Κατεργασία με υπερήχους για λύση: Διαταραχή κυττάρων και εκχύλιση

Η αποσύνθεση ή λύση κυττάρων είναι ένα κοινό μέρος της καθημερινής προετοιμασίας δειγμάτων σε εργαστήρια βιοτεχνολογίας. Ο στόχος της λύσης είναι να διαταράξει τμήματα του κυτταρικού τοιχώματος ή ολόκληρου του κυττάρου για να απελευθερώσει βιολογικά μόρια. Οι ομογενοποιητές υπερήχων χρησιμοποιούνται ευρέως για επιτυχή λύση κυττάρων. Το κύριο πλεονέκτημα των εξελιγμένων υπερήχων είναι ο ακριβής έλεγχος των παραμέτρων της διαδικασίας όπως η ένταση και η θερμοκρασία, η οποία επιτρέπει μια ήπια, αλλά εξαιρετικά αποτελεσματική διαταραχή και εκχύλιση κυττάρων.

Κυτταρική λύση με υπερήχους

Υπερήχων κυτταρική λύση και εκχύλιση είναι μια μέθοδος που χρησιμοποιείται για να σπάσει τα ανοιχτά κύτταρα και να εξαγάγετε το περιεχόμενο χρησιμοποιώντας ηχητικά κύματα υψηλής συχνότητας, δηλαδή υπερήχους. Κατεργασία με υπερήχους είναι μια τεχνική λύσης, η οποία χρησιμοποιείται ευρέως ως καθιερωμένη και αξιόπιστη μέθοδος κυτταρικής διάσπασης και εκχύλισης ενδοκυτταρικού υλικού. Η λύση με υπερήχους είναι μια αξιόπιστη τεχνική για την παρασκευή λύσης π.χ. πλασμίδιο, δοκιμές υποδοχέων, πρωτεΐνες, DNA, RNA κ.λπ. Καθώς η ένταση υπερήχων μπορεί να ισοπεδωθεί ρυθμίζοντας τις παραμέτρους της διαδικασίας, η βέλτιστη ένταση υπερήχων από πολύ μαλακή έως έντονη μπορεί να ρυθμιστεί ξεχωριστά για κάθε ουσία και μέσο για να ικανοποιήσει συγκεκριμένες απαιτήσεις εφαρμογής. Τα επόμενα βήματα της λύσης είναι η κλασμάτωση, η απομόνωση των οργανιδίων ή/και η εκχύλιση και ο καθαρισμός πρωτεϊνών. Το εξαγόμενο υλικό (= προϊόν λύσης) πρέπει να διαχωριστεί και υπόκειται σε περαιτέρω έρευνες ή εφαρμογές, π.χ. για πρωτεωμική έρευνα.

Σε σύγκριση με άλλες μεθόδους λύσης κυττάρων και εκχύλισης, η λύση κυττάρων υπερήχων έχει πολλά πλεονεκτήματα:

1. Ταχύτητα: Υπερήχων λύση κυττάρων και εκχύλιση είναι μια γρήγορη μέθοδος που μπορεί να σπάσει τα ανοιχτά κύτταρα μέσα σε λίγα δευτερόλεπτα. Αυτό είναι πολύ πιο γρήγορο από άλλες μεθόδους όπως ομογενοποίηση, απόψυξη κατάψυξης ή φρεζάρισμα με χάντρες.
2. Αποδοτικότητα: Η λύση και η εκχύλιση κυττάρων υπερήχων μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τη θεραπεία μικρών, μεγάλων ή πολλαπλών δειγμάτων ταυτόχρονα, καθιστώντας την πιο αποτελεσματική από άλλες μεθόδους που απαιτούν ατομική επεξεργασία μικρών δειγμάτων.
3. Χωρίς χημικά: Η λύση και η εκχύλιση κυττάρων υπερήχων είναι μια μη επεμβατική μέθοδος που δεν απαιτεί τη χρήση σκληρών χημικών ουσιών ή ενζύμων. Αυτό το καθιστά ιδανικό για εφαρμογές όπου πρέπει να διατηρηθεί η ακεραιότητα των περιεχομένων του κελιού. Η ανεπιθύμητη μόλυνση των δειγμάτων μπορεί να αποφευχθεί.
4. Υψηλή απόδοση: Υπερήχων λύση κυττάρων και εκχύλιση μπορεί να εξαγάγετε μια υψηλή απόδοση των κυτταρικών περιεχομένων, συμπεριλαμβανομένου του DNA, RNA, και πρωτεΐνες. Αυτό συμβαίνει επειδή τα ηχητικά κύματα υψηλής συχνότητας διασπούν τα κυτταρικά τοιχώματα και απελευθερώνουν το περιεχόμενο στο περιβάλλον διάλυμα.
5. Ελεγχος θερμοκρασίας: Οι εξελιγμένοι υπερηχητικοί παράγοντες επιτρέπουν τον ακριβή έλεγχο της θερμοκρασίας του δείγματος. Hielscher ψηφιακή υπερήχων είναι εξοπλισμένα με ένα pluggable αισθητήρα θερμοκρασίας και λογισμικό παρακολούθησης της θερμοκρασίας.
6. Αναπαραχθούν: Τα πρωτόκολλα για τη λύση των υπερηχητικών κυττάρων μπορούν εύκολα να αναπαραχθούν και ακόμη και να αντιστοιχιστούν σε διαφορετικούς μεγαλύτερους ή μικρότερους όγκους δειγμάτων με μια απλή γραμμική κλιμάκωση.
7. Πολύπλευρος: Υπερήχων λύση κυττάρων και εκχύλιση μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την εξαγωγή ενός ευρέος φάσματος τύπων κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων των βακτηρίων, ζύμη, μύκητες, φυτικά και θηλαστικά κύτταρα. Μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί για την εξαγωγή διαφορετικών τύπων μορίων, συμπεριλαμβανομένων πρωτεϊνών, DNA, RNA και λιπιδίων.
8. Ταυτόχρονη προετοιμασία πολλών δειγμάτων: Η Hielscher Ultrasonics προσφέρει πολλές λύσεις για την άνετη επεξεργασία πολλών δειγμάτων υπό τις ίδιες ακριβώς συνθήκες διαδικασίας. Αυτό καθιστά το βήμα προετοιμασίας του δείγματος της λύσης και της εκχύλισης εξαιρετικά αποτελεσματικό και εξοικονομεί χρόνο.
9. Εύκολο στη χρήση: Ο υπερηχητικός εξοπλισμός λύσης κυττάρων και εκχύλισης είναι εύκολος στη χρήση και απαιτεί ελάχιστη εκπαίδευση. Ο εξοπλισμός είναι επίσης οικονομικός καθώς είναι μια ενιαία επένδυση χωρίς απαίτηση για επαναγορά των πωλήσεων. Αυτό το καθιστά ελκυστικό για ένα ευρύ φάσμα ερευνητών και εργαστηρίων.

Συνολικά, η λύση και η εκχύλιση κυττάρων υπερήχων είναι μια γρήγορη, αποτελεσματική, ελεγχόμενη με ακρίβεια και ευέλικτη μέθοδος για την εξαγωγή κυτταρικού περιεχομένου. Τα πλεονεκτήματά του έναντι των εναλλακτικών μεθόδων το καθιστούν ελκυστική επιλογή για ένα ευρύ φάσμα ερευνητικών και βιομηχανικών εφαρμογών.

Αρχή λειτουργίας της υπερηχητικής κυτταρικής λύσης

Υπερήχων λύση κυττάρων και εκχύλιση χρησιμοποιεί υψηλής συχνότητας ηχητικά κύματα για να διαταράξει τα κύτταρα και να εξαγάγει το περιεχόμενό τους. Τα ηχητικά κύματα δημιουργούν αλλαγές πίεσης στο περιβάλλον υγρό, προκαλώντας το σχηματισμό μικρών φυσαλίδων και την κατάρρευση σε μια διαδικασία γνωστή ως σπηλαίωση. Αυτές οι φυσαλίδες παράγουν εντοπισμένες εξαιρετικά έντονες μηχανικές δυνάμεις που μπορούν να σπάσουν τα ανοιχτά κύτταρα και να απελευθερώσουν το περιεχόμενό τους στο περιβάλλον διάλυμα.

Κυτταρική λύση χρησιμοποιώντας έναν υπερηχητικό συνήθως περιλαμβάνει τα ακόλουθα βήματα:

• Το δείγμα τοποθετείται σε σωλήνα ή περιέκτη με υγρό ρυθμιστικό διάλυμα.
• Ένας υπερηχητικός καθετήρας εισάγεται στο δείγμα και εφαρμόζονται ηχητικά κύματα υψηλής συχνότητας με περίπου 20-30 kHz.
• Τα κύματα υπερήχων προκαλούν ταλάντωση και σπηλαίωση στο περιβάλλον υγρό, δημιουργώντας τοπικές δυνάμεις που σπάνε τα ανοιχτά κύτταρα και απελευθερώνουν το περιεχόμενό τους.
• Το δείγμα φυγοκεντρείται ή διηθείται για να απομακρυνθούν τυχόν κυτταρικά υπολείμματα και το εξαγόμενο περιεχόμενο συλλέγεται για ανάλυση κατάντη.

Ισχυρά κύματα υπερήχων διαταράσσουν την κυτταρική μήτρα των βιολογικών δομών και απελευθερώνουν τις βιοδραστικές ενώσεις. Εντείνεται η μεταφορά μάζας μεταξύ του φυτικού υλικού και του διαλύτη (π.χ. ρυθμιστικό διάλυμα). (γραφικό: ©Βίλκου κ.ά., 2006)

Μειονεκτήματα των κοινών μεθόδων λύσης

Κατά τη διάρκεια της εργασίας σας σε εργαστήρια, μπορεί να έχετε ήδη βιώσει την ταλαιπωρία της κυτταρικής λύσης χρησιμοποιώντας παραδοσιακά πρωτόκολλα μηχανικής ή χημικής λύσης.

• Μηχανική λύση: Οι μέθοδοι μηχανικής λύσης, όπως η άλεση με κονίαμα και γουδοχέρι ή η ομογενοποίηση με τη χρήση γαλλικής πρέσας, σφαιροποιίας ή συστήματος ρότορα-στάτορα συχνά στερούνται επιλογών ελέγχου και ρύθμισης precice. Αυτό σημαίνει ότι η χρήση άλεσης και άλεσης μπορεί να παράγει γρήγορα θερμότητα και δυνάμεις διάτμησης που μπορούν να βλάψουν το δείγμα και να μετουσιώσουν τις πρωτεΐνες. Μπορεί επίσης να είναι χρονοβόρες και απαιτούν μεγάλες ποσότητες πρώτων υλών.
• Χημική λύση: Οι μέθοδοι χημικής λύσης, όπως η λύση με βάση το απορρυπαντικό, μπορούν να βλάψουν το δείγμα διαταράσσοντας τη διπλοστοιβάδα λιπιδίων και μετουσιώνοντας τις πρωτεΐνες. Μπορούν επίσης να απαιτήσουν πολλαπλά βήματα και μπορεί να αφήσουν υπολειμματικούς ρύπους που παρεμβαίνουν στις κατάντη εφαρμογές. Η εύρεση της βέλτιστης δοσολογίας απορρυπαντικού είναι μια πρόσθετη πρόκληση.
• Κύκλοι κατάψυξης-απόψυξης: Οι κύκλοι ψύξης-απόψυξης μπορούν να προκαλέσουν ρήξη των κυτταρικών μεμβρανών, αλλά οι επαναλαμβανόμενοι κύκλοι μπορούν επίσης να προκαλέσουν μετουσίωση και αποδόμηση πρωτεϊνών. Αυτή η μέθοδος μπορεί επίσης να απαιτεί πολλαπλούς κύκλους, οι οποίοι μπορεί να είναι χρονοβόροι και συχνά οδηγούν σε χαμηλότερες αποδόσεις.
• Ενζυματική λύση: Οι μέθοδοι ενζυματικής λύσης μπορεί να είναι συγκεκριμένες για ορισμένους τύπους κυττάρων και απαιτούν πολλαπλά βήματα, καθιστώντας τα χρονοβόρα. Παράγουν επίσης απόβλητα και απαιτούν προσεκτική βελτιστοποίηση για να αποφευχθεί η υποβάθμιση του δείγματος. Τα κιτ ενζυματικής λύσης είναι συχνά ακριβά. Εάν η τρέχουσα διαδικασία ενζυματικής λύσης σας δίνει ανεπαρκή αποτελέσματα, υπερήχηση ως συνεργιστική μέθοδος μπορεί να εφαρμοστεί για να εντείνει την κυτταρική διαταραχή.

Σε αντίθεση με τις συμβατικές μηχανικές και χημικές μεθόδους λύσης κυττάρων, υπερήχηση είναι ένα πολύ αποτελεσματικό και αξιόπιστο εργαλείο για την αποσύνθεση των κυττάρων που επιτρέπει τον πλήρη έλεγχο των παραμέτρων υπερήχων. Αυτό εξασφαλίζει υψηλή επιλεκτικότητα στην απελευθέρωση των υλικών και την καθαρότητα του προϊόντος. [πρβλ. Μπαλασουνταράμ κ.ά., 2009]
Είναι κατάλληλο για όλους τους τύπους κυττάρων και εύκολα εφαρμόσιμο σε μικρή και μεγάλη κλίμακα – πάντα υπό ελεγχόμενες συνθήκες. Οι υπερηχητικοί είναι εύκολο να καθαριστούν. Ένας ομογενοποιητής υπερήχων διαθέτει πάντα λειτουργία καθαρισμού στη θέση του (CIP) και αποστείρωσης επί τόπου (SIP). Το sonotrode αποτελείται από ένα τεράστιο κέρατο τιτανίου το οποίο μπορεί να σκουπιστεί ή να ξεπλυθεί σε νερό ή διαλύτη (ανάλογα με το μέσο εργασίας). Η συντήρηση των υπερήχων οφείλεται στην ευρωστία τους σχεδόν παραμελημένη.

Υπερηχητική λύση και διαταραχή κυττάρων

Γενικά, η λύση των δειγμάτων στο εργαστήριο θα διαρκέσει μεταξύ 15 δευτερολέπτων και 2 λεπτών. Καθώς η ένταση της επεξεργασίας με υπερήχους είναι πολύ εύκολο να προσαρμοστεί με το πλάτος που θέτει έναν χρόνο υπερήχων καθώς και με την επιλογή του σωστού εξοπλισμού, είναι δυνατόν να διαταραχθούν οι κυτταρικές μεμβράνες πολύ απαλά ή πολύ απότομα, ανάλογα με τη δομή των κυττάρων και τον σκοπό της λύσης π.χ. η εκχύλιση του DNA απαιτεί μαλακότερη επεξεργασία με υπερήχους, η πλήρης εξόρυξη πρωτεϊνών των βακτηριδίων απαιτεί πιο έντονη επεξεργασία με υπερήχους). Η θερμοκρασία κατά τη διάρκεια της διαδικασίας μπορεί να παρακολουθείται από έναν ενσωματωμένο αισθητήρα θερμοκρασίας και μπορεί εύκολα να ελεγχθεί με ψύξη (λουτρό πάγου ή κυψελών ροής με ψυκτικούς μανδύες) ή με υπερήχους σε παλμικό τρόπο λειτουργίας. Κατά τη διάρκεια επεξεργασίας με παλμό με υπερήχους, κύκλοι βραχυχρόνιας έκρηξης με υπερήχους διάρκειας 1-15 δευτερολέπτων επιτρέπουν τη διάχυση της θερμότητας και την ψύξη κατά τις μεγαλύτερες διαλείπουσες περιόδους.
Όλες οι διαδικασίες υπερήχων-driven είναι εντελώς αναπαραγώγιμα και γραμμικά επεκτάσιμη.

Υπερήχων ομογενοποιητές για λύση κυττάρων και εκχύλιση

Διάφοροι τύποι συσκευών υπερήχων επιτρέπουν την αντιστοίχιση του στόχου προετοιμασίας του δείγματος και τη διασφάλιση της φιλικότητας προς το χρήστη και της άνεσης λειτουργίας. Οι υπερηχητικοί ανιχνευτές τύπου καθετήρα είναι οι πιο κοινές συσκευές στο εργαστήριο. Είναι τα πλέον κατάλληλα για την παρασκευή δειγμάτων μικρού και μεσαίου μεγέθους με όγκους από 0,1mL έως 1000mL. Διαφορετικά μεγέθη ισχύος και sonotrodes επιτρέπουν την προσαρμογή του υπερήχου στον όγκο του δείγματος και στο δοχείο για τα πιο αποτελεσματικά και αποδοτικά αποτελέσματα υπερήχων. Η συσκευή ανίχνευσης υπερήχων είναι η καλύτερη επιλογή όταν πρέπει να προετοιμαστούν μεμονωμένα δείγματα.

Εάν πρέπει να προετοιμαστούν περισσότερα δείγματα, π.χ. 8-10 φιαλίδια κυτταρικού διαλύματος, μια έντονη έμμεση υπερήχηση με υπερηχητικά συστήματα όπως το VialTweeter ή ένα υπερηχητικό cuphorn είναι η πιο κατάλληλη μέθοδος ομογενοποίησης για μια αποτελεσματική λύση. Πολλά φιαλίδια υποβάλλονται σε υπερήχους ταυτόχρονα, με την ίδια ένταση. Αυτό εξοικονομεί όχι μόνο χρόνο, αλλά εξασφαλίζει επίσης την ίδια επεξεργασία όλων των δειγμάτων, γεγονός που καθιστά τα αποτελέσματα μεταξύ των δειγμάτων αξιόπιστα και συγκρίσιμα. Επιπλέον, κατά τη διάρκεια έμμεσης κατεργασίας με υπερήχους διασταυρούμενη μόλυνση με εμβάπτιση του υπερηχητικού sonotrode (επίσης γνωστή ως υπερηχητικός καθετήρας, κέρατο, άκρη, ή δάκτυλο) αποφεύγεται. Δεδομένου ότι χρησιμοποιούνται μεμονωμένα φιαλίδια προσαρμοσμένα στο μέγεθος του δείγματος, παραλείπεται ο χρονοβόρος καθαρισμός και η απώλεια δείγματος λόγω μετάγγισης των δοχείων. Για την ομοιόμορφη κατεργασία με υπερήχους των πλακών πολλαπλών κοιλοτήτων ή μικροτιτλοδότησης, η Hielscher προσφέρει το UIP400MTP.
Για μεγαλύτερους όγκους, π.χ. για την εμπορική παραγωγή των κυτταρικών εκχυλισμάτων, συνεχή υπερηχητική συστήματα με έναν αντιδραστήρα κελί ροής είναι οι πλέον κατάλληλες. Η συνεχής και ομαλή ροή του επεξεργασμένου υλικού εξασφαλίζει μια ακόμα επεξεργασία με υπερήχους. Όλες οι παράμετροι της διαδικασίας αποσύνθεσης με υπερήχους μπορεί να βελτιστοποιηθεί και να προσαρμοστεί στις απαιτήσεις της εφαρμογής και το συγκεκριμένο υλικό κυττάρου.
 
 
Παραδειγματική διαδικασία για την υπερηχητική λύση των βακτηριακών κυττάρων:

• Παρασκευή του κυτταρικού εναιωρήματος: Ιζήματα κυττάρων πρέπει να ανασταλεί πλήρως σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα με ομογενοποίηση (επιλέξτε ρυθμιστικού διαλύματος σας συμβατό με ακόλουθη ανάλυση, π.χ. ειδική μέθοδος χρωματογραφίας). Προσθήκη λυσοζύμες ή / και άλλα πρόσθετα, εάν είναι απαραίτητο (πρέπει να είναι επίσης συμβατό με μέσα διαχωρισμού / καθαρισμού). Αναμίξτε / ομογενοποιηθεί το διάλυμα ήπια υπό ήπιες κατεργασία με υπέρηχους μέχρι να επιτευχθεί πλήρης αναστολή.
• Υπερήχων λύση: Τοποθετήστε το δείγμα σε λουτρό πάγου. Για κυτταρική διάσπαση, υπερηχείται το εναιώρημα στους 60-90 δευτερολέπτων ξεσπάσματα (με χρήση της λειτουργίας παλμού υπερήχων σας).
• (Π. Χ 10 λεπτά σε 10,000 χ g? Σε 4degC): Διαχωρισμός Φυγοκεντρήστε το λύμα. Διαχωρίστε το υπερκείμενο από το κυτταρικό ίζημα προσεκτικά. Το υπερκείμενο είναι το συνολικό προϊόν λύσης κυττάρου. Μετά από διήθηση του υπερκειμένου υγρού, να αποκτήσετε ένα διαυγασμένο υγρό της διαλυτής κυτταρικής πρωτεΐνης.

 
 
Οι πιο κοινές εφαρμογές για ultrasonicators στη βιολογία και τη βιοτεχνολογία είναι:

• παρασκευή κυτταρικού εκχυλίσματος
• Διαταραχή ζύμης, βακτηρίων, φυτικών κυττάρων, μαλακού ή σκληρού κυτταρικού ιστού, νουκλέου υλικού
• εκχύλιση πρωτεΐνη
• Παρασκευή και απομόνωση των ενζύμων
• Παραγωγή αντιγόνων
• εκχύλιση του DNA ή / και στοχευμένη κατακερματισμού
• λιποσωμικό παρασκεύασμα