Υπερηχητική αποσύνθεση κυττάρων βακτηριακών δειγμάτων

Τα βακτηριακά δείγματα σπάνια φτάνουν ως πραγματικά εναιωρήματα μονών κυττάρων. Οι καλλιέργειες αναπτύσσονται σε αλυσίδες και σβώλους, τα περιβαλλοντικά απομονωμένα στελέχη σχηματίζουν συσσωματώματα που συνδέονται με εξωκυτταρικές πολυμερείς ουσίες, ενώ τα φυγοκεντρημένα ίζημα συχνά δεν επαναδιαλύονται παρά την εντατική ανάδευση με βόρτεξ. Ο υπολογισμός των ζωντανών κυττάρων, η οπτική πυκνότητα, η κυτταρομετρία ροής και η ανάλυση του μικροβιώματος βασίζονται όλα στην παραδοχή ότι ένα σωματίδιο ισούται με ένα κύτταρο. Η υπερηχητική αποσύνθεση των κυττάρων επιλύει αυτή τη διαφορά: σύντομες, ελεγχόμενες εκρήξεις υπερήχων διαχωρίζουν τα συσσωματώματα σε μεμονωμένα κύτταρα χωρίς να τα λύουν.

Γιατί η συσσώρευση κυττάρων επηρεάζει αρνητικά τα αποτελέσματά σας

Η συσσωμάτωση αποτελεί βιολογικό χαρακτηριστικό και όχι σφάλμα παρασκευής. Ο σταφυλόκοκκος, ο στρεπτόκοκκος, ο λακτοβάκιλλος, ο ακτινομύκητας και πολλά είδη του περιβάλλοντος αναπτύσσονται σε αλυσίδες, συστάδες ή θραύσματα βιοφίλμ, ενώ το εξωκυτταρικό DNA και οι πολυσακχαρίτες συνδέουν τα κύτταρα μεταξύ τους σε ιζήματα και σε εκχυλίσματα επιχρισμάτων. Οι αναλυτικές συνέπειες είναι συστηματικές:

• Ο αριθμός των αποικιών υποτιμάται, καθώς κάθε συστάδα δημιουργεί μία αποικία, ανεξάρτητα από τον αριθμό των κυττάρων που περιέχει.
• Η οπτική πυκνότητα και οι μετρητές σωματιδίων καταγράφουν συσσωματώματα αντί για κύτταρα, με αποτέλεσμα να προκαλείται σφάλμα στις καμπύλες ανάπτυξης.
• Η κυτταρομετρία ροής και η διαλογή κυττάρων μετράνε εσφαλμένα τα συσσωματωμένα συμβάντα και τα αποκλείουν από την ανάλυση.
• Οι εκχυλίσεις DNA και πρωτεϊνών αφορούν μόνο τα κύτταρα που βρίσκονται στην επιφάνεια του συσσωματώματος, γεγονός που οδηγεί σε στρέβλωση των δεδομένων σχετικά με το μικροβίωμα και τα ομικά δεδομένα.

Οι συμβατικές μέθοδοι είναι αργές, ατελείς ή προκαλούν χημικές μεταβολές. Η έντονη χρήση πιπετών και η ανάδευση με βόρτεξ αφήνουν πίσω μικροσυσσωματώματα. Η ενζυματική διασπορά ή η διασπορά με χηλικούς παράγοντες τροποποιεί την κυτταρική επιφάνεια που ενδεχομένως σκοπεύετε να αναλύσετε. Η μηχανική αποσυσσωμάτωση μέσω ελεγχόμενης σπηλαίωσης δρα μέσα σε δευτερόλεπτα και δεν απαιτεί πρόσθετα.

Πώς η υπερήχηση διαχωρίζει τα κύτταρα χωρίς να τα λύει

Η αποσύνθεση κυττάρων με υπερήχους αξιοποιεί τη διαφορά στη μηχανική αντοχή. Τα βακτηριακά συσσωματώματα συγκρατούνται μεταξύ τους από σχετικά αδύναμους ενδοκυτταρικούς δεσμούς και μια εξωκυτταρική μήτρα, ενώ ένα άθικτο κυτταρικό περίβλημα αντέχει σε σημαντικά υψηλότερη διάτμηση. Καθώς ο ρυθμισμένος υπέρηχος εισέρχεται στο εναιώρημα, η ακουστική σπηλαίωση δημιουργεί μικρορεύματα, παλμούς πίεσης και δυνάμεις διάτμησης που δρουν αρχικά στις διεπαφές των συσσωματωμάτων. Οι συσσωματώσεις, οι αλυσίδες και τα θραύσματα βιοφίλμ διαχωρίζονται (αποσυσσωμάτωση) πριν επιτευχθεί το ενεργειακό επίπεδο στο οποίο οι μεμβράνες υποστούν ρήξη (λύση).

Υπερηχητική αποσύνθεση συσσωματωμάτων βακτηριακών κυττάρων

Αποσύνθεση ή Λύση – Η σημασία των παραμέτρων της υπερήχησης

Η πρακτική συνέπεια είναι ότι η αποσύνθεση και η λύση είναι το ίδιο όργανο που λειτουργεί με διαφορετικές παραμέτρους. Σε μέτριο πλάτος, σύντομους κύκλους παλμών και ελεγχόμενη θερμοκρασία, επιτυγχάνεται ένα βιώσιμο εναιώρημα μονοκυττάρων. Η αύξηση της πλάτους, του χρόνου έκθεσης ή της θερμοκρασίας του δείγματος μετατοπίζει τη διαδικασία προς την πλήρη διάσπαση των κυττάρων για ενδοκυτταρικούς στόχους. Οι γεννήτριες Hielscher σας επιτρέπουν να ρυθμίσετε με ακρίβεια την πλάτος, την ισχύ, τον παλμό και την εισροή ενέργειας και να αποθηκεύσετε τη μέθοδο, έτσι ώστε το στάδιο της αποσύνθεσης να είναι αναπαραγώγιμο σε όλα τα δείγματα, τους χειριστές και τις εκτελέσεις.

Αποτελεσματική υπερηχητική επεξεργασία χωρίς επαφή

Ο υπερηχητικός καθαρισμός σε λουτρό δεν μπορεί να φτάσει αυτό το επίπεδο ελέγχου. Τα λουτρά και οι δεξαμενές υπερηχητικού καθαρισμού παρέχουν μόνο χαμηλή υπερηχητική ενέργεια, με αποτέλεσμα την ατελή προετοιμασία, ενώ η σπηλαίωση λαμβάνει χώρα άνισα, οπότε κάθε σωληνάριο υποβάλλεται σε επεξεργασία ανάλογα με τη θέση του στο λουτρό. Το VialTweeter μεταδίδει έντονες, εστιασμένες υπερηχητικές δυνάμεις απευθείας μέσω του τοιχώματος του δοχείου σε έως και 10 σφραγισμένα δείγματα ταυτόχρονα. Οι επεξεργασίες που απαιτούν μακρά, μεταβλητή έκθεση σε λουτρό ολοκληρώνονται με ένα τυποποιημένο μοτίβο παλμών.
Τα συστήματα υπερήχων χωρίς επαφή της Hielscher εφαρμόζουν έντονους, εστιασμένους υπερήχους διαμέσου των τοιχωμάτων κλειστών φιαλιδίων. Το VialTweeter επεξεργάζεται έως και 10 φιαλίδια ταυτόχρονα με την ίδια ένταση, χωρίς την εισαγωγή καθετήρα στο δείγμα, χωρίς διασταυρούμενη μόλυνση και χωρίς εκπομπή αερολύματος. Όπου απαιτείται υψηλή παραγωγικότητα, οι συσκευές υπερήχων για μικροπλάκες UIP400MTP και UIP550MTP επεκτείνουν την ίδια ελεγχόμενη μεταφορά ενέργειας σε πλάκες πολλαπλών φρεατίων.

Πλεονεκτήματα της αποσύνθεσης με υπερήχους χωρίς επαφή

• Καμία διασταυρούμενη μόλυνση: Επειδή τα φιαλίδια παραμένουν μόνιμα κλειστά και κανένας αισθητήρας δεν βυθίζεται στο δείγμα, αποφεύγονται πλήρως η διασταυρούμενη μόλυνση και η απώλεια δείγματος. Δεν χρειάζεται να αποστειρωθεί τίποτα μεταξύ των δειγμάτων, και η μία ανάλυση δεν μπορεί να επηρεάσει την επόμενη.
• Προστασία από τα αερολύματα: Η υπερηχητική επεξεργασία με ανοιχτό καθετήρα δημιουργεί μολυσματικά αερολύματα και μολύνει τις επιφάνειες των οργάνων. Η υπερηχητική επεξεργασία σε σφραγισμένο φιαλίδιο περιορίζει το δείγμα εντός του ίδιου του σωληναρίου, κάτι που έχει σημασία κατά τον χειρισμό παθογόνων βακτηρίων, όπως το Mycobacterium tuberculosis και άλλων παραγόντων BSL-2 ή BSL-3.
• Χωρίς μείωση του φιλοδωρήματος: Οι αισθητήρες τιτανίου ενδέχεται να απελευθερώσουν μια μικρή ποσότητα μικροσωματιδίων στο δείγμα κατά τη λειτουργία. Τα σωματίδια αυτά μεταβάλλουν την οπτική πυκνότητα και τον αριθμό των σωματιδίων στα επόμενα στάδια της διαδικασίας. Η έμμεση υπερηχητική επεξεργασία μέσω του τοιχώματος του δοχείου εξαλείφει πλήρως αυτή την πηγή στερεών.
• Ομοιόμορφη απόδοση: Το VialTweeter παρέχει την ίδια ένταση υπερήχων σε κάθε ένα από τα έως και 10 φιαλίδια, με αποτέλεσμα τα αποτελέσματα της υπερηχητικής επεξεργασίας να είναι ομοιόμορφα και αναπαραγώγιμα. Εξαλείφονται οι επιδράσεις της θέσης που αποτελούν πρόβλημα στα λουτρά υπερήχων και στην ανίχνευση μεμονωμένων δειγμάτων, ενώ οι τιμές αναφοράς σας παραμένουν συγκρίσιμες μεταξύ των επαναλήψεων.
• Ακεραιότητα του δείγματος: Οι σωλήνες παραμένουν κλειστοί καθ’ όλη τη διάρκεια της επεξεργασίας, οπότε το δείγμα δεν μπορεί να μολυνθεί, να αλλοιωθεί ή να εξατμιστεί. Οι μικροί όγκοι επεξεργάζονται χωρίς αραίωση, συμπεριλαμβανομένων των πολύτιμων κλινικών ιζημάτων για τα οποία δεν επιτρέπεται ένα επιπλέον στάδιο μεταφοράς.
• Έλεγχος διαδικασίας: Το πλάτος ρυθμίζεται από 20 έως 100%, η λειτουργία παλμών από 0 έως 100%, ενώ τα συστήματα υποστηρίζουν την παρακολούθηση της θερμοκρασίας, ώστε τα θερμοευαίσθητα στελέχη και οι πρωτεΐνες να παραμένουν κάτω από τα όρια που προκαλούν βλάβη.

Τυπικές εφαρμογές

• Ανάλυση μικροβιώματος και περιεχομένου του εντέρου: διασπορά των Lactobacillus, των Bifidobacterium και των δειγμάτων κοπράνων πριν από την καλλιέργεια σε τρυβλία ή την αλληλούχιση, ώστε ο αριθμός των μικροοργανισμών να μην μειώνεται λόγω συσσωματωμάτων.
• Μικροβιολογία τροφίμων και νερού: αποσύνθεση των συσσωματωμάτων σε επιχρίσματα, διαλύματα έκπλυσης και θρεπτικά μέσα εμπλουτισμού για τον ακριβή προσδιορισμό των αποικιών και της βιωσιμότητας.
• Έρευνα σχετικά με το βιοφίλμ: ανάκτηση κυττάρων από φορείς και επιφάνειες υπό μορφή εναιωρημάτων μονών κυττάρων, χωρίς ενζυμική επεξεργασία που θα απομάκρυνε τις επιφανειακές πρωτεΐνες.
• Κλινική διάγνωση: αναδιάλυση πτυέλων, πύου και εκχυλισμάτων επιχρισμάτων υπό συνθήκες περιορισμού.
• Κυτταρική καλλιέργεια: διαχωρισμός συσσωματωμένων κυττάρων θηλαστικών, εντόμων και CHO πριν από την καταμέτρηση και τη μεταφύτευση.
• Προετοιμασία ολόκληρης της ροής εργασίας: το ίδιο όργανο που πραγματοποιεί αποσύνθεση σε χαμηλό πλάτος εκτελεί πλήρη διάσπαση των κυττάρων σε υψηλότερες ρυθμίσεις, οπότε η λύση, η εκχύλιση πρωτεϊνών και ο κατακερματισμός του DNA ακολουθούν χωρίς μεταφορές σε σωληνάρια.

Βιβλιογραφία / Αναφορές