelyllä 15 minuutin välein (ii) ja siemennysreaktiolla ilman ultraäänikäsittelyä (iii). Valkoinen mittakaavapalkki vastaa 1 μm:ä.
Tutkimus ja kuvat: ©So et al., 2011

Fibrillien muodostuminen neutraaleissa pH-olosuhteissa

Jopa neutraaleissa pH-olosuhteissa fibrillien muodostuminen saavutettiin 1,5 tunnin viiveajan jälkeen, mikä osoittaa ultraäänikäsittelyn alentavan merkittävästi nukleaation ja kasvun energiaestettä. Tämä tukee edelleen hypoteesia, jonka mukaan amyloidifibrillien muodostuminen on ensisijaisesti fysikaalinen reaktio, jota rajoittaa suurelta osin nukleaation energiaeste. Ultraäänikäsittely alentaa tätä estettä tehokkaasti.

Vaikutus amyloidiin liittyvien sairauksien tutkimukseen

Amyloidifibrillien helppo ja luotettava muodostaminen mikrolevyjen ultraäänikäsittelylaitteella UIP400MTP on merkittävää Alzheimerin taudin (AD) sekä muiden amyloidiin liittyvien sairauksien, kuten Parkinsonin taudin, tyypin II diabeteksen ja systeemisten amyloidoosien, tutkimukselle. Alzheimerin taudissa amyloidi-β:n (Aβ) aggregaatio on keskeinen patologinen tunnusmerkki, mutta sen fibrillien muodostumiskinetiikan tutkiminen on edelleen haastavaa tavanomaisten menetelmien pitkien viivevaiheiden ja vaihtelevuuden vuoksi. Ultraäänikäsittelyn aikaansaama fibrillien muodostuminen nopeuttaa nukleaatiota ja varmistaa hyvän toistettavuuden sekä vähäisemmän vaihtelevuuden, mikä on ratkaisevaa mahdollisten estäjien seulonnassa ja amyloidogeenisten mekanismien ymmärtämisessä. Lisäksi laitteen UIP400MTP kyky käsitellä suuria näytemääriä mahdollistaa proteiinien virheellisen laskostumisen ja aggregaation laajamittaisen tutkimisen. Tämä helpottaa sellaisten terapeuttisten aineiden löytämistä, jotka voivat säädellä fibrillien muodostumista ja mahdollisesti hidastaa hermoston rappeutumisen etenemistä.

Tämä tutkimus osoittaa monikuoppalevyjen ultraäänikäsittelylaitteella UIP400MTP tehtävän ultraäänikäsittelyn erittäin tehokkaaksi menetelmäksi amyloidifibrillien muodostumisen nopeuttamiseen. Tämän lähestymistavan keskeisiä etuja ovat:

• Fibrillien muodostumisen viiveajan huomattava lyheneminen.
• Tasainen ultraäänialtistus kaikissa kuopissa, mikä mahdollistaa toistettavan fibrillien muodostumisen.
• Kyky seuloa suuria näytemääriä, minkä ansiosta menetelmä soveltuu proteiinien amyloidogeenisuuden genominlaajuisiin kartoituksiin.

Yhdistämällä ultraäänikäsittelyn ThT-fluoresenssin mittaukseen tämä menetelmä tarjoaa nopean, skaalautuvan ja luotettavan alustan amyloidifibrillien muodostumisen tutkimiseen. Tehokkuutensa ja suurten näytemäärien käsittelymahdollisuuksiensa ansiosta tämä lähestymistapa voi helpottaa amyloidifibrillien vaivatonta synteesiä biofysikaalista ja farmaseuttista tutkimusta varten ja tarjota lupaavan työkalun amyloidiin liittyviin tutkimuksiin ja lääkeseulontaan.