فراصوت برای لیز سلولی: اختلال و استخراج سلول
لیز سلول اولتراسونیک یک روش آماده سازی نمونه به طور گسترده ای در آزمایشگاه های بیوتکنولوژی مدرن است. هدف اصلی آن مختل کردن غشای سلولی یا کل سلول ها به منظور آزاد کردن اجزای داخل سلولی مانند پروتئین ها، اسیدهای نوکلئیک یا اندامک ها است. در کار آزمایشگاهی روزانه این بدان معنی است که فراصوت یک روش استاندارد برای اختلال سلول کنترل شده و استخراج کارآمد از مولکول های زیستی است. مزیت کلیدی فراصوت ها در توانایی آنها در تعدیل دقیق پارامترهای فرآیند بحرانی، از جمله شدت اولتراسوند، ضربان و کنترل دما نهفته است. این کنترل به محققان اجازه می دهد تا به لیز قابل اعتماد دست یابند و در عین حال آسیب حرارتی یا مکانیکی به مولکول های زیستی حساس را به حداقل برسانند و در نتیجه یک فرآیند استخراج ملایم و در عین حال بسیار کارآمد ایجاد شود.
لیز سلولی با استفاده از Sonicators
لیز سلول اولتراسونیک با استفاده از حفره صوتی به مختل کردن غشای سلولی و انتشار مولکول های داخل سلولی. Hielscher مافوق صوت ارائه می دهد کلاسیک پروب نوع فراصوت و همچنین چند نمونه فراصوت برای پردازش استریل: VialTweeter برای لوله های متعدد و ویال و 96 - چاه صفحه سونیکاتور UIP400MTP برای microplates استاندارد.
Hielscher مافوق صوت تامین فراصوت قدرتمند غیر تماسی برای آماده سازی نمونه و تجزیه و تحلیل بالینی. سونیکاتور صفحه چند چاه UIP400MTP، ویال توییتر، CupHorn و فراصوت جریان GDmini2 نمونه ها را در شرایط استریل پردازش کنید.
هموژنایزرهای التراسونیک UP100H (100 وات) و UP400St (400 وات): فراصوت برای لیز و استخراج سلول.
هموژنایزرهای التراسونیک برای لیز سلول و استخراج
| نوع دستگاه اولتراسونیک | تمرکز برنامه | حجم نمونه | مورد استفاده معمولی | مزایای | مدل های نمونه |
|---|---|---|---|---|---|
| سونیکاتورهای نوع پروب | فراصوت تک نمونه | 0.1 میلی لیتر تا ~ 1000 میلی لیتر | لیز سلولی، استخراج پروتئین، تکه تکه شدن DNA/RNA | کنترل دقیق انرژی؛ سونوترودهای مختلف؛ بهینه برای نمونه های کوچک تا متوسط | UP100H، 200 خیابان، UP400St |
| VialTweeter / CupHorn | پردازش موازی چندین ویال مهر و موم شده | 8-10 ویال (~ 1-20 میلی لیتر هر کدام) | لیز استاندارد سوسپانسیون های چند سلولی | فراصوت یکنواخت؛ از آلودگی متقابل جلوگیری می کند. نتایج قابل تکرار | VialTweeter(ویال گروهی)، کاپ هورن |
| 96-چاه صفحه Sonicator | فراصوت صفحات مولتی ول و میکروتیتر | فرمت میکروپلیت | غربالگری با توان عملیاتی بالا، پروتئومیکس، سنجش سلولی | همزمان ، حتی فراصوت در چاه ها. ایده آل برای گردش کار چند نمونه ای | UIP400MTP |
| راکتورهای سلول جریان | فراصوت مداوم برای حجم بالاتر | >1 لیتر، مقیاس پذیر | اختلال سلولی در مقیاس صنعتی، تولید عصاره | پردازش مداوم؛ Scalable; کنترل کامل فرآیند (دامنه، فشار، دما) | UIP1000hdT، UIP2000hdT + سلول جریان |
| سیستم های فراصوت استریل / غیر مستقیم | پردازش نمونه بدون آلودگی | ویال / لوله / میکروپلیت وابسته است | نمونه های حساس، محیط های استریل، تنظیمات نظارتی | بدون تماس کاوشگر؛ از حمل و نقل جلوگیری می کند. حداقل تلاش برای تمیز کردن | VialTweeter(ویال گروهی)، کاپ هورن، UIP400MTP |
مزایای استفاده از فراصوت برای لیز سلول
در مقایسه با سایر روش های لیز و استخراج سلولی، لیز سلول اولتراسونیک دارای چندین مزیت است:
- سرعت: لیز سلول التراسونیک و استخراج یک روش سریع است که می تواند سلول های باز را در یک ماده از ثانیه شکستن است. این بسیار سریعتر از روش های دیگر مانند همگن سازی، انجماد ذوب یا آسیاب مهره ای است.
- بهره وری: لیز سلول اولتراسونیک و استخراج را می توان مورد استفاده قرار گیرد برای درمان نمونه های کوچک، بزرگ و یا چند در یک بار، و آن را کارآمدتر از روش های دیگر است که نیاز به پردازش فردی از نمونه های کوچک.
- بدون مواد شیمیاییلیز و استخراج سلول های اولتراسونیک یک روش غیر تهاجمی است که نیازی به استفاده از مواد شیمیایی یا آنزیم های خشن ندارد.: این امر آن را برای کاربردهایی که یکپارچگی محتویات سلول باید حفظ شود ایده آل می کند. می توان از آلودگی ناخواسته نمونه ها جلوگیری کرد.
- بازده بالا: لیز سلول مافوق صوت و استخراج می تواند بازده بالایی از محتویات سلولی از جمله DNA، RNA و پروتئین ها را استخراج کند. این به این دلیل است که امواج صوتی با فرکانس بالا دیواره های سلولی را باز می کنند و محتویات را در محلول اطراف آزاد می کنند.
- کنترل دما: مافوق صوت پیچیده اجازه می دهد برای کنترل دقیق دما از نمونه. Hielscher فراصوت های دیجیتال با یک سنسور درجه حرارت قابل اتصال و نرم افزار نظارت بر دما مجهز.
- قابل تکرار: پروتکل های لیز سلول اولتراسونیک را می توان به راحتی تکثیر و حتی به حجم نمونه های مختلف بزرگتر یا کوچکتر با یک مقیاس خطی ساده مطابقت داد.
- همه کاره: لیز سلول التراسونیک و استخراج را می توان مورد استفاده قرار گیرد برای استخراج طیف گسترده ای از انواع سلول، از جمله باکتری ها، مخمرها، قارچ ها، سلول های گیاهی و پستانداران. همچنین می توان از آن برای استخراج انواع مختلف مولکول ها از جمله پروتئین ها، DNA، RNA و لیپیدها استفاده کرد.
- تهیه همزمان نمونه های متعدد: Hielscher مافوق صوت ارائه می دهد راه حل های متعددی به راحتی پردازش نمونه های متعدد تحت شرایط فرآیند دقیقا همان. این امر باعث می شود مرحله آماده سازی نمونه لیز و استخراج بسیار کارآمد و صرفه جویی در زمان باشد.
- آسان برای استفاده: تجهیزات لیز و استخراج سلول های اولتراسونیک آسان برای استفاده است و نیاز به حداقل آموزش دارد. این تجهیزات همچنین مقرون به صرفه هستند زیرا یک سرمایه گذاری واحد و بدون نیاز به خرید مجدد دفع است. این امر آن را برای طیف گسترده ای از محققان و آزمایشگاه ها جذاب می کند.
به طور کلی، لیز سلول اولتراسونیک و استخراج یک روش سریع، کارآمد، دقیق قابل کنترل و همه کاره برای استخراج محتویات سلولی است. مزایای آن نسبت به روش های جایگزین، آن را به گزینه ای جذاب برای طیف گسترده ای از کاربردهای تحقیقاتی و صنعتی تبدیل کرده است.
اصل کار لیز سلول اولتراسونیک
لیز و استخراج سلول های اولتراسونیک با استفاده از امواج صوتی با فرکانس بالا برای مختل کردن سلول ها و استخراج محتویات آنها. امواج صوتی باعث ایجاد تغییرات فشار در مایع اطراف می شوند و باعث ایجاد حباب های کوچک و فروپاشی در فرآیندی به نام کاویتاسیون می شوند. این حباب ها نیروهای مکانیکی بسیار شدید موضعی ایجاد می کنند که می توانند سلول های باز را بشکنند و محتویات آنها را در محلول اطراف آزاد کنند.
لیز سلول با استفاده از یک اولتراسونیک معمولا شامل مراحل زیر است:
- نمونه در یک لوله یا ظرف با بافر مایع قرار می گیرد.
- یک پروب اولتراسونیک وارد نمونه می شود و امواج صوتی با فرکانس بالا با حدود 20-30 کیلوهرتز اعمال می شود.
- امواج اولتراسوند باعث نوسان و کاویتاسیون در مایع اطراف می شوند و نیروهای موضعی ایجاد می کنند که سلول های باز را می شکنند و محتویات آنها را آزاد می کنند.
- نمونه برای حذف هر گونه زباله سلولی سانتریفیوژ یا فیلتر می شود و محتویات استخراج شده برای تجزیه و تحلیل پایین دست جمع آوری می شود.
معایب روش های رایج لیز
در طول کار خود در آزمایشگاه ها، ممکن است قبلا دردسر لیز سلول را با استفاده از پروتکل های سنتی مکانیکی یا شیمیایی تجربه کرده باشید.
- لیز مکانیکی: روش های لیز مکانیکی، مانند سنگ زنی با ملات و گلدان یا همگن سازی با استفاده از فرنچ پرس، آسیاب مهره یا سیستم روتور-استاتور اغلب فاقد گزینه های کنترل و تنظیم دقیق هستند. این بدان معناست که استفاده از فرز و آسیاب می تواند به سرعت نیروهای گرما و برشی ایجاد کند که می تواند به نمونه آسیب برساند و پروتئین ها را دناتوره کند. آنها همچنین می توانند زمان بر باشند و به مقادیر زیادی مواد اولیه نیاز دارند.
- لیز شیمیایی: روش های لیز شیمیایی، مانند لیز مبتنی بر شوینده، می توانند با مختل کردن دولایه لیپیدی و دناتوره کردن پروتئین ها، به نمونه آسیب برسانند. آنها همچنین می توانند به چندین مرحله نیاز داشته باشند و ممکن است آلاینده های باقیمانده ای را به جا بگذارند که با کاربردهای پایین دست تداخل دارند. یافتن دوز بهینه مواد شوینده یک چالش اضافی است.
- چرخه های انجماد و ذوب شدن: چرخه های انجماد و ذوب می تواند باعث پارگی غشای سلولی شود، اما چرخه های مکرر نیز می توانند باعث دناتوره شدن و تخریب پروتئین شوند. این روش همچنین می تواند به چندین چرخه نیاز داشته باشد که می تواند زمان بر باشد و اغلب منجر به بازده کمتر می شود.
- لیز آنزیمی: روش های لیز آنزیمی می توانند مختص انواع سلول های خاصی باشند و به چندین مرحله نیاز دارند که باعث می شود زمان بر باشند. آنها همچنین زباله تولید می کنند و برای جلوگیری از تخریب نمونه نیاز به بهینه سازی دقیق دارند. کیت های لیز آنزیمی اغلب گران هستند. اگر روش لیز آنزیمی فعلی خود را می دهد نتایج ناکافی ، فراصوت به عنوان روش هم افزایی می تواند برای تشدید اختلال سلولی اعمال می شود.
بر خلاف روش های معمولی مکانیکی و شیمیایی لیز سلول، فراصوت یک ابزار بسیار کارآمد و قابل اعتماد برای تجزیه سلول است که اجازه می دهد تا برای کنترل کامل بر پارامترهای فراصوت است. این امر انتخاب پذیری بالایی را در انتشار مواد و خلوص محصول تضمین می کند. [رجوع کنید به بالاسوندارام و همکاران، 2009]
برای انواع سلول ها مناسب است و به راحتی در مقیاس کوچک و بزرگ قابل استفاده است – همیشه تحت شرایط کنترل شده. اولتراسونیک ها به راحتی تمیز می شوند. یک هموژنایزر اولتراسونیک همیشه دارای عملکرد تمیز کردن در محل (CIP) و استریل کردن در محل (SIP) است. sonotrode شامل یک شاخ تیتانیوم عظیم است که می تواند پاک و یا در آب و یا حلال شستشو (بسته به محیط کار). تعمیر و نگهداری از ultrasonicators است با توجه به استحکام خود را تقریبا نادیده گرفته.
لیز اولتراسونیک و اختلال سلول
به طور کلی، لیز نمونه ها در آزمایشگاه بین 15 ثانیه تا 2 دقیقه طول می کشد. از آنجا که شدت فراصوت بسیار آسان است برای تنظیم دامنه تنظیم زمان فراصوت و همچنین با انتخاب تجهیزات مناسب ، ممکن است برای مختل کردن غشای سلولی بسیار به آرامی یا بسیار ناگهانی ، بسته به ساختار سلول و هدف از لیز (به عنوان مثال استخراج DNA نیاز به فراصوت نرم تر ، استخراج کامل پروتئین از باکتری ها نیاز به درمان سونوگرافی شدید تر). دما در طول فرایند را می توان توسط یک سنسور دما یکپارچه کنترل و می توان به راحتی توسط خنک کننده کنترل (حمام یخ و یا سلول های جریان با کت خنک کننده) و یا توسط فراصوت در حالت پالسی. در طول فراصوت حالت پالس ، چرخه های کوتاه فراصوت پشت سر هم از مدت زمان 1-15 ثانیه اجازه می دهد تا برای اتلاف گرما و خنک کننده در طول دوره های متناوب طولانی تر.
تمام فرآیندهای مبتنی بر سونوگرافی کاملا قابل تکرار و مقیاس پذیری خطی هستند.
ویال توییتر یک هموژنایزر اولتراسونیک برای آماده سازی همزمان ، یکنواخت و سریع استریل نمونه های متعدد است.
- آماده سازی سوسپانسیون سلولی: گلوله های سلولی باید با همگن سازی کاملا در محلول بافر معلق شوند (محلول بافر خود را انتخاب کنید که با تجزیه و تحلیل زیر سازگار باشد، به عنوان مثال روش کروماتوگرافی خاص). در صورت نیاز لیزوزیم ها و / یا سایر مواد افزودنی را اضافه کنید (آنها همچنین باید با وسایل جداسازی / تصفیه سازگار باشند). مخلوط / همگن راه حل به آرامی تحت فراصوت خفیف تا زمانی که تعلیق کامل به دست آورد.
بیشتر درباره هم افزایی های لیزوزیم ها همراه با سونیک کردن بخوانید! - لیز اولتراسونیک: نمونه را در حمام یخ قرار دهید. برای اختلال سلول, فراصوت تعلیق در 60-90 انفجار ثانیه (با استفاده از حالت پالس از سونیکاتور خود را).
- جداسازی: سانتریفیوژ لیزات (به عنوان مثال 10 دقیقه در 10000 x گرم ؛ در 4 درجه سانتیگراد). مایع رویی را با دقت از پلت سلول جدا کنید. مایع رویی کل لیز سلول است. پس از فیلتراسیون مایع رویی، مایع شفاف شده ای از پروتئین سلول محلول به دست می آورید.
رایج ترین برنامه های کاربردی برای ultrasonicators در زیست شناسی و بیوتکنولوژی عبارتند از:
- آماده سازی عصاره سلولی
- اختلال در مخمر، باکتری ها، سلول های گیاهی، بافت سلول های نرم یا سخت، مواد هسته ای
- استخراج پروتئین
- تهیه و جداسازی آنزیم ها
- تولید آنتی ژن ها
- استخراج DNA و/یا تکه تکه شدن هدفمند
- آماده سازی لیپوزوم
اختلال سلولی با اولتراسونیک نوع پروب یک روش آماده سازی نمونه کارآمد است.
کاربردهای متعدد سونوگرافی در بخش های بیوتکنولوژی، مهندسی زیستی، میکروبیولوژی، زیست شناسی مولکولی، بیوشیمی، ایمونولوژی، باکتری شناسی، ویروس شناسی، پروتئومیکس، ژنتیک، فیزیولوژی، زیست شناسی سلولی، هماتولوژی و گیاه شناسی منشعب می شود.
لیز: شکستن ساختارهای سلولی
سلول ها توسط یک غشای پلاسمایی نیمه تراوا محافظت می شوند که از یک لایه دولایه فسفو-لیپیدی (همچنین دو لایه پروتئین-لیپیدی تشکیل شده است؛ که توسط لیپیدهای آبگریز و مولکول های فسفر آب دوست با مولکول های پروتئینی تعبیه شده تشکیل شده است) و مانعی بین داخل سلول (سیتوپلاسم) و محیط خارج سلول ایجاد می کند. سلولهای گیاهی و سلولهای پروکاریوتی توسط دیواره سلولی احاطه شده اند. به دلیل دیواره سلولی ضخیم چند لایه سلولز، لیز سلول های گیاهی سخت تر از سلول های حیوانی است. فضای داخلی سلول ، مانند اندامک ها ، هسته ، میتوکندری ، توسط اسکلت سلولی تثبیت می شود.
با لیز کردن سلول ها ، هدف آن استخراج و جداسازی اندامک ها ، پروتئین ها ، DNA ، mRNA یا سایر مولکول های زیستی است.
روش های متداول لیز سلولی و معایب آنها
روش های مختلفی برای لیز کردن سلول ها وجود دارد که می توان آنها را به روش های مکانیکی و شیمیایی تقسیم کرد که شامل استفاده از مواد شوینده یا حلال ، استفاده از فشار بالا یا استفاده از آسیاب مهره یا فرنچ پرس است. مشکل سازترین عیب این روش ها، کنترل و تنظیم دشوار پارامترهای فرآیند و در نتیجه تأثیر آن است.
جدول زیر معایب اصلی روش های رایج لیز را نشان می دهد:
جدول: روش های مرسوم لیز سلولی دارای معایب عمده ای هستند
روش لیز
لیز یک فرآیند حساس است. در طول لیز محافظت از غشای سلولی از بین می رود ، با این حال باید از غیرفعال شدن ، دناتوره شدن و تخریب پروتئین های استخراج شده توسط یک محیط غیر فیزیولوژیکی (انحراف از مقدار pH) جلوگیری شود. بنابراین ، به طور کلی لیز در محلول بافر انجام می شود. بیشتر مشکلات ناشی از اختلال کنترل نشده سلولی است که منجر به آزاد شدن غیرهدفمند تمام مواد داخل سلولی یا دناتوره شدن محصول هدف می شود.
سوالات متداول در مورد فراصوت و لیز سلولی
- آیا می توانید سلول ها را با فراصوت لیز کنید؟ بله، فراصوت به طور موثر سلول ها را با استفاده از امواج مافوق صوت با فرکانس بالا که باعث حفره می شود، لیز می کند، پدیده ای که در آن حباب های بخار کوچک تشکیل می شوند و به شدت در داخل سوسپانسیون سلول فرو می ریزند. نیروهای مکانیکی حاصل غشای سلولی را مختل می کند و آزاد شدن اجزای داخل سلولی را در مایع تسهیل می کند.
- چگونه از سونیکاتور برای لیز سلول استفاده کنیم؟ استفاده از یک فراصوت برای لیز سلولی شامل غوطه ور کردن پروب ماسونیکاتور در یک سوسپانسیون سلولی و تنظیم پارامترهایی مانند دامنه و مدت زمان نبض است. این فرآیند باید به دقت تحت نظارت قرار گیرد تا اختلال سلولی را بهینه کند و در عین حال دناتوره شدن پروتئین و غیرفعال شدن آنزیم را به حداقل برساند.
- اصل فراصوت برای لیز سلول چیست؟ فراصوت بر اساس اصل کاویتاسیون صوتی عمل می کند. انرژی اولتراسونیک به محیط مایع منتقل می شود و باعث نوسانات سریع فشار می شود که منجر به تشکیل و انفجار میکروحباب ها می شود. این انفجارها نیروهای برشی شدید و دمای بالا موضعی ایجاد می کنند و ساختارهای سلولی را مختل می کنند و همگنی لیزات را افزایش می دهند.
- فراصوت لیز سلولی چقدر طول می کشد؟ مدت زمان فراصوت برای لیز سلول بسته به عواملی مانند نوع سلول، تراکم سلول، قدرت فراصوت و پروتکل خاص مورد استفاده می تواند به طور قابل توجهی متفاوت باشد. روش های معمولی ممکن است از چند ثانیه تا چند دقیقه متغیر باشد که اغلب در چرخه هایی برای مدیریت تولید گرما و اطمینان از اختلال سلولی یکنواخت انجام می شود.
- هدف از فراصوت در استخراج پروتئین چیست؟ در استخراج پروتئین، فراصوت در خدمت به طور موثر پارگی غشای سلولی و حل کننده پروتئین ها. این روش به ویژه برای آزاد کردن پروتئین ها از داخل محفظه های سلولی مفید است و برای تهیه لیزات هایی که پروتئین ها باید از آن خالص یا تجزیه و تحلیل شوند ضروری است.
- چرا فراصوت برای استخراج استفاده می شود؟ فراصوت برای استخراج به دلیل عملکرد سریع و توانایی آن در اعمال انرژی هدفمند، شکستن ساختارهای سلولی برای آزاد کردن مولکول های فعال زیستی بدون استفاده از درمان های شیمیایی خشن، در نتیجه حفظ یکپارچگی عملکردی ترکیبات استخراج شده مورد علاقه است.
- آیا فراصوت فعل و انفعالات پروتئین و پروتئین را مختل می کند؟ در حالی که فراصوت می تواند به طور موثر غشای سلولی مختل, آن را نیز ممکن است فعل و انفعالات پروتئین پروتئین. سطح اختلال بستگی به شدت فراصوت و مدت زمان قرار گرفتن در معرض, به طور بالقوه منجر به دناتوره شدن و یا تفکیک مجتمع های پروتئینی, که ممکن است مطالعات تحلیلی و یا عملکردی بعدی را تحت تاثیر قرار.
- آیا می توان از فراصوت برای لیز E. coli استفاده کرد؟ فراصوت Hielscher به ویژه برای لیز سلول های باکتریایی مانند E. کلی, که دیواره های سلولی قوی. این تکنیک یک روش فیزیکی برای برش دیواره و غشای سلولی ارائه می دهد و آن را به روشی ترجیحی برای تهیه لیزات باکتریایی در آزمایشگاه های زیست شناسی مولکولی و بیوشیمی تبدیل می کند.
- فرآیندهای بعدی پس از مرحله فراصوت چیست؟
مراحل پایین دست پس از لیز اولتراسونیک به طور معمول شامل کسری از لیزات, انزوا هدفمند اندامک, و استخراج پروتئین بیشتر و یا تصفیه.
سپس لیزات پردازش شده جدا شده و برای کاربردهای تحلیلی یا عملکردی مانند پروتئومیکس با وضوح بالا، رونویسی یا مطالعات اتصال گیرنده آماده می شود.
ادبیات/منابع
- Balasundaram, B.; Harrison, S.; Bracewell, D. G. (2009): Advances in product release strategies and impact on bioprocess design. Trends in Biotechnology 27/8, 2009. pp. 477-485.
- Vilkhu, K.; Manasseh, R.; Mawson, R.; Ashokkumar, M. (2011): Ultrasonic Recovery and Modification of Food ingredients. In: Feng/ Barbosa-Cánovas/ Weiss (2011): Ultrasound Technologies for Food and Bioprocessing. New York: Springer, 2011. pp. 345-368.
- Nico Böhmer, Andreas Dautel, Thomas Eisele, Lutz Fischer (2012): Recombinant expression, purification and characterisation of the native glutamate racemase from Lactobacillus plantarum NC8. Protein Expr Purif. 2013 Mar;88(1):54-60.
- Brandy Verhalen, Stefan Ernst, Michael Börsch, Stephan Wilkens (2012): Dynamic Ligand-induced Conformational Rearrangements in P-glycoprotein as Probed by Fluorescence Resonance Energy Transfer Spectroscopy. J Biol Chem. 2012 Jan 6;287(2): 1112-27.
- Claudia Lindemann, Nataliya Lupilova, Alexandra Müller, Bettina Warscheid, Helmut E. Meyer, Katja Kuhlmann, Martin Eisenacher, Lars I. Leichert (2013): Redox Proteomics Uncovers Peroxynitrite-Sensitive Proteins that Help Escherichia coli to Overcome Nitrosative Stress. J Biol Chem. 2013 Jul 5; 288(27): 19698–19714.
- Elahe Motevaseli, Mahdieh Shirzad, Seyed Mohammad Akrami, Azam-Sadat Mousavi, Akbar Mirsalehian, Mohammad Hossein Modarressi (2013): Normal and tumour cervical cells respond differently to vaginal lactobacilli, independent of pH and lactate. ed Microbiol. 2013 Jul; 62(Pt 7):1065-1072.