تولید فراصوتی بتاگلوکان‌های شیزوفیلان با خلوص بالا
شیزوفیلان یک β-گلوکان قارچی با خواص تعدیل‌کنندهٔ سیستم ایمنی است. برای دستیابی به اثرات دارویی قوی، شیزوفیلان باید وزن مولکولی پایینی داشته باشد تا فراهمی زیستی بهتری نشان دهد. ثابت شده است که فراصوت‌دهی وزن مولکولی شیزوفیلان را کاهش می‌دهد. فراصوت‌دهی به‌عنوان روشی قابل‌اعتماد و مؤثر، به‌آسانی برای تولید شیزوفیلان با وزن مولکولی پایین قابل‌استفاده است.
قارچ‌های Schizophyllum و استخراج فراصوتی بتاگلوکان
گونه‌های قارچ Schizophyllum در طبیعت، پس از فصل‌های بارانی روی درختان در حال پوسیدن رشد می‌کنند. اندام‌های بارده در فصل خشک پس از آن جمع‌آوری می‌شوند. گونه‌های Schizophyllum سرشار از ترکیبات زیست‌شیمیایی مانند گلوکان‌ها هستند و به همین دلیل، به‌ویژه در کشورهای گرمسیری، به‌عنوان غذا و دارو مصرف می‌شوند. Schizophyllum commune که با نام قارچ تیغه‌شکافته نیز شناخته می‌شود، به‌دلیل خواص تعدیل‌کنندهٔ سیستم ایمنی، ضدقارچی، ضدنئوپلاسمی و ضدویروسی خود، توجه شرکت‌های زیست‌فناوری و داروسازی را جلب کرده است.
پلی‌ساکارید شیزوفیلان که با نام‌های سیزوفیران، سونیفیلان یا سیزوفیلان نیز شناخته می‌شود، β-گلوکان اصلی موجود در قارچ‌های Schizophyllum است؛ این قارچ‌ها منبع β-گلوکان زیست‌فعال و بسیار مؤثر شیزوفیلان هستند.
قارچ‌های Schizophyllum commune در طبیعت روی درختان رشد می‌کنند؛ میسلیوم آن‌ها را می‌توان در محیط مایع تخمیر نیز کشت داد. برای کاربردهای دارویی و آرایشی، شیزوفیلان با وزن مولکولی پایین بسیار مؤثرتر از شیزوفیلان با وزن مولکولی بالا است. علت این امر، فراهمی زیستی و نرخ جذب به‌مراتب بهتر شیزوفیلان با وزن مولکولی پایین است. افزون بر این، شیزوفیلان با وزن مولکولی بالا اغلب در کاربردها مشکل‌ساز است، زیرا محلول‌های آبی آن گرانروی بالایی دارند.
کاهش اندازه با فراصوت، روشی بسیار مؤثر و قابل‌اعتماد برای کاهش وزن مولکولی شیزوفیلان و در نتیجه افزایش کیفیت مولکول β-گلوکان است.
سونیکاتور UIP2000hdT با موفقیت برای کاهش وزن مولکولی شیزوفیلان، یک β-گلوکان قارچی، به کار رفت
پروتکل تولید شیزوفیلان با وزن مولکولی پایین
از آنجا که شیزوفیلان با وزن مولکولی پایین، فراهمی زیستی و ویژگی‌های کاربردی به‌مراتب بهتری نشان می‌دهد، گروه پژوهشی Smirnou فراصوت‌دهی را برای شکستن و کاهش اندازهٔ مولکول β-گلوکان شیزوفیلان بررسی کرد.
فراصوت‌دهی شیزوفیلان
شیزوفیلان β-1.3(1.6)-گلوکان (SPG) با کشت غوطه‌ور قارچ S. commune در زیست‌راکتور و با استفاده از ساکارز به‌عنوان سوبسترا تولید شد.
پس از پایان کشت، محیط مایع کشت با آب املاح‌زدایی‌شده رقیق شد تا غلظت شیزوفیلان به 2 g/L برسد و با دستگاه زیر تحت فراصوت‌دهی قرار گرفت: پردازشگر فراصوتی UIP2000hdT (Hielscher Ultrasonics GmbH، آلمان) در حالت بازگردش، با پارامترها و شرایط زیر: دبی محیط 50 mL/s، فرکانس 20 kHz، توان خروجی 2000 W، سونوتْرود نوع BS2d22، بوستر نوع B2-1.4 و دامنهٔ نوسان 100%. دمای محیط مایع کشت در آغاز فراصوت‌دهی 25°C بود. محیط مایع کشت فراصوت‌دهی‌شده (انرژی ورودی ویژهٔ 100 Ws/mL) با فیلتر عمقی Seitz HS800 تحت فشار 1٫5 bar و در دمای 40°C صاف شد. شیزوفیلان فراصوت‌دهی‌شده (uSPG)، برای تعیین مشخصات شیمیایی، با افزودن مقدار سه‌برابری ایزوپروپیل الکل به مایع صاف‌شده در دمای آزمایشگاه رسوب داده شد و در 60°C به‌مدت 12h خشک شد. محلول‌های uSPG برای مطالعات ایمنی‌شناختی به این صورت تهیه شدند: (1) مایع صاف‌شدهٔ محیط کشت فراصوت‌دهی‌شده با کاست 0٫1m2 مدل Pall Centramate T-series PES (حد برش 100 kDa) در فشار 0٫8 bar دیافیلتراسیون شد و دیافیلتراسیون تا رسیدن رسانایی بخش باقیمانده به 20 μS/cm ادامه یافت؛ (2) محلول با دیافیلتراسیون تا غلظت uSPG برابر با 1 g/L تغلیظ شد و با اتوکلاو در 120°C/20 min استریل شد. uSPG دناتوره‌شده به روشی مشابه تهیه شد، با این تفاوت که NaOH با غلظت 0٫2 M به مایع صاف‌شدهٔ محیط کشت اضافه شد و محلول قلیایی‌شده پیش از دیافیلتراسیون به‌مدت 30 min در دمای آزمایشگاه انکوبه شد.
روش‌های تحلیلی
بازده میسلیوم به روش وزن‌سنجی برآورد شد: محیط مایع کشت با آب به نسبت 1:4 رقیق شد، با شتاب 10٬000 × g در 25°C به‌مدت 20 min سانتریفیوژ شد، رسوب با مقدار سه‌برابری آب شسته شد، در 60°C خشک و سپس توزین شد. شیزوفیلان با افزودن مقدار سه‌برابری ایزوپروپیل الکل از مایع رویی رسوب داده شد، در 60°C به‌مدت 24h خشک شد و بازده آن به روش وزن‌سنجی تعیین شد. pO2 در محیط مایع کشت با پروب نوری Hamilton-Visiferm DO 120 (Hamilton، سوئیس) اندازه‌گیری شد.
گرانروی دینامیکی محیط مایع کشت با HAAKE Visco Tester 6L و اسپیندل‌های 1L و 2L در 4°C و سرعت چرخش 30 rpm اندازه‌گیری شد. سرعت فیلتراسیون از زمان لازم برای صاف‌کردن 500 mL محیط مایع کشت با فیلتر عمقی 200 × 200 mm مدل Seitz HS800 (Pall، ایالات متحده) در فشار 1٫5 bar و دمای 40°C محاسبه شد.
وزن مولکولی uSPG به روش SEC-MALLS روی سامانهٔ HPLC مدل Alliance (Waters) با ستون‌های PL aquagel OH60 و PL aquagel OH40 متصل به‌صورت سری اندازه‌گیری شد، و آشکارساز miniDAWN TREOS (Wyatt) با دیافیلتراسیون تا غلظت uSPG برابر با 1 g/L تغلیظ و با اتوکلاو در 120°C/20 min استریل شد. uSPG دناتوره‌شده به روشی مشابه تهیه شد، با این تفاوت که NaOH با غلظت 0٫2 M به مایع صاف‌شدهٔ محیط کشت اضافه شد و محلول قلیایی‌شده پیش از دیافیلتراسیون به‌مدت 30 min در دمای آزمایشگاه انکوبه شد.
تیمار فراصوتی مستقیماً روی محیط مایع کشت 144-h قارچ S. commune حاوی میسلیوم اعمال شد تا پردازش پایین‌دستی SPG تسهیل شود.
ویژگی‌های شیزوفیلان فراصوت‌دهی‌شده: شیزوفیلان فراصوت‌دهی‌شده (uSPG) با الکل از مایع صاف‌شدهٔ محیط کشت رسوب داده شد و مشخصات آن تعیین شد. SEC-MALLS مقدار Mw برای uSPG را حدود 1 MDa برآورد کرد. میانگین وزن مولکولی شیزوفیلان حاصل از تخمیر مایع تقریباً 5 MDa است، درحالی‌که در کشت حالت جامد ممکن است به 10 MDa برسد. مقایسهٔ وزن مولکولی شیزوفیلان فراصوت‌دهی‌شده با وزن‌های مولکولی شیزوفیلان طبیعی و تیمارنشده، کاهش 5 تا 10 برابری وزن مولکولی بر اثر فراصوت‌دهی را نشان می‌دهد.
پلی‌ساکارید فراصوت‌دهی‌شدهٔ uSPG حاوی 0٫7%w/w پروتئین و 1٫0%w/w باقیمانده پس از سوزاندن بود. بیش از 99% هیدرولیزات uSPG از گلوکز تشکیل شده بود. نتایج تحلیلی نشان می‌دهند که فراصوت‌دهی زنجیرهٔ اصلی β-گلوکان را به‌طور تصادفی می‌شکند، درحالی‌که شاخه‌های جانبی دست‌نخورده باقی می‌مانند؛ به این ترتیب اندازه و وزن مولکولی شیزوفیلان کاهش می‌یابد. مطالعات ایمنی‌شناختی روی uSPG که عملاً عاری از پروتئین و اندوتوکسین بود، نشان دادند که شیزوفیلان فراصوت‌دهی‌شده با Mw پایین، فعالیت بارز تعدیل‌کنندگی سیستم ایمنی دارد.
تصویربرداری AFM (در بالا) و پروفایل توپوگرافی (در پایین) شیزوفیلان طبیعی فراصوت‌دهی‌شده. اندازه‌گیری در حالت نیمه‌تماسی با تفکیک‌پذیری 512 × 512 pxs2. شرایط: پوشش طلا، ثابت فنر 15٫3 N/m، زاویهٔ مخروط نوک <22°.
(تصویر و مطالعه: ©Smirnou et al., 2017)
کاهش گرانروی: فراصوت‌دهی موجب کاهش چشمگیر گرانروی محیط مایع کشت شد. در طول فراصوت‌دهی، گرانروی محیط مایع کشت به‌صورت غیرخطی تغییر کرد: کاهش گرانروی در آغاز فراصوت‌دهی سریع بود، اما سپس کند شد. انرژی ورودی ویژهٔ 100 Ws/mL برای کاهش تقریباً 7 برابری گرانروی محیط مایع کشت کافی بود.
فراصوت‌دهی محیط مایع کشت S.commune که از کشت قارچ در زیست‌راکتور به‌مدت 144h به دست آمد. اثر مدت فراصوت‌دهی (بیان‌شده به‌صورت انرژی ورودی ویژه برحسب Ws/mL) بر سرعت فیلتراسیون عمقی محیط مایع کشت (ستون سیاه) و غلظت شیزوفیلان (SPG) در مایع صاف‌شده (ستون خاکستری). شرایط فراصوت‌دهی: پردازشگر فراصوتی UIP2000hd (20 kHz, 2000W)، سونوتْرود BS2d22، بوستر B2-1.4، دامنهٔ نوسان 100%، دبی 50 mL/s.
(تصویر و مطالعه: ©Smirnou et al., 2017)
بهبود فیلتراسیون: محیط مایع کشت تیمارشده با فراصوت، سریع‌تر از محیط مایع کشت تیمارنشدهٔ حاوی SPG با وزن مولکولی بالا (انرژی ورودی ویژهٔ 0 Ws/mL) از فیلتر عبور کرد. افزون بر این، فراصوت‌دهی اتلاف محصول را در طول فیلتراسیون به‌طور چشمگیری کاهش داد. مایع صاف‌شدهٔ محیط کشت تیمارنشدهٔ حاوی SPG با وزن مولکولی بالا (انرژی ورودی ویژهٔ 0 Ws/mL)، حاوی 0٫3 ± 0٫07 g/L از SPG بود، درحالی‌که غلظت SPG پیش از فیلتراسیون عمقی 2 g/L بود. در مقابل، مایع صاف‌شدهٔ محیط کشت فراصوت‌دهی‌شده با 100 Ws/mL، حاوی SPG با غلظت 2٫2 ± 0٫2 g/L بود که معادل اتلاف تقریباً صفر محصول است.
فراصوت‌دهی محیط مایع کشت S.commune که از کشت قارچ در زیست‌راکتور به‌مدت 144h به دست آمد. اثر مدت فراصوت‌دهی (بیان‌شده به‌صورت انرژی ورودی ویژه برحسب Ws/mL) بر سرعت فیلتراسیون عمقی محیط مایع کشت (ستون سیاه) و غلظت شیزوفیلان (SPG) در مایع صاف‌شده (ستون خاکستری). شرایط فراصوت‌دهی: پردازشگر فراصوتی UIP2000hd (20 kHz, 2000W)، سونوتْرود BS2d22، بوستر B2-1.4، دامنهٔ نوسان 100%، دبی 50 mL/s.
(تصویر و مطالعه: ©Smirnou et al., 2017)
تصویربرداری AFM (در بالا) و پروفایل توپوگرافی (در پایین) شیزوفیلان دناتوره‌شده و فراصوت‌دهی‌شده. اندازه‌گیری در حالت نیمه‌تماسی با تفکیک‌پذیری 512 × 512 pxs2. شرایط: پوشش طلا، ثابت فنر 15٫3 N/m، زاویهٔ مخروط نوک < 22°.
(تصویر و مطالعه: ©Smirnou et al., 2017)
علاوه بر این، پژوهشگران دریافتند که پردازش فراصوتی شیزوفیلان به‌آسانی مقیاس‌پذیر است. یک واحد از دستگاه متلاشی‌کنندهٔ فراصوتی پایلوت UIP2000hdT توانست 1 لیتر محیط مایع کشت را در 110 s در حالت جریانی پردازش کند. ظرفیت تولید سامانه را می‌توان به‌آسانی با اتصال متوالی واحدهای فراصوتی بیشتر افزایش داد.
دربارهٔ افزایش آسان مقیاس استخراج از قارچ بیشتر بخوانید!
تجهیزات فراصوتی با کارایی بالا برای پردازش گلوکان‌های قارچی
قطعه‌قطعه‌کردن پلی‌ساکاریدهایی مانند گلوکان‌ها و نیز سایر ترکیبات زیست‌فعال مانند کیتین و کیتوسان را می‌توان با تجهیزات فراصوتی با کارایی بالای Hielscher به‌طور قابل‌اعتماد انجام داد. سونیکاتورهای ما می‌توانند دامنه‌های نوسان بالا ایجاد کنند، امکان کنترل دقیق پارامترهای فرایند را فراهم می‌کنند و قابلیت کارکرد 24/7 تحت بار سنگین و در محیط‌های سخت را دارند. مجموعهٔ تجهیزات Hielscher Ultrasonics این الزامات را به‌طور قابل‌اعتماد برآورده می‌کند. سونیکاتورهای Hielscher، علاوه بر عملکرد فراصوتی برجسته، بازده انرژی بالایی دارند که مزیت اقتصادی قابل‌توجهی است – به‌ویژه هنگام استفاده در تولید تجاری در مقیاس بزرگ.
سونیکاتورهای Hielscher سامانه‌هایی با کارایی بالا هستند که می‌توان آن‌ها را به لوازم جانبی مانند سونوتْرودها، بوسترها، راکتورها یا سلول‌های جریان مجهز کرد تا به بهترین شکل با نیازهای فرایند شما سازگار شوند. نمایشگر رنگی دیجیتال، امکان پیش‌تنظیم دوره‌های فراصوت‌دهی، ثبت خودکار داده‌ها روی کارت SD تعبیه‌شده، کنترل از راه دور از طریق مرورگر و بسیاری ویژگی‌های دیگر، بالاترین سطح کنترل فرایند و سهولت کاربری را تضمین می‌کنند. سامانه‌های فراصوتی Hielscher با برخورداری از استحکام و توان تحمل بار سنگین، تجهیزات قابل‌اتکای شما برای کار مداوم در تولید هستند. کاهش وزن مولکولی β-گلوکان‌هایی مانند شیزوفیلان به فراصوت قدرتمند نیاز دارد تا شکست هدفمند مولکول و محصول نهایی شیزوفیلان با کیفیت بالا حاصل شود که بتوان آن را در کاربردهای دارویی به کار برد.
اطلاعات بیشتر دربارهٔ استخراج فراصوتی بتاگلوکان از قارچ‌ها، همراه با دستورالعمل‌های گام‌به‌گام را اینجا بیابید!
جدول زیر نمایی از ظرفیت تقریبی پردازش سونیکاتورهای ما ارائه می‌دهد:
| حجم بچ | دبی | دستگاه‌های پیشنهادی |
|---|---|---|
| 1 تا 500mL | 10 تا 200mL/min | UP100H |
| 10 تا 2000mL | 20 تا 400mL/min | UP200Ht, UP400St |
| 0٫1 تا 20L | 0٫2 تا 4L/min | UIP2000hdT |
| 10 تا 100L | 2 تا 10L/min | UIP4000hdT |
| قابل‌اعمال نیست | 10 تا 100L/min | UIP16000 |
| قابل‌اعمال نیست | بیشتر | مجموعه‌ای از دستگاه‌های UIP16000 |
با ما تماس بگیرید! / از ما بپرسید!
Hielscher Ultrasonics هموژنایزرهای فراصوتی با کارایی بالا را برای کاربردهای اختلاط، پراکنده‌سازی، امولسیون‌سازی و استخراج در مقیاس آزمایشگاهی، پایلوت و صنعتی تولید می‌کند.
منابع علمی / مراجع
- Smirnou, Dzianis; Knotek, Petr; Nesporova, Kristina; Smejkalova, Daniela; Pavlik, Vojtech; Franke, Lukas; Velebny, Vladimir (2017): Ultrasound-assisted production of highly-purified β-glucan schizophyllan and characterization of its immune properties. Process Biochemistry 2017.
- Zhong, Kui; Tong, Litao; Liu, Liya; Zhou, Xianrong; Liu, Xingxun; Zhang, Qi; Zhou, Sumei (2015): Immunoregulatory and antitumor activity of schizophyllan under ultrasonic treatment. International Journal of Biological Macromolecules, 80, 2015. 302–308.
- Kengo Tabata, Wataru Ito, Takemasa Kojima, Shozo Kawabata, Akira Misaki (1981): Ultrasonic degradation of schizophyllan, an antitumor polysaccharide produced by Schizophyllum commune fries. Carbohydrate Research, Volume 89, Issue 1, 1981. 121-135.
دانستنی‌های مفید
شیزوفیلان – یک β-گلوکان قارچی
شیزوفیلان که با نام‌های سیزوفیران، SPG، سونیفیلان و سیزوفیلان نیز شناخته می‌شود، یک پلی‌ساکارید برون‌سلولی خنثی است که توسط قارچ Schizophyllum commune Fries، از قارچ‌های Basidiomycetes، تولید می‌شود. شیزوفیلان یک بتا-D-گلوکان محلول است که سازوکار دقیق عملکرد آن هنوز کاملاً روشن نشده است، اما این β-گلوکان خاص، اثرات تعدیل‌کنندهٔ سیستم ایمنی و ضدتوموری دارد. هرچند سازوکار دقیق عملکرد سیزوفیران هنوز به‌طور کامل روشن نشده است، به نظر می‌رسد این ماده با افزایش تولید سیتوکین، فعال‌کردن ماکروفاژها و سلول‌های لانگرهانس و تقویت فعالیت لکوسیت‌های چندشکلی‌هسته‌ای (PML) و سلول‌های کشندهٔ طبیعی (NK)، سیستم ایمنی را تحریک می‌کند. مشخص شد که سیزوفیران در برابر سرطان معده چندان مؤثر نیست، اما مدت بقای بیماران مبتلا به سرطان سر و گردن را افزایش می‌دهد. در سرطان دهانهٔ رحم، سیزوفیران بقا و زمان تا عود را در موارد مرحلهٔ II افزایش داد، اما در مرحلهٔ III چنین اثری نداشت؛ همچنین تزریق مستقیم آن به تودهٔ تومور اثربخشی بیشتری نشان داد. سونیفیلان در ژاپن به‌عنوان تعدیل‌کنندهٔ پاسخ زیستی (BRM) همراه با پرتودرمانی برای درمان سرطان استفاده می‌شود. این دارو در 1998 برای سرطان دهانهٔ رحم در کرهٔ جنوبی عرضه شد.
Hielscher Ultrasonics هموژنایزرهای فراصوتی با کارایی بالا را در مقیاس‌های آزمایشگاهی تا صنعتی تولید می‌کند.