Aplicaciones ultrasónicas en el virus MonkeyPox
La ultrasonicación es un método de procesamiento importante para el aislamiento del virus de la viruela del mono (MPXV) a partir de muestras analíticas, para la fragmentación del ADN del virus, así como en la fabricación de vacunas contra la viruela del mono. Para la preparación de muestras antes de diagnósticos y análisis (PCR, ELISA, etc.), la ultrasonicación se utiliza para lisar células con el fin de liberar el virus de la viruela del mono del interior celular y/o fragmentar el ADN. En la producción de vacunas, las aplicaciones van desde la preparación de partículas de virus / ADN, la encapsulación en portadores de fármacos y la formulación de los inóculos.
A continuación encontrará información detallada sobre la preparación ultrasónica de muestras del virus de la viruela del mono, así como sobre la producción de vacunas MPXV asistida por ultrasonidos.
Lo que encontrará en esta página:
- Lisis ultrasónica para la extracción del virus de la viruela del mono
- Fragmentación ultrasónica del ADN del virus de la viruela del mono
- Aplicaciones ultrasónicas en la producción de vacunas MPXV
Este sistema de 2 ultrasonidos de 1 kW para funcionamiento en flujo continuo está instalado en una planta de producción de vacunas.
Lisis ultrasónica y fragmentación del ADN antes de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
La infección por el virus de la viruela del mono se detecta mediante pruebas de amplificación de ácidos nucleicos (NAAT), utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real o convencional, para la detección de secuencias únicas de ADN viral. La muestra (procedente, por ejemplo, de un frotis nasofaríngeo o de biopsias cutáneas) contiene el virus en las células.
Para el análisis, el virus debe liberarse de las células y el ADN viral debe fragmentarse para la PCR.
Lisis ultrasónica:
La disrupción / lisis celular por ultrasonidos es un método fiable y eficaz para aislar virus de muestras celulares y, por tanto, una técnica preferible a los agentes químicos, como la lisozima, la proteinasa K y diferentes detergentes que se utilizan alternativamente para lograr la lisis celular y la liberación de ADN.
Sin embargo, el uso de estos reactivos químicos requiere una preparación de la muestra que requiere mucho tiempo en varios pasos antes del análisis PCR para evitar la inhibición de la reacción PCR. Dado que los inhibidores de la PCR afectan a la eficacia de la amplificación, las pequeñas variaciones de la cantidad de inhibidores que no se eliminan pueden provocar grandes variaciones en la amplificación del producto de la PCR (Diaco, 1995).
La ventaja de la ultrasonicación para la lisis es que se desea una disrupción completa de las estructuras celulares y la liberación del ADN sin necesidad de reactivos de lisis ni de una preparación de la muestra que lleve mucho tiempo. (cf. Fykse et al., 2003)
Fragmentación ultrasónica del ADN:
La fragmentación ultrasónica del ADN es sencilla y fiable, ya que produce fragmentos de ADN de longitud ajustable (pares de bases, pb). Mediante ultrasonidos, el ADN puede fragmentarse eficazmente hasta alcanzar la longitud deseada. El control preciso de los parámetros ultrasónicos y las sofisticadas opciones de refrigeración evitan la degradación del ADN.
Más información sobre la fragmentación ultrasónica del ADN
Aplicaciones ultrasónicas en la vacuna contra el virus de la viruela del mono
Las vacunas utilizadas contra el virus de la viruela del mono son actualmente vacunas de virus vivos. Las vacunas de nuevo desarrollo podrían utilizar otras plataformas, como las basadas en el ADN La vacuna actual contiene un viurs Vaccinia Ankara modificado, un ortopoxvirus atenuado que no se replica. También contiene Tris (tris-aminometano) y cloruro sódico. La vacuna también puede contener pequeñas cantidades de ADN y proteínas procedentes de células de fibroblastos de embrión de pollo, que se utilizan para cultivar el virus vacunal, benzonasa y compuestos antibióticos como gentamicina y ciprofloxacina.
La homogeneización ultrasónica se utiliza en la producción de vacunas de virus vivos atenuados, vacunas de ADN, cócteles de ADN multivalente, vacunas de ARNm, vacunas de proteínas recombinantes, vacunas de partículas similares a virus, etc.
- dispersión de partículas y agentes virales
- Emulsificar
- inactivación de virus
- formulación portadora del fármaco (NLC, SLN)
- encapsulación
- disolución de agentes
- preparación de adyuvantes
- Desgasificación / Desaireación
Protocolo de aislamiento ultrasónico del virus de la viruela del mono
El equipo de investigación de Stittelaar (2005) utilizó la lisis ultrasónica para liberar el virus de la viruela del mono del cultivo celular del huésped de crecimiento, así como de las células obtenidas mediante intercambios de garganta de primates infectados.
Preparación de la vacuna contra la viruela del mono:
Los virus de la viruela del mono se cultivaron en células de fibroblastos de embrión de pollo libres de patógenos específicos. Tras la incubación de 1 a 2 días, la suspensión de células víricas se cosechó mediante una ronda de congelación-descongelación y luego se concentró por centrifugación. El precipitado se resuspendió y se sometió a varias rondas de homogeneización ultrasónica.
Aislamiento del virus de la viruela del mono en macacos vacunados:
Las muestras se congelaron-descongelaron tres veces y se sonicaron en un CupHorn ultrasónico. Se utilizaron dos diluciones (1:10 y 1:100) en medio de transporte suplementado con 1% de suero bovino fetal para inocular monocapas de células Vero en placas de seis pocillos. Tras 1 h de incubación a 37°C, se retiraron los inóculos y se sustituyeron por medio de cultivo suplementado con suero bovino fetal al 1%. Las monocapas se cultivaron durante 5 días a 37°C y se tiñeron con una solución de violeta cristal.
(cf. Stittelaar et al., 2005)
Ultrasonidos para el análisis de virus y la producción de vacunas
La amplia cartera de productos de Hielscher Ultrasonics ofrece el ultrasonicador ideal para laboratorios de investigación y análisis, así como para la fabricación industrial de vacunas.
Hielscher Ultrasonics está especializada en el diseño, fabricación y distribución de ultrasonicadores y sono-biorreactores de alto rendimiento para su uso en laboratorios de investigación y análisis, así como para su aplicación en la producción industrial de vacunas (p. ej. fabricación de vacunas, APIs).
La sonicación puede aplicarse a recipientes abiertos, reactores cerrados de agitación continua y reactores de flujo continuo. Todas las piezas de los sistemas ultrasónicos que entran en contacto con el medio líquido son de acero inoxidable, titanio o vidrio. Las piezas esterilizables en autoclave y los accesorios sanitarios garantizan la producción bajo condiciones de calidad farmacéutica.
Registro automático de datos: Un software inteligente registra automáticamente los parámetros del proceso de sonicación en la tarjeta de memoria SD integrada. El control preciso de todos los parámetros del proceso garantiza la reproducibilidad, normalización de la produccióny facilita el cumplimiento de las normas de seguridad de los productos farmacéuticos.
Hielscher Ultrasonics’ Los procesadores ultrasónicos son muy fiables y pueden controlarse con precisión. Todos los ultrasonicadores industriales pueden ajustarse para suministrar toda la gama, desde amplitudes bajas a muy altas. La robustez de los sistemas de ultrasonidos de Hielscher permite un funcionamiento ininterrumpido en condiciones de trabajo duras y en entornos exigentes.
En la siguiente tabla encontrará algunas indicaciones sobre la capacidad de procesamiento aproximada de nuestros sonicadores:
| Volumen del lote | Tasa de flujo | Dispositivos recomendados |
|---|---|---|
| placas multipocillo / microtituladoras | n/a | UIP400MTP |
| 1 a 500 mL | 10 a 200 mL/min. | UP100H |
| 10 a 2000 mL | 20 a 400 mL/min. | UP200Ht, UP400St |
| 0,1 a 20 L | 0,2 a 4 L/min | UIP2000hdT |
| 10 a 100 L | 2 a 10 L/min | UIP4000hdT |
| n/a | 10 a 100 L/min | UIP16000 |
| n/a | mayor | Grupo de UIP16000 |
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Fragmentación de ADN por ultrasonidos
Adaptado de Jkwchui bajo CC-BY-SA.03
Literatura / Referencias
- Stittelaar, Koert; Amerongen, Geert; Kondova, Ivanela; Kuiken, Thijs; Lavieren, Rob; Pistoor, Frank; Niesters, Hubert; Doornum, Gerard; Van der Zeijst, Bernard; Mateo, Luis; Chaplin, Paul; Osterhaus, Albert (2005): Modified Vaccinia Virus Ankara Protects Macaques against Respiratory Challenge with Monkeypox Virus. Journal of Virology 79, 2005. 7845-51.
- Shah Purvin, Parameswara Rao Vuddanda, Sanjay Kumar Singh, Achint Jain, and Sanjay Singh (2014): Pharmacokinetic and Tissue Distribution Study of Solid Lipid Nanoparticles of Zidov in Rats. Journal of Nanotechnology, Volume 2014.
- J. Robin Harris, Andrei Soliakova, Richard J. Lewis, Frank Depoix, Allan Watkinson, Jeremy H. Lakeya (2012): Alhydrogel® adjuvant, ultrasonic dispersion and protein binding: a TEM and analytical study. Micron Volume 43, Issues 2–3, February 2012, 192-200.
- Doron Melamed, Gabriel Leitner, E. Dan Heller (1991): A Vaccine against Avian Colibacillosis Based on Ultrasonic Inactivation of Escherichia coli. Avian Diseases Vol. 35, No. 1 (Jan. – Mar., 1991), 17-22.
- Huang C-F, Wu T-C, Wu C-C, Lee C-C, Lo W-T, Hwang K-S, Hsu M-L, Peng H-J. (2011): Sublingual vaccination with sonicated Salmonella proteins and mucosal adjuvant induces mucosal and systemic immunity and protects mice from lethal enteritis. APMIS 119, 2011. 468–78.
Información interesante
Virus de la viruela del mono
La viruela del mono (MPV, MPXV o hMPXV) es una especie de virus de ADN de doble cadena que causa una enfermedad zoonótica vírica. Esta enfermedad se conoce como infección por viruela del mono y puede afectar a personas y animales. Pertenece al género Orthopoxvirus de la familia Poxviridae. El virus de la viruela del mono es uno de los orthopoxvirus humanos junto con los virus variola (VARV), cowpox (CPX) y vaccinia (VACV). Los ortopoxvirus se caracterizan por tener grandes partículas víricas en forma de ladrillo, que contienen un genoma de ADN bicatenario de aproximadamente 200.000 pb.
Ensayo ELISA
ELISA significa Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas) y es un inmunoensayo marcado que se considera el patrón oro de los inmunoensayos. ELISA es una prueba inmunológica, valorada por su alta sensibilidad diagnóstica, que se utiliza para detectar y cuantificar moléculas, incluidos anticuerpos, antígenos, proteínas, glicoproteínas y hormonas. El principio de ELISA se basa en una interacción antígeno-anticuerpo. Mediante esta interacción antígeno-anticuerpo, los anticuerpos específicos se unen a su antígeno diana. Sólo cuando se produce la interacción, el sustrato puede unirse a la enzima y puede observarse una conversión subsiguiente del sustrato, lo que significa que se obtiene un resultado positivo.
Hielscher Ultrasonics fabrica homogeneizadores ultrasónicos de alto rendimiento de laboratorio a tamaño industrial.