Aplicaciones de los ultrasonidos en el virus de la viruela símica
La ultrasonicación es un método de procesamiento importante para aislar el virus de la viruela símica (MPXV) de muestras analíticas, fragmentar el ADN vírico y fabricar vacunas contra la viruela símica. En la preparación de muestras previa al diagnóstico y al análisis (PCR, ELISA, etc.), la ultrasonicación se utiliza para lisar las células con el fin de liberar el virus de la viruela símica de su interior y / o fragmentar el ADN. En la producción de vacunas, las aplicaciones abarcan la preparación de partículas víricas / ADN, la encapsulación en vehículos de administración de fármacos y la formulación de los inóculos.
A continuación encontrará información detallada sobre la preparación por ultrasonidos de muestras del virus de la viruela símica y la producción de vacunas contra el MPXV asistida por ultrasonidos.
Qué encontrará en esta página:
- Lisis ultrasónica para la extracción del virus de la viruela símica
- Fragmentación ultrasónica del ADN del virus de la viruela símica
- Aplicaciones de los ultrasonidos en la producción de vacunas contra el MPXV
Este sistema de ultrasonicadores de 2x 1 kW para funcionamiento en flujo continuo está instalado en una planta de producción de vacunas.
Lisis ultrasónica y fragmentación del ADN antes de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
La infección por el virus de la viruela símica se detecta mediante pruebas de amplificación de ácidos nucleicos (NAAT), utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real o convencional para detectar secuencias específicas del ADN vírico. La muestra (p. ej., de un exudado nasofaríngeo o de biopsias cutáneas) contiene el virus dentro de las células.
Para el análisis, el virus debe liberarse de las células y el ADN vírico debe fragmentarse para la PCR.
Lisis ultrasónica:
La ruptura celular / lisis ultrasónica es un método fiable y eficiente para aislar virus de muestras celulares y, por tanto, una técnica preferible al uso de agentes químicos, como la lisozima, la proteinasa K y distintos detergentes, que se utilizan como alternativa para lograr la lisis celular y la liberación del ADN.
Sin embargo, el uso de estos reactivos químicos requiere una preparación de muestras laboriosa y en varios pasos antes del análisis por PCR para evitar la inhibición de la reacción de PCR. Dado que los inhibidores de la PCR afectan a la eficiencia de la amplificación, pequeñas variaciones en la cantidad de inhibidores que no se eliminan pueden dar lugar a grandes variaciones en la amplificación del producto de PCR (Diaco, 1995).
La ventaja de la ultrasonicación para la lisis radica en que resulta deseable lograr la ruptura completa de las estructuras celulares y la liberación del ADN sin necesidad de reactivos de lisis ni de una preparación de muestras laboriosa. (cf. Fykse et al., 2003)
Fragmentación ultrasónica del ADN:
La fragmentación ultrasónica del ADN es sencilla y fiable, ya que produce fragmentos de ADN de longitud ajustable (pares de bases, bp). Mediante ultrasonidos, el ADN puede fragmentarse eficazmente hasta alcanzar la longitud deseada. El control preciso de los parámetros ultrasónicos y las opciones avanzadas de refrigeración evitan la degradación del ADN.
¡Lea más sobre la fragmentación ultrasónica del ADN!
Aplicaciones de los ultrasonidos en la vacuna contra el virus de la viruela símica
Las vacunas utilizadas contra el virus de la viruela símica son actualmente vacunas de virus vivos. Las vacunas de nuevo desarrollo podrían utilizar otras plataformas, como las basadas en ADN… Actualmente contiene un virus Vaccinia Ankara modificado, un ortopoxvirus atenuado que no se replica. También contiene Tris (tris-aminometano) y cloruro de sodio. La vacuna también puede contener pequeñas cantidades de ADN y proteínas de las células de fibroblastos de embrión de pollo, que se utilizan para cultivar el virus vacunal, benzonasa y compuestos antibióticos como la gentamicina y la ciprofloxacina.
La homogeneización ultrasónica se utiliza en la producción de vacunas de virus vivos atenuados, vacunas de ADN, cócteles multivalentes de ADN, vacunas de ARNm, vacunas de proteínas recombinantes, vacunas de partículas similares a virus, etc.
- dispersión de partículas víricas y agentes
- emulsificación
- inactivación de virus
- formulación de vehículos de administración de fármacos (NLC, SLN)
- encapsulación
- disolución de agentes
- preparación de adyuvantes
- desgasificación / desaireación
Protocolo para el aislamiento ultrasónico del virus de la viruela símica
El equipo de investigación de Stittelaar (2005) utilizó la lisis ultrasónica para liberar el virus de la viruela símica del cultivo de células hospedadoras utilizado para su propagación, así como de células obtenidas mediante exudados faríngeos de primates infectados.
Preparación de la vacuna contra la viruela símica:
Los virus de la viruela símica se cultivaron en células de fibroblastos de embrión de pollo libres de patógenos específicos. Tras la incubación durante 1 a 2 días, la suspensión de virus y células se recogió mediante un ciclo de congelación y descongelación y, a continuación, se concentró por centrifugación. El sedimento se resuspendió y se sometió a varios ciclos de homogeneización ultrasónica.
Aislamiento del virus de la viruela símica de macacos vacunados:
Las muestras se congelaron y descongelaron tres veces y se sonicaron en un CupHorn ultrasónico. Se utilizaron dos diluciones (1:10 y 1:100) en medio de transporte suplementado con 1% de suero fetal bovino para inocular monocapas de células Vero en placas de seis pocillos. Tras 1 h de incubación a 37 °C, se retiraron los inóculos y se sustituyeron por medio de cultivo suplementado con 1% de suero fetal bovino. Las monocapas se cultivaron durante 5 días a 37 °C y se tiñeron con una solución de cristal violeta.
(cf. Stittelaar et al., 2005)
Ultrasonicadores para el análisis de virus y la producción de vacunas
La amplia gama de productos de Hielscher Ultrasonics ofrece el ultrasonicador ideal tanto para laboratorios de investigación y análisis como para la fabricación industrial de vacunas.
Hielscher Ultrasonics está especializada en el diseño, la fabricación y la distribución de ultrasonicadores de alto rendimiento y sonobiorreactores para su uso en laboratorios de investigación y análisis, así como para su incorporación a la producción industrial de vacunas (p. ej., vacunas, principios activos farmacéuticos).
La sonicación puede aplicarse en recipientes abiertos, reactores cerrados con agitación continua y reactores de flujo continuo. Todas las piezas de los sistemas ultrasónicos que entran en contacto con el medio líquido están fabricadas en acero inoxidable, titanio o vidrio. Las piezas esterilizables en autoclave y los accesorios sanitarios garantizan la producción en condiciones de grado farmacéutico.
Registro automático de datos: El software inteligente registra automáticamente los parámetros del proceso de sonicación en la tarjeta de memoria SD integrada. El control preciso de todos los parámetros del proceso garantiza la reproducibilidad, estandarización de la producción, y facilita el cumplimiento de las normas de seguridad de los productos farmacéuticos.
Los procesadores ultrasónicos de Hielscher Ultrasonics son muy fiables y permiten un control preciso. Todos los ultrasonicadores industriales pueden ajustarse para proporcionar toda la gama de amplitudes, desde bajas hasta muy altas. La robustez de los sistemas ultrasónicos de Hielscher permite el funcionamiento 24/7 en condiciones de trabajo intensivo y en entornos exigentes.
La siguiente tabla ofrece una orientación sobre la capacidad de procesamiento aproximada de nuestros ultrasonicadores:
| Volumen por lote | Caudal | Equipos recomendados |
|---|---|---|
| placas multipocillo / de microtitulación | n/a | UIP400MTP |
| 1 a 500 mL | 10 a 200 mL/min | UP100H |
| 10 a 2000 mL | 20 a 400 mL/min | UP200Ht, UP400St |
| 0,1 a 20 L | 0,2 a 4 L/min | UIP2000hdT |
| 10 a 100 L | 2 a 10 L/min | UIP4000hdT |
| n/a | 10 a 100 L/min | UIP16000 |
| n/a | mayor | conjunto de UIP16000 |
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Cizallamiento ultrasónico del ADN
Adaptado de Jkwchui bajo CC-BY-SA.03
Bibliografía / Referencias
- Stittelaar, Koert; Amerongen, Geert; Kondova, Ivanela; Kuiken, Thijs; Lavieren, Rob; Pistoor, Frank; Niesters, Hubert; Doornum, Gerard; Van der Zeijst, Bernard; Mateo, Luis; Chaplin, Paul; Osterhaus, Albert (2005): Modified Vaccinia Virus Ankara Protects Macaques against Respiratory Challenge with Monkeypox Virus. Journal of Virology 79, 2005. 7845-51.
- Shah Purvin, Parameswara Rao Vuddanda, Sanjay Kumar Singh, Achint Jain, and Sanjay Singh (2014): Pharmacokinetic and Tissue Distribution Study of Solid Lipid Nanoparticles of Zidov in Rats. Journal of Nanotechnology, Volume 2014.
- J. Robin Harris, Andrei Soliakova, Richard J. Lewis, Frank Depoix, Allan Watkinson, Jeremy H. Lakeya (2012): Alhydrogel® adjuvant, ultrasonic dispersion and protein binding: a TEM and analytical study. Micron Volume 43, Issues 2–3, February 2012, 192-200.
- Doron Melamed, Gabriel Leitner, E. Dan Heller (1991): A Vaccine against Avian Colibacillosis Based on Ultrasonic Inactivation of Escherichia coli. Avian Diseases Vol. 35, No. 1 (Jan. – Mar., 1991), 17-22.
- Huang C-F, Wu T-C, Wu C-C, Lee C-C, Lo W-T, Hwang K-S, Hsu M-L, Peng H-J. (2011): Sublingual vaccination with sonicated Salmonella proteins and mucosal adjuvant induces mucosal and systemic immunity and protects mice from lethal enteritis. APMIS 119, 2011. 468–78.
Información de interés
Virus de la viruela símica
El virus de la viruela símica (MPV, MPXV o hMPXV) es una especie de virus de ADN bicatenario que causa una enfermedad zoonótica vírica. Esta enfermedad se conoce como infección por viruela símica y puede afectar a seres humanos y animales. Pertenece al género Orthopoxvirus de la familia Poxviridae. El virus de la viruela símica es uno de los ortopoxvirus humanos, junto con los virus de la viruela (VARV), la viruela bovina (CPX) y la vaccinia (VACV). Los ortopoxvirus se caracterizan por presentar partículas víricas grandes con forma de ladrillo, que contienen un genoma de ADN bicatenario de aproximadamente 200.000 bp.
Ensayo ELISA
ELISA significa ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas y es un inmunoensayo con marcaje que se considera el patrón de referencia de los inmunoensayos. ELISA es una prueba inmunológica, valorada por su elevada sensibilidad diagnóstica, que se utiliza para detectar y cuantificar moléculas, incluidos anticuerpos, antígenos, proteínas, glucoproteínas y hormonas. El principio de ELISA se basa en una interacción antígeno-anticuerpo. Mediante esta interacción antígeno-anticuerpo, los anticuerpos específicos se unen a su antígeno diana. Solo cuando se produce la interacción puede el sustrato unirse a la enzima y observarse una conversión posterior del sustrato, lo que significa que se obtiene un resultado positivo.
Hielscher Ultrasonics fabrica homogeneizadores ultrasónicos de alto rendimiento desde escala de laboratorio hasta escala industrial.