Κατεργασία με υπερήχους για κυτταρική λύση: Κυτταρική διάρρηξη και εκχύλιση
Η κυτταρική λύση με υπερήχους είναι μια ευρέως εφαρμοζόμενη τεχνική προετοιμασίας δειγμάτων στα σύγχρονα εργαστήρια βιοτεχνολογίας. Πρωταρχικός σκοπός της είναι η διάρρηξη των κυτταρικών μεμβρανών ή ολόκληρων κυττάρων, ώστε να απελευθερωθούν ενδοκυτταρικά συστατικά, όπως πρωτεΐνες, νουκλεϊκά οξέα ή οργανίδια. Στην καθημερινή εργαστηριακή εργασία, αυτό σημαίνει ότι η κατεργασία με υπερήχους αποτελεί καθιερωμένη μέθοδο για την ελεγχόμενη κυτταρική διάρρηξη και την αποδοτική εκχύλιση βιομορίων. Το βασικό πλεονέκτημα των συσκευών υπερήχων έγκειται στην ικανότητά τους να ρυθμίζουν με ακρίβεια κρίσιμες παραμέτρους της διεργασίας, όπως την ένταση των υπερήχων, την παλμική λειτουργία και τον έλεγχο της θερμοκρασίας. Ο έλεγχος αυτός επιτρέπει στους ερευνητές να επιτυγχάνουν αξιόπιστη λύση, ελαχιστοποιώντας παράλληλα τη θερμική ή μηχανική βλάβη σε ευαίσθητα βιομόρια, με αποτέλεσμα μια ήπια αλλά εξαιρετικά αποδοτική διεργασία εκχύλισης.
Κυτταρική λύση με συσκευές υπερήχων
Η κυτταρική λύση με υπερήχους αξιοποιεί την ακουστική σπηλαίωση για τη διάρρηξη των κυτταρικών μεμβρανών και την απελευθέρωση ενδοκυτταρικών μορίων. Η Hielscher Ultrasonics προσφέρει την κλασική συσκευή υπερήχων τύπου ακίδας, καθώς και συσκευές υπερήχων πολλαπλών δειγμάτων για στείρα επεξεργασία: το VialTweeter για πολλαπλά σωληνάρια και φιαλίδια και τη συσκευή υπερήχων πλακών 96 φρεατίων UIP400MTP για τυποποιημένες μικροπλάκες.
Η Hielscher Ultrasonics παρέχει ισχυρές συσκευές υπερήχων χωρίς επαφή για την προετοιμασία δειγμάτων και την κλινική ανάλυση. Η συσκευή υπερήχων πλακών πολλαπλών φρεατίων UIP400MTP, το VialTweeter, το CupHorn και η συσκευή υπερήχων ροής GDmini2 επεξεργάζονται τα δείγματα υπό στείρες συνθήκες.
Ομογενοποιητές υπερήχων UP100H (100 watts) και UP400St (400 watts): Κατεργασία με υπερήχους για κυτταρική λύση και εκχύλιση.
Ομογενοποιητές υπερήχων για κυτταρική λύση και εκχύλιση
| Τύπος συσκευής υπερήχων | Κύρια εφαρμογή | Όγκος δείγματος | Τυπική περίπτωση χρήσης | Πλεονεκτήματα | Ενδεικτικά μοντέλα |
|---|---|---|---|---|---|
| Συσκευές υπερήχων τύπου ακίδας | Κατεργασία με υπερήχους ενός μεμονωμένου δείγματος | 0,1 mL έως ~1000 mL | Κυτταρική λύση, εκχύλιση πρωτεϊνών, κατακερματισμός DNA/RNA | Ακριβής έλεγχος της ενέργειας· διάφορα ηχοτρόδια· βέλτιστη επιλογή για μικρά έως μεσαία δείγματα | UP100H, UP200St, UP400St |
| VialTweeter / CupHorn | Παράλληλη επεξεργασία πολλαπλών σφραγισμένων φιαλιδίων | 8–10 φιαλίδια (~1–20 mL το καθένα) | Τυποποιημένη λύση πολλαπλών κυτταρικών εναιωρημάτων | Ομοιόμορφη κατεργασία με υπερήχους· αποφυγή διασταυρούμενης επιμόλυνσης· αναπαραγώγιμα αποτελέσματα | VialTweeter, CupHorn |
| Συσκευή υπερήχων πλακών 96 φρεατίων | Κατεργασία με υπερήχους πλακών πολλαπλών φρεατίων και πλακών μικροτιτλοδότησης | Μορφή μικροπλάκας | Διαλογή υψηλής διεκπεραιωτικής ικανότητας, πρωτεωμική, κυτταρικές δοκιμασίες | Ταυτόχρονη, ομοιόμορφη κατεργασία με υπερήχους σε όλα τα φρεάτια· ιδανική για ροές εργασίας με πολλαπλά δείγματα | UIP400MTP |
| Αντιδραστήρες με κυψελίδα ροής | Συνεχής κατεργασία με υπερήχους για μεγαλύτερους όγκους | >1 L, με δυνατότητα κλιμάκωσης | Κυτταρική διάρρηξη σε βιομηχανική κλίμακα, παραγωγή εκχυλισμάτων | Συνεχής επεξεργασία· δυνατότητα κλιμάκωσης· πλήρης έλεγχος της διεργασίας (πλάτος ταλάντωσης, πίεση, θερμοκρασία) | UIP1000hdT, UIP2000hdT + κυψελίδα ροής |
| Συστήματα στείρας / έμμεσης κατεργασίας με υπερήχους | Επεξεργασία δειγμάτων χωρίς επιμόλυνση | Εξαρτάται από το φιαλίδιο/σωληνάριο/τη μικροπλάκα | Ευαίσθητα δείγματα, στείρα περιβάλλοντα, περιβάλλοντα με κανονιστικές απαιτήσεις | Χωρίς επαφή με την ακίδα· αποφυγή μεταφοράς υπολειμμάτων μεταξύ δειγμάτων· ελάχιστη προσπάθεια καθαρισμού | VialTweeter, CupHorn, UIP400MTP |
Πλεονεκτήματα της χρήσης κατεργασίας με υπερήχους για κυτταρική λύση
Σε σύγκριση με άλλες μεθόδους κυτταρικής λύσης και εκχύλισης, η κυτταρική λύση με υπερήχους έχει αρκετά πλεονεκτήματα:
- Ταχύτητα: Η κυτταρική λύση και εκχύλιση με υπερήχους είναι μια γρήγορη μέθοδος που μπορεί να διαρρήξει τα κύτταρα μέσα σε λίγα δευτερόλεπτα. Είναι πολύ ταχύτερη από άλλες μεθόδους, όπως η ομογενοποίηση, η κατάψυξη–απόψυξη ή η άλεση με σφαιρίδια.
- Αποδοτικότητα: Η κυτταρική λύση και εκχύλιση με υπερήχους μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την επεξεργασία μικρών, μεγάλων ή πολλαπλών δειγμάτων ταυτόχρονα, γεγονός που την καθιστά αποδοτικότερη από άλλες μεθόδους που απαιτούν μεμονωμένη επεξεργασία μικρών δειγμάτων.
- Χωρίς χημικά: Η κυτταρική λύση και εκχύλιση με υπερήχους είναι μια μη επεμβατική μέθοδος που δεν απαιτεί τη χρήση δραστικών χημικών ή ενζύμων. Αυτό την καθιστά ιδανική για εφαρμογές στις οποίες πρέπει να διατηρείται η ακεραιότητα του κυτταρικού περιεχομένου. Η ανεπιθύμητη επιμόλυνση των δειγμάτων μπορεί να αποφευχθεί.
- Υψηλή απόδοση: Η κυτταρική λύση και εκχύλιση με υπερήχους μπορεί να εκχυλίσει κυτταρικό περιεχόμενο με υψηλή απόδοση, συμπεριλαμβανομένων του DNA, του RNA και των πρωτεϊνών. Αυτό συμβαίνει επειδή τα ηχητικά κύματα υψηλής συχνότητας διαρρηγνύουν τα κυτταρικά τοιχώματα και απελευθερώνουν το περιεχόμενο στο περιβάλλον διάλυμα.
- Έλεγχος θερμοκρασίας: Οι προηγμένες συσκευές υπερήχων επιτρέπουν τον ακριβή έλεγχο της θερμοκρασίας του δείγματος. Οι ψηφιακές συσκευές υπερήχων της Hielscher διαθέτουν συνδεόμενο αισθητήρα θερμοκρασίας και λογισμικό παρακολούθησης της θερμοκρασίας.
- Αναπαραγωγιμότητα: Τα πρωτόκολλα κυτταρικής λύσης με υπερήχους μπορούν να αναπαραχθούν εύκολα και ακόμη και να προσαρμοστούν σε διαφορετικούς, μεγαλύτερους ή μικρότερους όγκους δείγματος με μια απλή γραμμική αύξηση της κλίμακας.
- Ευελιξία: Η κυτταρική λύση και εκχύλιση με υπερήχους μπορεί να χρησιμοποιηθεί για εκχύλιση από ένα ευρύ φάσμα κυτταρικών τύπων, συμπεριλαμβανομένων βακτηρίων, ζυμών, μυκήτων, φυτικών κυττάρων και κυττάρων θηλαστικών. Μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί για την εκχύλιση διαφορετικών τύπων μορίων, συμπεριλαμβανομένων πρωτεϊνών, DNA, RNA και λιπιδίων.
- Ταυτόχρονη προετοιμασία πολυάριθμων δειγμάτων: Η Hielscher Ultrasonics προσφέρει αρκετές λύσεις για την άνετη επεξεργασία πολυάριθμων δειγμάτων υπό ακριβώς τις ίδιες συνθήκες διεργασίας. Αυτό καθιστά το στάδιο της λύσης και εκχύλισης κατά την προετοιμασία των δειγμάτων εξαιρετικά αποδοτικό και εξοικονομεί χρόνο.
- Ευκολία χρήσης: Ο εξοπλισμός κυτταρικής λύσης και εκχύλισης με υπερήχους είναι εύχρηστος και απαιτεί ελάχιστη εκπαίδευση. Ο εξοπλισμός είναι επίσης οικονομικός, καθώς αποτελεί εφάπαξ επένδυση χωρίς να απαιτείται επαναγορά αναλώσιμων ειδών μίας χρήσης. Αυτό τον καθιστά ελκυστικό για ένα ευρύ φάσμα ερευνητών και εργαστηρίων.
Συνολικά, η κυτταρική λύση και εκχύλιση με υπερήχους είναι μια ταχεία, αποδοτική, ελεγχόμενη με ακρίβεια και ευέλικτη μέθοδος εκχύλισης του κυτταρικού περιεχομένου. Τα πλεονεκτήματά της έναντι εναλλακτικών μεθόδων την καθιστούν ελκυστική επιλογή για ένα ευρύ φάσμα ερευνητικών και βιομηχανικών εφαρμογών.
Αρχή λειτουργίας της κυτταρικής λύσης με υπερήχους
Η κυτταρική λύση και εκχύλιση με υπερήχους χρησιμοποιεί ηχητικά κύματα υψηλής συχνότητας για τη διάρρηξη των κυττάρων και την εκχύλιση του περιεχομένου τους. Τα ηχητικά κύματα δημιουργούν μεταβολές πίεσης στο περιβάλλον υγρό, προκαλώντας τον σχηματισμό και την κατάρρευση μικρών φυσαλίδων μέσω μιας διεργασίας γνωστής ως σπηλαίωση. Οι φυσαλίδες αυτές δημιουργούν τοπικά μηχανικές δυνάμεις πολύ υψηλής έντασης, οι οποίες μπορούν να διαρρήξουν τα κύτταρα και να απελευθερώσουν το περιεχόμενό τους στο περιβάλλον διάλυμα.
Η κυτταρική λύση με συσκευή υπερήχων συνήθως περιλαμβάνει τα ακόλουθα βήματα:
- Το δείγμα τοποθετείται σε σωληνάριο ή δοχείο με υγρό ρυθμιστικό διάλυμα.
- Ένας καθετήρας υπερήχων εισάγεται στο δείγμα και εφαρμόζονται ηχητικά κύματα υψηλής συχνότητας, περίπου 20–30 kHz.
- Τα κύματα υπερήχων προκαλούν ταλάντωση και σπηλαίωση στο περιβάλλον υγρό, δημιουργώντας τοπικές δυνάμεις που διαρρηγνύουν τα κύτταρα και απελευθερώνουν το περιεχόμενό τους.
- Το δείγμα φυγοκεντρείται ή διηθείται για την απομάκρυνση τυχόν κυτταρικών υπολειμμάτων και το εκχυλισμένο περιεχόμενο συλλέγεται για επακόλουθη ανάλυση.
Μειονεκτήματα των συνήθων μεθόδων λύσης
Κατά την εργασία σας σε εργαστήρια, ενδέχεται να έχετε ήδη αντιμετωπίσει τις δυσκολίες της κυτταρικής λύσης με παραδοσιακά πρωτόκολλα μηχανικής ή χημικής λύσης.
- Μηχανική λύση: Οι μέθοδοι μηχανικής λύσης, όπως η άλεση με γουδί και γουδοχέρι ή η ομογενοποίηση με πρέσα French, σφαιρόμυλο ή σύστημα ρότορα–στάτορα, συχνά δεν διαθέτουν δυνατότητες ακριβούς ελέγχου και ρύθμισης. Αυτό σημαίνει ότι η χρήση άλεσης και λειοτρίβησης μπορεί να δημιουργήσει γρήγορα θερμότητα και δυνάμεις διάτμησης που μπορούν να βλάψουν το δείγμα και να μετουσιώσουν τις πρωτεΐνες. Μπορεί επίσης να είναι χρονοβόρες και να απαιτούν μεγάλες ποσότητες αρχικού υλικού.
- Χημική λύση: Οι μέθοδοι χημικής λύσης, όπως η λύση με απορρυπαντικά, μπορούν να βλάψουν το δείγμα διαταράσσοντας τη λιπιδική διπλοστιβάδα και μετουσιώνοντας τις πρωτεΐνες. Μπορεί επίσης να απαιτούν πολλαπλά βήματα και ενδέχεται να αφήνουν υπολειμματικούς επιμολυντές που παρεμβαίνουν στις επακόλουθες εφαρμογές. Η εύρεση της βέλτιστης δοσολογίας απορρυπαντικού αποτελεί πρόσθετη πρόκληση.
- Κύκλοι κατάψυξης–απόψυξης: Οι κύκλοι κατάψυξης–απόψυξης μπορούν να προκαλέσουν ρήξη των κυτταρικών μεμβρανών, αλλά οι επαναλαμβανόμενοι κύκλοι μπορούν επίσης να προκαλέσουν μετουσίωση και αποικοδόμηση των πρωτεϊνών. Η μέθοδος αυτή μπορεί επίσης να απαιτεί πολλαπλούς κύκλους, κάτι που μπορεί να είναι χρονοβόρο και συχνά οδηγεί σε χαμηλότερες αποδόσεις.
- Ενζυμική λύση: Οι μέθοδοι ενζυμικής λύσης μπορεί να είναι ειδικές για ορισμένους κυτταρικούς τύπους και να απαιτούν πολλά στάδια, γεγονός που τις καθιστά χρονοβόρες. Παράγουν επίσης απόβλητα και απαιτούν προσεκτική βελτιστοποίηση για την αποφυγή της αποδόμησης του δείγματος. Τα κιτ ενζυμικής λύσης είναι συχνά ακριβά. Εάν η τρέχουσα διαδικασία ενζυμικής λύσης που χρησιμοποιείτε δίνει ανεπαρκή αποτελέσματα, η κατεργασία με υπερήχους μπορεί να εφαρμοστεί ως συνεργιστική μέθοδος για την ενίσχυση της κυτταρικής διάρρηξης.
Σε αντίθεση με τις συμβατικές μηχανικές και χημικές μεθόδους κυτταρικής λύσης, η κατεργασία με υπερήχους είναι ένα πολύ αποτελεσματικό και αξιόπιστο εργαλείο για την αποδιάρθρωση των κυττάρων, το οποίο επιτρέπει τον πλήρη έλεγχο των παραμέτρων της κατεργασίας με υπερήχους. Αυτό εξασφαλίζει υψηλή εκλεκτικότητα ως προς την απελευθέρωση υλικών και υψηλή καθαρότητα του προϊόντος. [πρβλ. Balasundaram et al., 2009]
Είναι κατάλληλη για όλους τους κυτταρικούς τύπους και εφαρμόζεται εύκολα σε μικρή και μεγάλη κλίμακα – πάντοτε υπό ελεγχόμενες συνθήκες. Οι συσκευές υπερήχων καθαρίζονται εύκολα. Ένας ομογενοποιητής υπερήχων διαθέτει πάντοτε λειτουργία επιτόπιου καθαρισμού (CIP) και επιτόπιας αποστείρωσης (SIP). Το ηχοτρόδιο αποτελείται από ένα συμπαγές ακουστικό κέρας από τιτάνιο, το οποίο μπορεί να καθαριστεί με σκούπισμα ή έκπλυση με νερό ή διαλύτη (ανάλογα με το μέσο εργασίας). Λόγω της ανθεκτικότητάς τους, οι απαιτήσεις συντήρησης των συσκευών υπερήχων είναι σχεδόν αμελητέες.
Λύση με υπερήχους και κυτταρική διάρρηξη
Γενικά, η λύση των δειγμάτων στο εργαστήριο διαρκεί από 15 δευτερόλεπτα έως 2 λεπτά. Καθώς η ένταση της κατεργασίας με υπερήχους ρυθμίζεται πολύ εύκολα μέσω της ρύθμισης του πλάτους και του χρόνου κατεργασίας με υπερήχους, καθώς και μέσω της επιλογής του κατάλληλου εξοπλισμού, είναι δυνατή η διάρρηξη των κυτταρικών μεμβρανών με πολύ ήπιο ή πολύ απότομο τρόπο, ανάλογα με την κυτταρική δομή και τον σκοπό της λύσης (π.χ. η εκχύλιση DNA απαιτεί ηπιότερη κατεργασία με υπερήχους, ενώ η πλήρης εκχύλιση πρωτεϊνών από βακτήρια απαιτεί εντονότερη κατεργασία με υπερήχους). Η θερμοκρασία κατά τη διάρκεια της διεργασίας μπορεί να παρακολουθείται με ενσωματωμένο αισθητήρα θερμοκρασίας και να ελέγχεται εύκολα με ψύξη (λουτρό πάγου ή κυψελίδες ροής με μανδύες ψύξης) ή με κατεργασία με υπερήχους σε παλμική λειτουργία. Κατά την κατεργασία με υπερήχους σε παλμική λειτουργία, οι σύντομοι κύκλοι παλμών υπερήχων διάρκειας 1–15 δευτερολέπτων επιτρέπουν την απαγωγή θερμότητας και την ψύξη κατά τα μεγαλύτερα ενδιάμεσα διαστήματα.
Όλες οι διεργασίες που βασίζονται σε υπερήχους είναι πλήρως αναπαραγώγιμες και μπορούν να κλιμακωθούν γραμμικά.
Το VialTweeter είναι ένας ομογενοποιητής υπερήχων για την ταυτόχρονη, ομοιόμορφη και ταχεία προετοιμασία πολυάριθμων δειγμάτων υπό στείρες συνθήκες.
- Προετοιμασία του κυτταρικού εναιωρήματος: Τα κυτταρικά ιζήματα πρέπει να εναιωρηθούν πλήρως σε ρυθμιστικό διάλυμα μέσω ομογενοποίησης (επιλέξτε ρυθμιστικό διάλυμα συμβατό με την ανάλυση που θα ακολουθήσει, π.χ. με μια συγκεκριμένη χρωματογραφική μέθοδο). Προσθέστε λυσοζύμες και/ή άλλα πρόσθετα, εάν χρειάζεται (πρέπει επίσης να είναι συμβατά με τα μέσα διαχωρισμού/καθαρισμού). Αναμείξτε/ομογενοποιήστε απαλά το διάλυμα με ήπια κατεργασία με υπερήχους, έως ότου επιτευχθεί πλήρης εναιώρηση.
Διαβάστε περισσότερα για τις συνέργειες των λυσοζυμών σε συνδυασμό με την κατεργασία με υπερήχους! - Λύση με υπερήχους: Τοποθετήστε το δείγμα σε λουτρό πάγου. Για την κυτταρική διάρρηξη, υποβάλετε το εναιώρημα σε κατεργασία με υπερήχους σε παλμούς διάρκειας 60–90 δευτερολέπτων (χρησιμοποιώντας την παλμική λειτουργία της συσκευής υπερήχων σας).
- Διαχωρισμός: Φυγοκεντρήστε το κυτταρικό λύμα (π.χ. για 10 min. στα 10.000 x g, στους 4degC). Διαχωρίστε προσεκτικά το υπερκείμενο από το κυτταρικό ίζημα. Το υπερκείμενο είναι το ολικό κυτταρικό λύμα. Μετά τη διήθηση του υπερκειμένου, λαμβάνετε ένα διαυγασμένο υγρό που περιέχει τη διαλυτή κυτταρική πρωτεΐνη.
Οι συνηθέστερες εφαρμογές των συσκευών υπερήχων στη βιολογία και τη βιοτεχνολογία είναι:
- Παρασκευή κυτταρικών εκχυλισμάτων
- Διάρρηξη ζυμομυκήτων, βακτηρίων, φυτικών κυττάρων, μαλακού ή σκληρού κυτταρικού ιστού, υλικού νουκλεϊκών οξέων
- Εκχύλιση πρωτεϊνών
- Παρασκευή και απομόνωση ενζύμων
- Παραγωγή αντιγόνων
- Εκχύλιση DNA και/ή στοχευμένος κατακερματισμός
- Παρασκευή λιποσωμάτων
Η κυτταρική διάρρηξη με συσκευή υπερήχων τύπου καθετήρα είναι μια αποτελεσματική μέθοδος προετοιμασίας δειγμάτων.
Οι πολυάριθμες εφαρμογές των υπερήχων εκτείνονται στους τομείς της βιοτεχνολογίας, της βιομηχανικής, της μικροβιολογίας, της μοριακής βιολογίας, της βιοχημείας, της ανοσολογίας, της βακτηριολογίας, της ιολογίας, της πρωτεωμικής, της γενετικής, της φυσιολογίας, της κυτταρικής βιολογίας, της αιματολογίας και της βοτανικής.
Λύση: Διάσπαση κυτταρικών δομών
Τα κύτταρα προστατεύονται από μια ημιπερατή πλασματική μεμβράνη, η οποία αποτελείται από μια φωσφολιπιδική διπλοστιβάδα (επίσης πρωτεϊνολιπιδική διπλοστιβάδα· σχηματίζεται από υδρόφοβα λιπίδια και υδρόφιλα μόρια φωσφόρου με ενσωματωμένα πρωτεϊνικά μόρια) και δημιουργεί έναν φραγμό μεταξύ του εσωτερικού των κυττάρων (κυτταρόπλασμα) και του εξωκυττάριου περιβάλλοντος. Τα φυτικά και τα προκαρυωτικά κύτταρα περιβάλλονται από κυτταρικό τοίχωμα. Λόγω του κυτταρικού τοιχώματος από κυτταρίνη, το οποίο έχει πάχος πολλών στρώσεων, τα φυτικά κύτταρα λύονται δυσκολότερα από τα ζωικά κύτταρα. Το εσωτερικό του κυττάρου, όπως τα οργανίδια, ο πυρήνας και το μιτοχόνδριο, σταθεροποιείται από τον κυτταροσκελετό.
Η λύση των κυττάρων αποσκοπεί στην εκχύλιση και στον διαχωρισμό των οργανιδίων, των πρωτεϊνών, του DNA, του mRNA ή άλλων βιομορίων.
Συμβατικές μέθοδοι κυτταρικής λύσης και τα μειονεκτήματά τους
Υπάρχουν διάφορες μέθοδοι λύσης των κυττάρων, οι οποίες διακρίνονται σε μηχανικές και χημικές και περιλαμβάνουν τη χρήση απορρυπαντικών ή διαλυτών, την εφαρμογή υψηλής πίεσης ή τη χρήση σφαιρόμυλου ή πρέσας French. Το πλέον προβληματικό μειονέκτημα αυτών των μεθόδων είναι η δυσκολία ελέγχου και ρύθμισης των παραμέτρων της διεργασίας και, κατά συνέπεια, της επίδρασής της.
Ο παρακάτω πίνακας παρουσιάζει τα κύρια μειονεκτήματα των συνήθων μεθόδων λύσης:
Πίνακας: Οι συμβατικές μέθοδοι κυτταρικής λύσης έχουν σημαντικά μειονεκτήματα
Διαδικασία λύσης
Η λύση είναι μια ευαίσθητη διεργασία. Κατά τη λύση καταστρέφεται η προστασία που παρέχει η κυτταρική μεμβράνη, ωστόσο πρέπει να αποτρέπονται η αδρανοποίηση, η μετουσίωση και η αποδόμηση των εκχυλισμένων πρωτεϊνών λόγω μη φυσιολογικού περιβάλλοντος (απόκλιση από την τιμή του pH). Επομένως, η λύση πραγματοποιείται γενικά σε ρυθμιστικό διάλυμα. Οι περισσότερες δυσκολίες προκύπτουν από την ανεξέλεγκτη κυτταρική διάρρηξη, η οποία έχει ως αποτέλεσμα τη μη στοχευμένη απελευθέρωση όλου του ενδοκυττάριου υλικού ή/και τη μετουσίωση του προϊόντος-στόχου.
Συχνές ερωτήσεις σχετικά με την κατεργασία με υπερήχους και την κυτταρική λύση
- Μπορούν να λυθούν κύτταρα με κατεργασία με υπερήχους; Ναι, η κατεργασία με υπερήχους επιτυγχάνει αποτελεσματικά τη λύση των κυττάρων χρησιμοποιώντας υπερηχητικά κύματα υψηλής συχνότητας που προκαλούν σπηλαίωση, ένα φαινόμενο κατά το οποίο σχηματίζονται μικροσκοπικές φυσαλίδες ατμού και καταρρέουν βίαια μέσα στο κυτταρικό εναιώρημα. Οι μηχανικές δυνάμεις που προκύπτουν διαρρηγνύουν τις κυτταρικές μεμβράνες και διευκολύνουν την απελευθέρωση των ενδοκυττάριων συστατικών στο υγρό.
- Πώς χρησιμοποιείται μια συσκευή υπερήχων για κυτταρική λύση; Η χρήση μιας συσκευής υπερήχων για κυτταρική λύση περιλαμβάνει την εμβάπτιση του καθετήρα της συσκευής σε κυτταρικό εναιώρημα και τη ρύθμιση παραμέτρων όπως το πλάτος ταλάντωσης και η διάρκεια των παλμών. Η διεργασία πρέπει να παρακολουθείται στενά για τη βελτιστοποίηση της κυτταρικής διάρρηξης, με παράλληλη ελαχιστοποίηση της μετουσίωσης των πρωτεϊνών και της αδρανοποίησης των ενζύμων.
- Ποια είναι η αρχή λειτουργίας της κατεργασίας με υπερήχους για κυτταρική λύση; Η κατεργασία με υπερήχους βασίζεται στην αρχή της ακουστικής σπηλαίωσης. Η ενέργεια των υπερήχων μεταδίδεται στο υγρό μέσο, προκαλώντας ταχείες διακυμάνσεις της πίεσης που οδηγούν στον σχηματισμό και στην ενδόρρηξη μικροφυσαλίδων. Αυτές οι ενδορρήξεις δημιουργούν έντονες δυνάμεις διάτμησης και τοπικά υψηλές θερμοκρασίες, διαρρηγνύοντας τις κυτταρικές δομές και ενισχύοντας την ομοιογένεια του κυτταρικού λύματος.
- Πόσο διαρκεί η κατεργασία με υπερήχους για κυτταρική λύση; Η διάρκεια της κατεργασίας με υπερήχους για κυτταρική λύση μπορεί να ποικίλλει σημαντικά ανάλογα με παράγοντες όπως ο τύπος και η πυκνότητα των κυττάρων, η ισχύς της συσκευής υπερήχων και το συγκεκριμένο πρωτόκολλο που χρησιμοποιείται. Οι συνήθεις διαδικασίες ενδέχεται να διαρκούν από αρκετά δευτερόλεπτα έως λίγα λεπτά και συχνά εκτελούνται σε κύκλους για τη διαχείριση της παραγωγής θερμότητας και τη διασφάλιση ομοιόμορφης κυτταρικής διάρρηξης.
- Ποιος είναι ο σκοπός της κατεργασίας με υπερήχους στην εκχύλιση πρωτεϊνών; Στην εκχύλιση πρωτεϊνών, η κατεργασία με υπερήχους χρησιμεύει στην αποτελεσματική ρήξη των κυτταρικών μεμβρανών και στη διαλυτοποίηση των πρωτεϊνών. Αυτή η μέθοδος είναι ιδιαίτερα χρήσιμη για την απελευθέρωση πρωτεϊνών από το εσωτερικό των κυτταρικών διαμερισμάτων, γεγονός που την καθιστά απαραίτητη για την παρασκευή κυτταρικών λυμάτων από τα οποία πρόκειται να καθαριστούν ή να αναλυθούν πρωτεΐνες.
- Γιατί χρησιμοποιείται η κατεργασία με υπερήχους για εκχύλιση; Η κατεργασία με υπερήχους προτιμάται για την εκχύλιση λόγω της ταχείας δράσης της και της ικανότητάς της να εφαρμόζει στοχευμένα ενέργεια, διασπώντας τις κυτταρικές δομές για την απελευθέρωση βιοδραστικών μορίων χωρίς τη χρήση δραστικών χημικών κατεργασιών, διατηρώντας έτσι τη λειτουργική ακεραιότητα των εκχυλισμένων ενώσεων.
- Διαταράσσει η κατεργασία με υπερήχους τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ πρωτεϊνών; Ενώ η κατεργασία με υπερήχους μπορεί να διαρρήξει αποτελεσματικά τις κυτταρικές μεμβράνες, μπορεί επίσης να διαταράξει τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ πρωτεϊνών. Ο βαθμός διατάραξης εξαρτάται από την ένταση της κατεργασίας με υπερήχους και τη διάρκεια έκθεσης, με πιθανό αποτέλεσμα τη μετουσίωση ή τη διάσταση των πρωτεϊνικών συμπλόκων, γεγονός που ενδέχεται να επηρεάσει τις επακόλουθες αναλυτικές ή λειτουργικές μελέτες.
- Μπορεί η κατεργασία με υπερήχους να χρησιμοποιηθεί για τη λύση κυττάρων E. coli; Οι συσκευές υπερήχων της Hielscher είναι ιδιαίτερα αποτελεσματικές για τη λύση βακτηριακών κυττάρων όπως τα E. coli, τα οποία διαθέτουν ανθεκτικά κυτταρικά τοιχώματα. Η τεχνική παρέχει μια φυσική μέθοδο διάρρηξης του κυτταρικού τοιχώματος και της μεμβράνης μέσω διάτμησης, γεγονός που την καθιστά προτιμώμενη μέθοδο για την παρασκευή βακτηριακών λυμάτων σε εργαστήρια μοριακής βιολογίας και βιοχημείας.
- Ποιες διεργασίες ακολουθούν το στάδιο της κατεργασίας με υπερήχους;
Τα επακόλουθα στάδια μετά τη λύση με υπερήχους περιλαμβάνουν συνήθως την κλασμάτωση του κυτταρικού λύματος, τη στοχευμένη απομόνωση οργανιδίων και την περαιτέρω εκχύλιση ή τον καθαρισμό πρωτεϊνών.
Το επεξεργασμένο κυτταρικό λύμα στη συνέχεια διαχωρίζεται και προετοιμάζεται για αναλυτικές ή λειτουργικές εφαρμογές, όπως η πρωτεωμική υψηλής ανάλυσης, η μεταγραφωμική ή οι μελέτες δέσμευσης σε υποδοχείς.
Βιβλιογραφία/Αναφορές
- Balasundaram, B.; Harrison, S.; Bracewell, D. G. (2009): Advances in product release strategies and impact on bioprocess design. Trends in Biotechnology 27/8, 2009. pp. 477-485.
- Vilkhu, K.; Manasseh, R.; Mawson, R.; Ashokkumar, M. (2011): Ultrasonic Recovery and Modification of Food ingredients. In: Feng/ Barbosa-Cánovas/ Weiss (2011): Ultrasound Technologies for Food and Bioprocessing. New York: Springer, 2011. pp. 345-368.
- Nico Böhmer, Andreas Dautel, Thomas Eisele, Lutz Fischer (2012): Recombinant expression, purification and characterisation of the native glutamate racemase from Lactobacillus plantarum NC8. Protein Expr Purif. 2013 Mar;88(1):54-60.
- Brandy Verhalen, Stefan Ernst, Michael Börsch, Stephan Wilkens (2012): Dynamic Ligand-induced Conformational Rearrangements in P-glycoprotein as Probed by Fluorescence Resonance Energy Transfer Spectroscopy. J Biol Chem. 2012 Jan 6;287(2): 1112-27.
- Claudia Lindemann, Nataliya Lupilova, Alexandra Müller, Bettina Warscheid, Helmut E. Meyer, Katja Kuhlmann, Martin Eisenacher, Lars I. Leichert (2013): Redox Proteomics Uncovers Peroxynitrite-Sensitive Proteins that Help Escherichia coli to Overcome Nitrosative Stress. J Biol Chem. 2013 Jul 5; 288(27): 19698–19714.
- Elahe Motevaseli, Mahdieh Shirzad, Seyed Mohammad Akrami, Azam-Sadat Mousavi, Akbar Mirsalehian, Mohammad Hossein Modarressi (2013): Normal and tumour cervical cells respond differently to vaginal lactobacilli, independent of pH and lactate. ed Microbiol. 2013 Jul; 62(Pt 7):1065-1072.