تولید کیتین و کیتوسان از قارچ‌ها

فراصوت‌دهی روشی بسیار کارآمد برای آزادسازی کیتین و کیتوسان از منابع قارچی، مانند قارچ‌های کلاهک‌دار، است. برای دستیابی به زیست‌پلیمری با کیفیت بالا، کیتین و کیتوسان باید در مراحل فرآوری پایین‌دستی تحت پلیمریزاسیون‌زدایی و استیل‌زدایی قرار گیرند. پلیمریزاسیون‌زدایی و استیل‌زدایی به کمک فراصوت، روشی بسیار مؤثر، ساده و سریع است که به تولید کیتوسان‌هایی با کیفیت بالا، وزن مولکولی زیاد و فراهمی زیستی برتر می‌انجامد.

کیتین و کیتوسان حاصل از قارچ‌ها به روش فراصوت‌دهی

قارچ‌های خوراکی و دارویی مانند Lentinus edodes (شیتاکه)، Ganoderma lucidum (لینگ‌ژی یا ریشی)، Inonotus obliquus (چاگا)، Agaricus bisporus (قارچ دکمه‌ای)، Hericium erinaceus (یال شیر)، Cordyceps sinensis (قارچ کرم ابریشم)، Grifola frondosa (مرغ جنگل)، Trametes versicolor (Coriolus versicolor، Polyporus versicolor، دم بوقلمون) و بسیاری از گونه‌های قارچی دیگر به‌طور گسترده به‌عنوان غذا و برای استخراج ترکیبات زیست‌فعال استفاده می‌شوند. از این قارچ‌ها و همچنین بقایای فرآوری آن‌ها (ضایعات قارچ) می‌توان برای تولید کیتوسان استفاده کرد. فراصوت‌دهی نه‌تنها آزادسازی کیتین از ساختار دیوارهٔ سلولی قارچ را تسهیل می‌کند، بلکه از طریق پلیمریزاسیون‌زدایی و استیل‌زدایی به کمک فراصوت، تبدیل کیتین به کیتوسان ارزشمند را نیز پیش می‌برد.

فراصوت‌دهی، پلیمریزاسیون‌زدایی و استیل‌زدایی کیتین برای تبدیل آن به کیتوسان را تسهیل می‌کند

فراصوت‌دهی شدید با استفاده از سامانهٔ فراصوتی پروبی، روشی برای تسهیل پلیمریزاسیون‌زدایی و استیل‌زدایی کیتین است که به تشکیل کیتوسان می‌انجامد. کیتین پلی‌ساکاریدی طبیعی است که در اسکلت خارجی سخت‌پوستان و حشرات و نیز در دیوارهٔ سلولی برخی قارچ‌ها یافت می‌شود. کیتوسان با حذف گروه‌های استیل از مولکول کیتین به دست می‌آید.

فرایند فراصوتی تبدیل کیتین قارچی به کیتوسان

هنگامی که برای تولید کیتوسان از کیتین از فراصوت‌دهی شدید استفاده می‌شود، سوسپانسیون کیتین تحت تابش امواج فراصوت با شدت بالا و فرکانس پایین، معمولاً در محدودهٔ 20 kHz تا 30 kHz، قرار می‌گیرد. این فرایند کاویتاسیون آکوستیکی شدیدی ایجاد می‌کند؛ کاویتاسیون به تشکیل، رشد و فروپاشی حباب‌های خلأ میکروسکوپی در مایع گفته می‌شود. کاویتاسیون در مایع پیرامون حباب‌ها، به‌صورت موضعی نیروهای برشی بسیار شدید، دماهای بالا (تا چندین هزار درجهٔ سلسیوس) و فشارهای بالا (تا چندین صد اتمسفر) ایجاد می‌کند. این شرایط شدید به تجزیهٔ پلیمر کیتین و استیل‌زدایی پس از آن کمک می‌کند.
 

تصاویر SEM از کیتین‌ها و کیتوسان‌های دو گونهٔ قارچ: a) کیتین حاصل از L. vellereus؛ b) کیتین حاصل از P. ribis؛ c) کیتوسان حاصل از L.vellereus؛ d) کیتوسان حاصل از P. ribis.
تصویر و پژوهش: © Erdoğan et al., 2017

پلیمریزاسیون‌زدایی فراصوتی کیتین

پلیمریزاسیون‌زدایی کیتین از طریق اثرات ترکیبی نیروهای مکانیکی، مانند ریزجریان‌ها و جت‌های مایع، و همچنین واکنش‌های شیمیایی آغازشده با فراصوت رخ می‌دهد؛ این واکنش‌ها به‌واسطهٔ رادیکال‌های آزاد و دیگر گونه‌های واکنش‌پذیر تشکیل‌شده طی کاویتاسیون القا می‌شوند. امواج پرفشار ایجادشده طی کاویتاسیون، زنجیره‌های کیتین را در معرض تنش برشی قرار می‌دهند و موجب شکستن پلیمر به قطعات کوچک‌تر می‌شوند.

استیل‌زدایی فراصوتی کیتین

فراصوت‌دهی شدید علاوه بر پلیمریزاسیون‌زدایی، استیل‌زدایی کیتین را نیز تسهیل می‌کند. استیل‌زدایی شامل حذف گروه‌های استیل از مولکول کیتین است که به تشکیل کیتوسان می‌انجامد. انرژی شدید فراصوت، به‌ویژه دماها و فشارهای بالای ایجادشده طی کاویتاسیون، واکنش استیل‌زدایی را تسریع می‌کند. شرایط واکنش‌پذیر ایجادشده بر اثر کاویتاسیون به شکستن پیوندهای استیل در کیتین کمک می‌کند و موجب آزادسازی اسید استیک و تبدیل کیتین به کیتوسان می‌شود.
در مجموع، فراصوت‌دهی شدید با تأمین انرژی مکانیکی و شیمیایی لازم برای تجزیهٔ پلیمر کیتین و تسهیل تبدیل آن به کیتوسان، هر دو فرایند پلیمریزاسیون‌زدایی و استیل‌زدایی را بهبود می‌دهد. این تکنیک روشی سریع و کارآمد برای تولید کیتوسان از کیتین فراهم می‌کند که در صنایع گوناگون، از جمله داروسازی، کشاورزی و مهندسی زیست‌پزشکی، کاربردهای فراوانی دارد.

تولید صنعتی کیتوسان از قارچ با فراصوت پرتوان

تولید تجاری کیتین و کیتوسان عمدتاً بر ضایعات صنایع دریایی (یعنی ماهیگیری، برداشت صدف‌داران و غیره) متکی است. منابع متفاوت مواد اولیه، کیتین و کیتوسان با کیفیت‌های متفاوتی ایجاد می‌کنند و تغییرات فصلی صید موجب نوسان تولید و کیفیت می‌شود. افزون بر این، بنا بر گزارش‌ها، کیتوسان حاصل از منابع قارچی در مقایسه با کیتوسان حاصل از منابع دریایی، ویژگی‌های برتری مانند طول یکنواخت پلیمر و حلالیت بیشتر دارد. (ر.ک. Ghormade et al., 2017) برای تأمین کیتوسان یکنواخت، استخراج کیتین از گونه‌های قارچی به یک روش تولید جایگزین و باثبات تبدیل شده است. تولید کیتین و کیتوسان از قارچ‌ها با استفاده از فناوری استخراج و استیل‌زدایی فراصوتی به‌آسانی و به‌صورت قابل‌اعتماد امکان‌پذیر است. فراصوت‌دهی شدید ساختارهای سلولی را برای آزادسازی کیتین تخریب می‌کند و انتقال جرم در حلال‌های آبی را افزایش می‌دهد تا بازده کیتین و کارایی استخراج بیشتر شود. استیل‌زدایی فراصوتی پس از آن، کیتین را به کیتوسان ارزشمند تبدیل می‌کند. هم استخراج فراصوتی کیتین و هم استیل‌زدایی آن برای تبدیل به کیتوسان را می‌توان به‌صورت خطی به هر سطحی از تولید تجاری افزایش مقیاس داد.

فراصوت‌دهی تولید کیتوسان قارچی را تشدید می‌کند و آن را کارآمدتر و اقتصادی‌تر می‌سازد.
(تصویر و پژوهش: © Zhu et al., 2019)

نتایج پژوهش دربارهٔ استیل‌زدایی فراصوتی کیتین و کیتوسان

Zhu et al. (2018) در پژوهش خود نتیجه می‌گیرند که استیل‌زدایی فراصوتی پیشرفتی تعیین‌کننده بوده است که β-کیتین را در دماهای واکنش پایین‌تر به کیتوسان با استیل‌زدایی 83–94% تبدیل می‌کند. تصویر سمت چپ، تصویر SEM کیتوسان استیل‌زدایی‌شده با فراصوت را نشان می‌دهد (90 W، 15 min، 20 w/v% NaOH، 1:15 (g: mL) (تصویر و پژوهش: © Zhu et al., 2018)
در پروتکل آن‌ها، محلول NaOH ‏(20 w/v %) با حل کردن پرک‌های NaOH در آب دیونیزه تهیه شد. سپس محلول قلیایی با نسبت جامد به مایع 1:20 (g: mL) در یک لولهٔ سانتریفیوژ به رسوب GLSP ‏(0٫5 g) افزوده شد. کیتوسان به NaCl ‏(40 mL، 0٫2 M) و اسید استیک (0٫1 M) با نسبت حجمی محلول 1:1 اضافه شد. سپس سوسپانسیون در دمای ملایم 25°C به مدت 60 min با استفاده از یک سونیکاتور پروبی (250W، 20kHz) تحت فراصوت قرار گرفت. (ر.ک. Zhu et al., 2018)
 
Pandit et al. (2021) دریافتند که سرعت تخریب محلول‌های کیتوسان به‌ندرت تحت تأثیر غلظت اسید مورد استفاده برای حل کردن پلیمر قرار می‌گیرد و عمدتاً به دما، شدت امواج فراصوت و قدرت یونی محیط مورد استفاده برای حل کردن پلیمر وابسته است. (ر.ک. Pandit et al., 2021)
 
در پژوهشی دیگر، Zhu et al. (2019) از پودر اسپور Ganoderma lucidum به‌عنوان مادهٔ اولیهٔ قارچی استفاده کردند و استیل‌زدایی به کمک فراصوت و اثر پارامترهای فرآوری، مانند زمان فراصوت‌دهی، نسبت جامد به مایع، غلظت NaOH و توان تابش، را بر درجهٔ استیل‌زدایی (DD) کیتوسان بررسی کردند. بیشترین مقدار DD با پارامترهای فراصوتی زیر به دست آمد: 20 min فراصوت‌دهی با توان 80W، ‏10% (g:ml) NaOH، ‏1:25 (g:ml). ریخت‌شناسی سطح، گروه‌های شیمیایی، پایداری حرارتی و بلورینگی کیتوسان حاصل از فراصوت با استفاده از SEM، FTIR، TG و XRD بررسی شدند. گروه پژوهشی افزایش چشمگیر درجهٔ استیل‌زدایی (DD)، گرانروی دینامیکی ([η]) و وزن مولکولی (Mv¯) کیتوسان تولیدشده با فراصوت را گزارش می‌کند. نتایج نشان دادند که تکنیک استیل‌زدایی فراصوتی قارچ‌ها، روشی بسیار مؤثر برای تولید کیتوسان مناسب برای کاربردهای زیست‌پزشکی است. (ر.ک. Zhu et al., 2019)

کیفیت برتر کیتوسان با پلیمریزاسیون‌زدایی و استیل‌زدایی فراصوتی

فرایندهای استخراج و پلیمریزاسیون‌زدایی کیتین / کیتوسان که با فراصوت پیش می‌روند، به‌دقت قابل‌کنترل‌اند و پارامترهای فرایند فراصوتی را می‌توان متناسب با مواد اولیه و کیفیت هدف محصول نهایی (برای مثال، وزن مولکولی و درجهٔ استیل‌زدایی) تنظیم کرد. این قابلیت امکان تطبیق فرایند فراصوت با عوامل خارجی و تنظیم پارامترهای بهینه برای دستیابی به نتیجه و کارایی برتر را فراهم می‌کند.
کیتوسان استیل‌زدایی‌شده با فراصوت، فراهمی زیستی و زیست‌سازگاری عالی دارد. هنگام مقایسهٔ ویژگی‌های زیست‌پزشکی زیست‌پلیمرهای کیتوسان تهیه‌شده با فراصوت با کیتوسان حاصل از روش حرارتی، کیتوسان تولیدشده با فراصوت بهبود چشمگیر زنده‌مانی فیبروبلاست‌ها (سلول L929) و افزایش فعالیت ضدباکتریایی علیه هر دو گونهٔ Escherichia coli (E. coli) و Staphylococcus aureus (S. aureus) را نشان می‌دهد.
(ر.ک. Zhu et al., 2018)
 

تصاویر میکروسکوپ الکترونی روبشی (SEM) با بزرگ‌نمایی 100× از a) گلادیوس، b) گلادیوس تیمارشده با فراصوت، c) β-کیتین، d) β-کیتین تیمارشده با فراصوت و e) کیتوسان (منبع: Preto et al. 2017)

تجهیزات فراصوتی با عملکرد بالا برای فرآوری کیتین و کیتوسان

قطعه‌قطعه‌کردن کیتین و استیل‌زدایی آن برای تبدیل به کیتوسان، به تجهیزات فراصوتی قدرتمند و قابل‌اعتمادی نیاز دارد که دامنه‌های بالا ارائه دهند، کنترل دقیق پارامترهای فرایند را ممکن سازند و بتوانند به‌صورت 24/7 زیر بار سنگین و در محیط‌های دشوار کار کنند. مجموعهٔ محصولات Hielscher Ultrasonics این الزامات را به‌طور قابل‌اعتماد برآورده می‌کند. سونیکاتورهای Hielscher علاوه بر عملکرد برجستهٔ فراصوتی، بازده انرژی بالایی دارند که مزیت اقتصادی چشمگیری است – به‌ویژه هنگام استفاده در تولید تجاری در مقیاس بزرگ.
سونیکاتورهای Hielscher سامانه‌هایی با عملکرد بالا هستند که می‌توان آن‌ها را به تجهیزاتی مانند سونوتْرودها، تقویت‌کننده‌های دامنه، راکتورها یا سلول‌های جریان مجهز کرد تا به بهترین شکل با نیازهای فرایند شما سازگار شوند. سونیکاتورهای Hielscher با نمایشگر رنگی دیجیتال، امکان تنظیم از پیشِ دوره‌های فراصوت‌دهی، ثبت خودکار داده‌ها روی کارت SD داخلی، کنترل از راه دور از طریق مرورگر و بسیاری قابلیت‌های دیگر، بالاترین سطح کنترل فرایند و سهولت استفاده را تضمین می‌کنند. سامانه‌های فراصوتی Hielscher با برخورداری از استحکام و ظرفیت تحمل بار سنگین، تجهیزات کاری قابل‌اعتماد شما در تولید هستند. قطعه‌قطعه‌کردن و استیل‌زدایی کیتین برای دستیابی به تبدیل هدف و محصول نهایی کیتوسان با کیفیت بالا، به فراصوت قدرتمند نیاز دارد. به‌ویژه برای قطعه‌قطعه‌کردن پرک‌های کیتین و مراحل پلیمریزاسیون‌زدایی / استیل‌زدایی، دامنه‌های بالا و فشارهای افزایش‌یافته اهمیت حیاتی دارند. پردازشگرهای فراصوتی صنعتی Hielscher Ultrasonics به‌آسانی دامنه‌های بسیار بالا ارائه می‌دهند. دامنه‌هایی تا 200µm را می‌توان به‌طور پیوسته در کارکرد 24/7 به کار گرفت. برای دامنه‌های بالاتر نیز سونوتْرودهای فراصوتی سفارشی موجود است. ظرفیت توان سامانه‌های فراصوتی Hielscher، پلیمریزاسیون‌زدایی و استیل‌زدایی کارآمد و سریع را در فرایندی ایمن و با کاربری آسان امکان‌پذیر می‌کند.
 

بهبود تیمار هم‌افزای کیتین با فراصوت‌دهی

برای غلبه بر معایب استیل‌زدایی شیمیایی و آنزیمی سنتی کیتین (یعنی کارایی پایین، هزینهٔ بالای انرژی، زمان طولانی فرآوری و حلال‌های سمی)، فراصوت با شدت بالا در فرآوری کیتین و کیتوسان به کار گرفته شده است. فراصوت‌دهی با شدت بالا و اثرات کاویتاسیون آکوستیکی حاصل از آن، به شکستن سریع زنجیره‌های پلیمری می‌انجامد و چندپراکندگی را کاهش می‌دهد و بدین‌ترتیب سنتز کیتوسان را تسهیل می‌کند. افزون بر این، نیروهای برشی فراصوتی انتقال جرم در محلول را تشدید می‌کنند و در نتیجه واکنش‌های شیمیایی، هیدرولیزی یا آنزیمی بهبود می‌یابند. تیمار فراصوتی کیتین را می‌توان با تکنیک‌های موجود فرآوری کیتین، مانند روش‌های شیمیایی، هیدرولیز یا فرایندهای آنزیمی، ترکیب کرد.

استیل‌زدایی و پلیمریزاسیون‌زدایی شیمیایی به کمک فراصوت

ازآنجاکه کیتین زیست‌پلیمری غیرواکنش‌پذیر و نامحلول است، برای دستیابی به کیتوسان محلول و زیست‌دسترس‌پذیر باید مراحل حذف مواد معدنی، پروتئین‌زدایی و پلیمریزاسیون‌زدایی / استیل‌زدایی را طی کند. این مراحل شامل تیمار با اسیدهای قوی مانند HCl و بازهای قوی مانند NaOH و KOH هستند. چون این مراحل متداول فرایند کم‌بازده و کند هستند و به انرژی زیادی نیاز دارند، تشدید فرایند با فراصوت‌دهی تولید کیتوسان را به‌طور چشمگیری بهبود می‌دهد. کاربرد فراصوت پرتوان، بازده و کیفیت کیتوسان را افزایش می‌دهد، زمان فرایند را از چند روز به چند ساعت کاهش می‌دهد، استفاده از حلال‌های ملایم‌تر را امکان‌پذیر می‌کند و بازده انرژی کل فرایند را افزایش می‌دهد.

بهبود پروتئین‌زدایی کیتین با فراصوت

Vallejo-Dominguez et al. (2021) در بررسی پروتئین‌زدایی کیتین دریافتند که «کاربرد فراصوت برای تولید زیست‌پلیمرها، محتوای پروتئین و همچنین اندازهٔ ذرات کیتین را کاهش داد. کیتوسانی با درجهٔ استیل‌زدایی بالا و وزن مولکولی متوسط به کمک فراصوت تولید شد.»

هیدرولیز فراصوتی برای پلیمریزاسیون‌زدایی کیتین

در هیدرولیز شیمیایی، برای استیل‌زدایی کیتین از اسیدها یا قلیاها استفاده می‌شود؛ بااین‌حال استیل‌زدایی قلیایی (برای مثال با سدیم هیدروکسید NaOH) کاربرد گسترده‌تری دارد. هیدرولیز اسیدی روشی جایگزین برای استیل‌زدایی شیمیایی سنتی است که در آن از محلول‌های اسید آلی برای پلیمریزاسیون‌زدایی کیتین و کیتوسان استفاده می‌شود. روش هیدرولیز اسیدی بیشتر زمانی به کار می‌رود که وزن مولکولی کیتین و کیتوسان باید یکنواخت باشد. این فرایند متداول هیدرولیز، کند، پرمصرف از نظر انرژی و پرهزینه شناخته می‌شود. نیاز به اسیدهای قوی، دماها و فشارهای بالا از عواملی هستند که فرایند هیدرولیزی کیتوسان را به روشی بسیار پرهزینه و زمان‌بر تبدیل می‌کنند. اسیدهای مورد استفاده به فرایندهای پایین‌دستی مانند خنثی‌سازی و نمک‌زدایی نیاز دارند.
با ادغام فراصوت پرتوان در فرایند هیدرولیز، دما و فشار مورد نیاز برای شکستن هیدرولیزی کیتین و کیتوسان را می‌توان به‌طور چشمگیری کاهش داد. افزون بر این، فراصوت‌دهی استفاده از غلظت‌های پایین‌تر اسید یا اسیدهای ملایم‌تر را امکان‌پذیر می‌کند. این امر فرایند را پایدارتر، کارآمدتر، مقرون‌به‌صرفه‌تر و سازگارتر با محیط‌زیست می‌سازد.

استیل‌زدایی شیمیایی به کمک فراصوت

تجزیهٔ شیمیایی و استیل‌زدایی کیتین و کیتوسان عمدتاً با تیمار کیتین یا کیتوسان با اسیدهای معدنی (برای مثال اسید هیدروکلریک HCl)، سدیم نیتریت (NaNO₂)، یا هیدروژن پراکسید (H₂O₂) انجام می‌شود. فراصوت سرعت استیل‌زدایی را افزایش می‌دهد و بدین‌ترتیب زمان واکنش لازم برای دستیابی به درجهٔ استیل‌زدایی هدف را کوتاه می‌کند. این بدان معناست که فراصوت‌دهی، زمان فرآوری مورد نیاز را از 12–24 ساعت به چند ساعت کاهش می‌دهد. افزون بر این، فراصوت‌دهی استفاده از غلظت‌های بسیار پایین‌تر مواد شیمیایی را ممکن می‌کند؛ برای مثال، با فراصوت‌دهی از سدیم هیدروکسید 40% (w/w) استفاده می‌شود، درحالی‌که بدون فراصوت به 65% (w/w) نیاز است.

استیل‌زدایی فراصوتی–آنزیمی

اگرچه استیل‌زدایی آنزیمی شیوه‌ای ملایم و بی‌ضرر برای محیط‌زیست است، از نظر کارایی و هزینه توجیه اقتصادی ندارد. به دلیل پیچیدگی، نیاز زیاد به نیروی کار و هزینهٔ بالای جداسازی و خالص‌سازی پایین‌دستی آنزیم‌ها از محصول نهایی، استیل‌زدایی آنزیمی کیتین در تولید تجاری اجرا نمی‌شود و تنها در آزمایشگاه‌های پژوهشی کاربرد دارد.
پیش‌تیمار فراصوتی پیش از استیل‌زدایی آنزیمی، مولکول‌های کیتین را قطعه‌قطعه می‌کند و بدین‌ترتیب مساحت سطح را افزایش می‌دهد و سطح بیشتری در دسترس آنزیم‌ها قرار می‌دهد. فراصوت‌دهی با عملکرد بالا به بهبود استیل‌زدایی آنزیمی کمک می‌کند و فرایند را اقتصادی‌تر می‌سازد.