Κατεργασία με υπερήχους για κυτταρική λύση: Κυτταρική διαταραχή και εκχύλιση
Η λύση κυττάρων με υπερήχους είναι μια ευρέως χρησιμοποιούμενη τεχνική προετοιμασίας δειγμάτων στα σύγχρονα εργαστήρια βιοτεχνολογίας. Πρωταρχικός σκοπός της είναι η διάσπαση κυτταρικών μεμβρανών ή ολόκληρων κυττάρων προκειμένου να απελευθερωθούν ενδοκυτταρικά συστατικά όπως πρωτεΐνες, νουκλεϊκά οξέα ή οργανίδια. Στην καθημερινή εργαστηριακή εργασία αυτό σημαίνει ότι ο ηχοβολισμός είναι μια τυπική μέθοδος για την ελεγχόμενη διάσπαση των κυττάρων και την αποτελεσματική εκχύλιση βιομορίων. Το βασικό πλεονέκτημα των ηχοβολέων έγκειται στην ικανότητά τους να ρυθμίζουν με ακρίβεια κρίσιμες παραμέτρους της διαδικασίας, συμπεριλαμβανομένης της έντασης των υπερήχων, του παλμού και του ελέγχου της θερμοκρασίας. Αυτός ο έλεγχος επιτρέπει στους ερευνητές να επιτυγχάνουν αξιόπιστη λύση, ελαχιστοποιώντας παράλληλα τη θερμική ή μηχανική βλάβη σε ευαίσθητα βιομόρια, με αποτέλεσμα μια ήπια αλλά ιδιαίτερα αποτελεσματική διαδικασία εκχύλισης.
Λύση κυττάρων με χρήση ηχοβολέων
Η λύση κυττάρων με υπερήχους χρησιμοποιεί την ακουστική σπηλαίωση για τη διάσπαση των κυτταρικών μεμβρανών και την απελευθέρωση ενδοκυτταρικών μορίων. Η Hielscher Ultrasonics προσφέρει τον κλασικό ηχοβολέα τύπου καθετήρα καθώς και ηχοβολείς πολλαπλών δειγμάτων για αποστειρωμένη επεξεργασία: τον VialTweeter για πολλαπλά σωληνάρια και φιαλίδια και τον ηχοβολέα 96-Well Plate Sonicator UIP400MTP για τυπικές μικροπλάκες.
Hielscher Υπέρηχοι παρέχει ισχυρούς υπερήχων χωρίς επαφή για την προετοιμασία του δείγματος και κλινική ανάλυση. Ο υπερήχων πλάκας πολλαπλών φρεατίων UIP400MTP, Το VialTweeter, το CupHorn και τον ηχοβολέα ροής GDmini2 να επεξεργάζεστε τα δείγματα υπό αποστειρωμένες συνθήκες.
Υπερήχων ομογενοποιητές UP100H (100 watt) και UP400St (400 watt): Υπερήχηση για κυτταρική λύση και εκχύλιση.
Υπερήχων ομογενοποιητές για κυτταρική λύση και εκχύλιση
| Τύπος συσκευής υπερήχων | Εστίαση στην εφαρμογή | Όγκος δείγματος | Τυπική περίπτωση χρήσης | Πλεονεκτήματα | Παραδείγματα μοντέλων |
|---|---|---|---|---|---|
| Υπερήχων τύπου ανιχνευτή | Ηχοβολισμός ενός δείγματος | 0.1 mL έως ~1000 mL | Λύση κυττάρων, εκχύλιση πρωτεϊνών, κατακερματισμός DNA/RNA | Ακριβής έλεγχος της ενέργειας- διάφορα ηχοβολιστικά- βέλτιστο για μικρά έως μεσαία δείγματα | UP100Η, UP200St, UP400St |
| VialTweeter / CupHorn | Παράλληλη επεξεργασία πολλαπλών σφραγισμένων φιαλιδίων | 8-10 φιαλίδια (~1-20 ml το καθένα) | Τυποποιημένη λύση πολλαπλών κυτταρικών εναιωρημάτων | Ομοιόμορφος ηχοβολισμός- αποφυγή διασταυρούμενης μόλυνσης- αναπαραγώγιμα αποτελέσματα | VialTweeter, Cuphorn |
| Ηχοβολέας πλάκας 96-well | Ηχητικός καθαρισμός πλακών πολλαπλών κοιλοτήτων και μικροτιτλοδοτών | Μορφή μικροπλάκας | Διαλογή υψηλής απόδοσης, πρωτεομική, κυτταρικές δοκιμασίες | Ταυτόχρονος, ομοιόμορφος ηχοβολισμός σε όλα τα φρεάτια- ιδανικός για ροές εργασίας πολλαπλών δειγμάτων | UIP400MTP |
| αντιδραστήρες κυψελών ροής | Συνεχής ηχοβολισμός για υψηλότερους όγκους | >1 L, επεκτάσιμη | Διακοπή κυττάρων βιομηχανικής κλίμακας, παραγωγή εκχυλίσματος | Συνεχής επεξεργασία- κλιμακούμενη- πλήρης έλεγχος της διαδικασίας (πλάτος, πίεση, θερμοκρασία) | UIP1000hdT, UIP2000hdT + κυψέλη ροής |
| Αποστειρωμένα/έμμεσα συστήματα ηχοβολισμού | Επεξεργασία δειγμάτων χωρίς μόλυνση | Εξαρτάται από φιαλίδιο/σωλήνα/μικροπλάκα | Ευαίσθητα δείγματα, αποστειρωμένα περιβάλλοντα, κανονιστικές ρυθμίσεις | Δεν υπάρχει επαφή με τον αισθητήρα- αποφεύγεται η μεταφορά- ελάχιστη προσπάθεια καθαρισμού | VialTweeter, Cuphorn, UIP400MTP |
Πλεονεκτήματα της χρήσης υπερήχων για κυτταρική λύση
Σε σύγκριση με άλλες μεθόδους κυτταρικής λύσης και εκχύλισης, υπερήχων κυτταρική λύση έχει πολλά πλεονεκτήματα:
- Ταχύτητα: Υπερήχων κυτταρική λύση και εκχύλιση είναι μια γρήγορη μέθοδος που μπορεί να σπάσει ανοικτά κύτταρα μέσα σε λίγα δευτερόλεπτα. Αυτό είναι πολύ πιο γρήγορο από άλλες μεθόδους όπως η ομογενοποίηση, η ψύξη-απόψυξη ή η άλεση σφαιριδίων.
- Αποδοτικότητα: Υπερήχων κυτταρική λύση και εκχύλιση μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη θεραπεία μικρών, μεγάλων ή πολλαπλών δειγμάτων ταυτόχρονα, καθιστώντας το πιο αποτελεσματικό από άλλες μεθόδους που απαιτούν ατομική επεξεργασία μικρών δειγμάτων.
- Χωρίς χημικά: Υπερήχων κυτταρική λύση και εκχύλιση είναι μια μη επεμβατική μέθοδος που δεν απαιτεί τη χρήση σκληρών χημικών ουσιών ή ενζύμων. Αυτό το καθιστά ιδανικό για εφαρμογές όπου πρέπει να διατηρηθεί η ακεραιότητα του περιεχομένου του κελιού. Η ανεπιθύμητη μόλυνση των δειγμάτων μπορεί να αποφευχθεί.
- Υψηλή απόδοση: Υπερήχων κυτταρική λύση και εκχύλιση μπορεί να εξαγάγει υψηλή απόδοση των κυτταρικών περιεχομένων, συμπεριλαμβανομένου του DNA, RNA, και πρωτεΐνες. Αυτό συμβαίνει επειδή τα ηχητικά κύματα υψηλής συχνότητας σπάνε τα κυτταρικά τοιχώματα και απελευθερώνουν το περιεχόμενο στο περιβάλλον διάλυμα.
- Έλεγχος θερμοκρασίας: Εξελιγμένοι υπέρηχοι επιτρέπουν τον ακριβή έλεγχο της θερμοκρασίας του δείγματος. Hielscher ψηφιακή υπερήχων είναι εξοπλισμένα με ένα pluggable αισθητήρα θερμοκρασίας και λογισμικό παρακολούθησης της θερμοκρασίας.
- Αναπαραχθούν: Τα πρωτόκολλα για την υπερηχητική κυτταρική λύση μπορούν εύκολα να αναπαραχθούν και ακόμη και να αντιστοιχιστούν σε διαφορετικούς μεγαλύτερους ή μικρότερους όγκους δειγμάτων με μια απλή γραμμική κλιμάκωση.
- Πολύπλευρος: Υπερήχων κυτταρική λύση και εκχύλιση μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να εξαγάγετε ένα ευρύ φάσμα τύπων κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων των βακτηρίων, ζύμη, μύκητες, φυτικά και θηλαστικά κύτταρα. Μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί για την εξαγωγή διαφορετικών τύπων μορίων, συμπεριλαμβανομένων πρωτεϊνών, DNA, RNA και λιπιδίων.
- Ταυτόχρονη προετοιμασία πολυάριθμων δειγμάτων: Hielscher Υπέρηχοι προσφέρει διάφορες λύσεις για την άνετη επεξεργασία πολλών δειγμάτων υπό τις ίδιες ακριβώς συνθήκες διαδικασίας. Αυτό καθιστά το στάδιο προετοιμασίας του δείγματος της λύσης και της εκχύλισης εξαιρετικά αποτελεσματικό και εξοικονομεί χρόνο.
- Εύκολο στη χρήση: Υπερήχων κυτταρική λύση και εκχύλιση εξοπλισμού είναι εύκολο στη χρήση και απαιτεί ελάχιστη εκπαίδευση. Ο εξοπλισμός είναι επίσης οικονομικός καθώς αποτελεί ενιαία επένδυση χωρίς να απαιτείται επαναγορά των απορριμμάτων. Αυτό το καθιστά ελκυστικό για ένα ευρύ φάσμα ερευνητών και εργαστηρίων.
Συνολικά, υπερήχων κυτταρική λύση και εκχύλιση είναι μια γρήγορη, αποτελεσματική, ακριβώς ελεγχόμενη, και ευέλικτη μέθοδος για την εξαγωγή κυτταρικών περιεχομένων. Τα πλεονεκτήματά του έναντι των εναλλακτικών μεθόδων το καθιστούν ελκυστική επιλογή για ένα ευρύ φάσμα ερευνητικών και βιομηχανικών εφαρμογών.
Αρχή εργασίας της υπερηχητικής κυτταρικής λύσης
Υπερήχων κυτταρική λύση και εκχύλιση χρησιμοποιεί υψηλής συχνότητας ηχητικά κύματα για να διαταράξει τα κύτταρα και να εξαγάγει το περιεχόμενό τους. Τα ηχητικά κύματα δημιουργούν αλλαγές πίεσης στο περιβάλλον υγρό, προκαλώντας το σχηματισμό μικρών φυσαλίδων και την κατάρρευση σε μια διαδικασία γνωστή ως σπηλαίωση. Αυτές οι φυσαλίδες δημιουργούν εντοπισμένες πολύ έντονες μηχανικές δυνάμεις που μπορούν να σπάσουν τα ανοιχτά κύτταρα και να απελευθερώσουν το περιεχόμενό τους στο περιβάλλον διάλυμα.
Κυτταρική λύση χρησιμοποιώντας ένα υπερήχων συνήθως περιλαμβάνει τα ακόλουθα βήματα:
- Το δείγμα τοποθετείται σε σωλήνα ή περιέκτη με υγρό ρυθμιστικό διάλυμα.
- Ένας υπερηχητικός καθετήρας εισάγεται στο δείγμα και εφαρμόζονται ηχητικά κύματα υψηλής συχνότητας με περίπου 20-30 kHz.
- Τα κύματα υπερήχων προκαλούν ταλάντωση και σπηλαίωση στο περιβάλλον υγρό, δημιουργώντας τοπικές δυνάμεις που σπάνε τα ανοιχτά κύτταρα και απελευθερώνουν το περιεχόμενό τους.
- Το δείγμα φυγοκεντρείται ή διηθείται για να απομακρυνθούν τυχόν κυτταρικά υπολείμματα και το εκχυλισμένο περιεχόμενο συλλέγεται για κατάντη ανάλυση.
Μειονεκτήματα των κοινών μεθόδων λύσης
Κατά τη διάρκεια της εργασίας σας σε εργαστήρια, μπορεί να έχετε ήδη βιώσει την ταλαιπωρία της κυτταρικής λύσης χρησιμοποιώντας παραδοσιακά πρωτόκολλα μηχανικής ή χημικής λύσης.
- Μηχανική λύση: Οι μέθοδοι μηχανικής λύσης, όπως η άλεση με κονίαμα και γουδοχέρι ή η ομογενοποίηση χρησιμοποιώντας γαλλική πρέσα, μύλο σφαιριδίων ή σύστημα ρότορα-στάτορα συχνά στερούνται επιλογών ελέγχου και ρύθμισης. Αυτό σημαίνει ότι η χρήση άλεσης και άλεσης μπορεί γρήγορα να παράγει θερμότητα και δυνάμεις διάτμησης που μπορούν να βλάψουν το δείγμα και να μετουσιώσουν τις πρωτεΐνες. Μπορούν επίσης να είναι χρονοβόρες και απαιτούν μεγάλες ποσότητες πρώτης ύλης.
- Χημική λύση: Οι μέθοδοι χημικής λύσης, όπως η λύση με βάση το απορρυπαντικό, μπορούν να βλάψουν το δείγμα διαταράσσοντας τη λιπιδική διπλοστιβάδα και τις πρωτεΐνες μετουσίωσης. Μπορούν επίσης να απαιτούν πολλαπλά βήματα και μπορεί να αφήνουν υπολειμματικούς ρύπους που παρεμβαίνουν στις κατάντη εφαρμογές. Η εύρεση της βέλτιστης δοσολογίας απορρυπαντικού είναι μια πρόσθετη πρόκληση.
- Κύκλοι ψύξης-απόψυξης: Οι κύκλοι ψύξης-απόψυξης μπορούν να προκαλέσουν ρήξη των κυτταρικών μεμβρανών, αλλά οι επαναλαμβανόμενοι κύκλοι μπορούν επίσης να προκαλέσουν μετουσίωση και αποικοδόμηση πρωτεϊνών. Αυτή η μέθοδος μπορεί επίσης να απαιτεί πολλαπλούς κύκλους, οι οποίοι μπορεί να είναι χρονοβόροι και συχνά οδηγούν σε χαμηλότερες αποδόσεις.
- Ενζυματική λύση: Οι μέθοδοι ενζυματικής λύσης μπορεί να είναι ειδικές για ορισμένους τύπους κυττάρων και απαιτούν πολλαπλά βήματα, καθιστώντας τα χρονοβόρα. Παράγουν επίσης απόβλητα και απαιτούν προσεκτική βελτιστοποίηση για να αποφευχθεί η υποβάθμιση του δείγματος. Τα κιτ ενζυματικής λύσης είναι συχνά ακριβά. Εάν η τρέχουσα διαδικασία ενζυματικής λύσης σας δίνει ανεπαρκή αποτελέσματα, υπερήχηση ως συνεργιστική μέθοδος μπορεί να εφαρμοστεί για να εντείνει τη διαταραχή των κυττάρων.
Σε αντίθεση με τις συμβατικές μηχανικές και χημικές μεθόδους κυτταρικής λύσης, κατεργασία με υπερήχους είναι ένα πολύ αποτελεσματικό και αξιόπιστο εργαλείο για την αποσύνθεση των κυττάρων που επιτρέπει τον πλήρη έλεγχο των παραμέτρων υπερήχων. Αυτό εξασφαλίζει υψηλή επιλεκτικότητα στην απελευθέρωση υλικών και την καθαρότητα του προϊόντος. [πρβλ. Balasundaram et al., 2009]
Είναι κατάλληλο για όλους τους τύπους κυττάρων και εύκολα εφαρμόσιμο σε μικρή και μεγάλη κλίμακα – πάντα υπό ελεγχόμενες συνθήκες. Οι υπερήχων είναι εύκολο να καθαριστούν. Ένας ομογενοποιητής υπερήχων διαθέτει πάντα λειτουργία καθαρισμού στο χώρο (CIP) και αποστείρωσης στο χώρο (SIP). Το sonotrode αποτελείται από ένα τεράστιο κέρατο τιτανίου το οποίο μπορεί να σκουπιστεί ή να ξεπλυθεί με νερό ή διαλύτη (ανάλογα με το μέσο εργασίας). Η διατήρηση των υπερήχων οφείλεται στην ευρωστία τους σχεδόν αμελητέα.
Υπερήχων λύση και κυτταρική διαταραχή
Γενικά, η λύση των δειγμάτων στο εργαστήριο θα διαρκέσει μεταξύ 15 δευτερολέπτων και 2 λεπτών. Δεδομένου ότι η ένταση της υπερήχησης είναι πολύ εύκολο να προσαρμοστεί με το πλάτος που θέτει ένα χρόνο υπερήχων, καθώς και με την επιλογή του σωστού εξοπλισμού, είναι δυνατόν να διαταράξει τις κυτταρικές μεμβράνες πολύ απαλά ή πολύ απότομα, ανάλογα με την κυτταρική δομή και το σκοπό της λύσης (π.χ. η εκχύλιση DNA απαιτεί μαλακότερη υπερήχηση, η πλήρης πρωτεϊνική εκχύλιση βακτηρίων απαιτεί πιο έντονη θεραπεία υπερήχων). Η θερμοκρασία κατά τη διάρκεια της διαδικασίας μπορεί να παρακολουθείται από έναν ενσωματωμένο αισθητήρα θερμοκρασίας και μπορεί εύκολα να ελεγχθεί με ψύξη (παγωμένο λουτρό ή κυψέλες ροής με ψυκτικά μπουφάν) ή με υπερήχους σε παλμική λειτουργία. Κατά τη διάρκεια παλμού-mode κατεργασία με υπερήχους, σύντομοι κύκλοι έκρηξης υπερήχων διάρκειας 1-15 δευτερολέπτων επιτρέπουν την απαγωγή θερμότητας και την ψύξη κατά τη διάρκεια των μεγαλύτερων διαλειπουσών περιόδων.
Όλες οι διαδικασίες που βασίζονται σε υπερήχους είναι πλήρως αναπαραγώγιμες και γραμμικά κλιμακούμενες.
Το VialTweeter είναι ένας ομογενοποιητής υπερήχων για ταυτόχρονη, ομοιόμορφη και ταχεία στείρα προετοιμασία πολυάριθμων δειγμάτων.
- Παρασκευή του κυτταρικού εναιωρήματος: Τα σφαιρίδια κυττάρων πρέπει να εναιωρούνται πλήρως σε ρυθμιστικό διάλυμα με ομογενοποίηση (επιλέξτε το ρυθμιστικό διάλυμα που είναι συμβατό με την ακόλουθη ανάλυση, π.χ. ειδική μέθοδο χρωματογραφίας). Προστίθενται λυσοζύμες ή/και άλλα πρόσθετα, εάν χρειάζεται (πρέπει επίσης να είναι συμβατά με τα μέσα διαχωρισμού/καθαρισμού). Αναμίξτε / ομογενοποιήστε το διάλυμα απαλά υπό ήπια υπερήχηση μέχρι να επιτευχθεί πλήρες εναιώρημα.
Διαβάστε περισσότερα για τις συνέργειες των λυσοζύμων σε συνδυασμό με τον ηχοβολισμό! - Λύση με υπερήχους: Τοποθετήστε το δείγμα σε λουτρό πάγου. Για κυτταρική διαταραχή, υπερήχων το εναιώρημα σε εκρήξεις 60-90 δευτερολέπτων (χρησιμοποιώντας τη λειτουργία παλμού του υπερήχων σας).
- Διαχωρισμός: Φυγοκεντρείται το προϊόν λύσης (π.χ. 10 λεπτά στους 10.000 x g, στους 4 βαθμούς Κελσίου). Διαχωρίστε προσεκτικά το υπερκείμενο υγρό από το κυτταρικό σφαιρίδιο. Το υπερκείμενο υγρό είναι το ολικό προϊόν λύσης κυττάρων. Μετά τη διήθηση του υπερκείμενου υγρού, λαμβάνετε ένα διαυγασμένο υγρό της διαλυτής κυτταρικής πρωτεΐνης.
Οι πιο κοινές εφαρμογές για υπερήχους στη βιολογία και τη βιοτεχνολογία είναι:
- Παρασκευή εκχυλίσματος κυττάρων
- Διαταραχή ζυμομυκήτων, βακτηρίων, φυτικών κυττάρων, μαλακού ή σκληρού κυτταρικού ιστού, νουκλεϊκού υλικού
- εκχύλιση πρωτεΐνης
- Παρασκευή και απομόνωση ενζύμων
- Παραγωγή αντιγόνων
- Εξαγωγή DNA ή/και στοχευμένος κατακερματισμός
- Προετοιμασία λιποσωμάτων
Κυτταρική διαταραχή με υπερήχων τύπου καθετήρα είναι μια αποτελεσματική μέθοδος προετοιμασίας δείγματος.
Οι πολλαπλές εφαρμογές των υπερήχων διακλαδίζονται στους τομείς της βιοτεχνολογίας, της εμβιομηχανικής, της μικροβιολογίας, της μοριακής βιολογίας, της βιοχημείας, της ανοσολογίας, της βακτηριολογίας, της ιολογίας, της πρωτεϊνωματικής, της γενετικής, της φυσιολογίας, της κυτταρικής βιολογίας, της αιματολογίας και της βοτανικής.
Λύση: Σπάζοντας τις κυτταρικές δομές
Τα κύτταρα προστατεύονται από μια ημιπερατή μεμβράνη πλάσματος η οποία αποτελείται από μια διπλοστιβάδα φωσφολιπιδίων (επίσης διπλοστιβάδα πρωτεΐνης-λιπιδίων, που σχηματίζεται από υδρόφοβα λιπίδια και υδρόφιλα μόρια φωσφόρου με ενσωματωμένα πρωτεϊνικά μόρια) και δημιουργεί ένα φράγμα μεταξύ του εσωτερικού του κυττάρου (κυτταρόπλασμα) και του εξωκυτταρικού περιβάλλοντος. Τα φυτικά κύτταρα και τα προκαρυωτικά κύτταρα περιβάλλονται από κυτταρικό τοίχωμα. Λόγω των πολλαπλών στρωμάτων παχύ κυτταρικό τοίχωμα της κυτταρίνης, τα φυτικά κύτταρα είναι πιο δύσκολο να λυθούν από τα ζωικά κύτταρα. Το εσωτερικό του κυττάρου, όπως τα οργανίδια, ο πυρήνας, το μιτοχόνδριο, σταθεροποιείται από τον κυτταροσκελετό.
Με τη λύση των κυττάρων, στοχεύει στην εξαγωγή και διαχωρισμό των οργανιδίων, των πρωτεϊνών, του DNA, του mRNA ή άλλων βιομορίων.
Συμβατικές μέθοδοι κυτταρικής λύσης και τα μειονεκτήματά τους
Υπάρχουν διάφορες μέθοδοι για τη λύση των κυττάρων, οι οποίες μπορούν να χωριστούν σε μηχανικές και χημικές μεθόδους, οι οποίες περιλαμβάνουν τη χρήση απορρυπαντικών ή διαλυτών, την εφαρμογή υψηλής πίεσης ή τη χρήση μύλου σφαιριδίων ή γαλλικού τύπου. Το πιο προβληματικό μειονέκτημα αυτών των μεθόδων είναι ο δύσκολος έλεγχος και η προσαρμογή των παραμέτρων της διαδικασίας και, ως εκ τούτου, ο αντίκτυπος.
Ο παρακάτω πίνακας εμφανίζει τα κύρια μειονεκτήματα των κοινών μεθόδων λύσης:
Πίνακας: Οι συμβατικές μέθοδοι κυτταρικής λύσης έχουν σημαντικά μειονεκτήματα
Διαδικασία λύσης
Η λύση είναι μια ευαίσθητη διαδικασία. Κατά τη διάρκεια της λύσης καταστρέφεται η προστασία της κυτταρικής μεμβράνης, ωστόσο πρέπει να αποφευχθεί η αδρανοποίηση, η μετουσίωση και η αποικοδόμηση των εκχυλισμένων πρωτεϊνών από ένα μη φυσιολογικό περιβάλλον (απόκλιση από την τιμή pH). Επομένως, γενικά η λύση πραγματοποιείται σε ρυθμιστικό διάλυμα. Οι περισσότερες δυσκολίες προκύπτουν από ανεξέλεγκτη κυτταρική διαταραχή με αποτέλεσμα τη μη στοχευμένη απελευθέρωση όλου του ενδοκυτταρικού υλικού ή/και τη μετουσίωση του προϊόντος-στόχου.
Συχνές ερωτήσεις σχετικά με κατεργασία με υπερήχους και κυτταρική λύση
- Μπορείτε να λύσετε κύτταρα με υπερήχους; Ναι, κατεργασία με υπερήχους διαλύει αποτελεσματικά τα κύτταρα χρησιμοποιώντας υπερηχητικά κύματα υψηλής συχνότητας που προκαλούν σπηλαίωση, ένα φαινόμενο όπου μικροσκοπικές φυσαλίδες ατμού σχηματίζονται και καταρρέουν βίαια μέσα στο κυτταρικό εναιώρημα. Οι προκύπτουσες μηχανικές δυνάμεις διαταράσσουν τις κυτταρικές μεμβράνες και διευκολύνουν την απελευθέρωση ενδοκυτταρικών συστατικών στο υγρό.
- Πώς να χρησιμοποιήσετε έναν υπερήχων για κυτταρική λύση; Η χρήση ενός υπερήχων για την κυτταρική λύση περιλαμβάνει τη βύθιση του αισθητήρα υπερήχων σε ένα κυτταρικό εναιώρημα και την προσαρμογή παραμέτρων όπως το πλάτος και η διάρκεια παλμού. Η διαδικασία θα πρέπει να παρακολουθείται στενά για τη βελτιστοποίηση της διαταραχής των κυττάρων, ελαχιστοποιώντας παράλληλα τη μετουσίωση των πρωτεϊνών και την αδρανοποίηση των ενζύμων.
- Ποια είναι η αρχή της υπερήχησης για την κυτταρική λύση; Κατεργασία με υπερήχους λειτουργεί με βάση την αρχή της ακουστικής σπηλαίωσης. Η υπερηχητική ενέργεια μεταδίδεται στο υγρό μέσο, προκαλώντας ταχείες διακυμάνσεις πίεσης που οδηγούν στο σχηματισμό και την κατάρρευση μικροφυσαλίδων. Αυτές οι εκρήξεις δημιουργούν έντονες δυνάμεις διάτμησης και τοπικές υψηλές θερμοκρασίες, διαταράσσοντας τις κυτταρικές δομές και ενισχύοντας την ομοιογένεια του προϊόντος λύσης.
- Πόσο διαρκεί η κατεργασία με υπερήχους κυτταρικής λύσης; Η διάρκεια της υπερήχησης για την κυτταρική λύση μπορεί να ποικίλει σημαντικά ανάλογα με παράγοντες όπως ο τύπος του κυττάρου, η πυκνότητα των κυττάρων, η ισχύς των υπερήχων και το συγκεκριμένο πρωτόκολλο που χρησιμοποιείται. Οι τυπικές διαδικασίες μπορεί να κυμαίνονται από μερικά δευτερόλεπτα έως λίγα λεπτά, συχνά εκτελούνται σε κύκλους για τη διαχείριση της παραγωγής θερμότητας και τη διασφάλιση ομοιόμορφης διάσπασης των κυττάρων.
- Ποιος είναι ο σκοπός της υπερήχησης στην εκχύλιση πρωτεϊνών; Στην εκχύλιση πρωτεϊνών, υπερήχηση χρησιμεύει για την αποτελεσματική ρήξη των κυτταρικών μεμβρανών και διαλυτοποίηση πρωτεϊνών. Αυτή η μέθοδος είναι ιδιαίτερα χρήσιμη για την απελευθέρωση πρωτεϊνών από το εσωτερικό των κυτταρικών διαμερισμάτων, καθιστώντας την απαραίτητη για την παρασκευή λυμάτων από τα οποία οι πρωτεΐνες πρόκειται να καθαριστούν ή να αναλυθούν.
- Γιατί χρησιμοποιείται υπερήχηση για εκχύλιση; Κατεργασία με υπερήχους ευνοείται για εκχύλιση λόγω της ταχείας δράσης και της ικανότητάς της να εφαρμόζει στοχευμένη ενέργεια, διασπώντας κυτταρικές δομές για να απελευθερώσει βιοδραστικά μόρια χωρίς τη χρήση σκληρών χημικών επεξεργασιών, διατηρώντας έτσι τη λειτουργική ακεραιότητα των εκχυλισμένων ενώσεων.
- Μήπως υπερήχηση διαταράσσει αλληλεπιδράσεις πρωτεΐνης-πρωτεΐνης? Ενώ κατεργασία με υπερήχους μπορεί να διαταράξει αποτελεσματικά τις κυτταρικές μεμβράνες, μπορεί επίσης να διαταράξει τις αλληλεπιδράσεις πρωτεΐνης-πρωτεΐνης. Το επίπεδο διαταραχής εξαρτάται από την ένταση υπερήχων και τη διάρκεια έκθεσης, οδηγώντας ενδεχομένως σε μετουσίωση ή διάσταση των πρωτεϊνικών συμπλεγμάτων, η οποία μπορεί να επηρεάσει μεταγενέστερες αναλυτικές ή λειτουργικές μελέτες.
- Μπορεί κατεργασία με υπερήχους να χρησιμοποιηθεί για τη λύση του E. coli; Hielscher υπερήχων είναι ιδιαίτερα αποτελεσματική για τη λύση βακτηριακών κυττάρων όπως το E. coli, τα οποία έχουν ισχυρά κυτταρικά τοιχώματα. Η τεχνική παρέχει μια φυσική μέθοδο για τη διάτμηση του κυτταρικού τοιχώματος και της μεμβράνης, καθιστώντας την προτιμώμενη μέθοδο για την παρασκευή βακτηριακών λυμάτων σε εργαστήρια μοριακής βιολογίας και βιοχημείας.
- Ποιες είναι οι επόμενες διεργασίες που ακολουθούν το στάδιο του ηχητικού καθαρισμού;
Τα μεταγενέστερα στάδια μετά τη λύση με υπερήχους περιλαμβάνουν συνήθως την κλασματοποίηση του λυσιλύματος, τη στοχευμένη απομόνωση οργανιδίων και την περαιτέρω εκχύλιση ή καθαρισμό πρωτεϊνών.
Στη συνέχεια, το επεξεργασμένο λυτικό διάλυμα διαχωρίζεται και προετοιμάζεται για αναλυτικές ή λειτουργικές εφαρμογές, όπως πρωτεωμική υψηλής ανάλυσης, μεταγραφομική ή μελέτες δέσμευσης υποδοχέων.
Βιβλιογραφία/Αναφορές
- Balasundaram, B.; Harrison, S.; Bracewell, D. G. (2009): Advances in product release strategies and impact on bioprocess design. Trends in Biotechnology 27/8, 2009. pp. 477-485.
- Vilkhu, K.; Manasseh, R.; Mawson, R.; Ashokkumar, M. (2011): Ultrasonic Recovery and Modification of Food ingredients. In: Feng/ Barbosa-Cánovas/ Weiss (2011): Ultrasound Technologies for Food and Bioprocessing. New York: Springer, 2011. pp. 345-368.
- Nico Böhmer, Andreas Dautel, Thomas Eisele, Lutz Fischer (2012): Recombinant expression, purification and characterisation of the native glutamate racemase from Lactobacillus plantarum NC8. Protein Expr Purif. 2013 Mar;88(1):54-60.
- Brandy Verhalen, Stefan Ernst, Michael Börsch, Stephan Wilkens (2012): Dynamic Ligand-induced Conformational Rearrangements in P-glycoprotein as Probed by Fluorescence Resonance Energy Transfer Spectroscopy. J Biol Chem. 2012 Jan 6;287(2): 1112-27.
- Claudia Lindemann, Nataliya Lupilova, Alexandra Müller, Bettina Warscheid, Helmut E. Meyer, Katja Kuhlmann, Martin Eisenacher, Lars I. Leichert (2013): Redox Proteomics Uncovers Peroxynitrite-Sensitive Proteins that Help Escherichia coli to Overcome Nitrosative Stress. J Biol Chem. 2013 Jul 5; 288(27): 19698–19714.
- Elahe Motevaseli, Mahdieh Shirzad, Seyed Mohammad Akrami, Azam-Sadat Mousavi, Akbar Mirsalehian, Mohammad Hossein Modarressi (2013): Normal and tumour cervical cells respond differently to vaginal lactobacilli, independent of pH and lactate. ed Microbiol. 2013 Jul; 62(Pt 7):1065-1072.