Αποσυσσωμάτωση κυττάρων βακτηριακών δειγμάτων με υπερήχους

Τα βακτηριακά δείγματα σπάνια παραλαμβάνονται ως πραγματικά εναιωρήματα μεμονωμένων κυττάρων. Οι καλλιέργειες αναπτύσσονται σε αλυσίδες και κροκίδες, τα στελέχη που απομονώνονται από το περιβάλλον σχηματίζουν συσσωματώματα που συγκρατούνται από εξωκυτταρικές πολυμερείς ουσίες και τα ιζήματα φυγοκέντρησης συχνά αντιστέκονται στην επαναιώρηση παρά την ενδελεχή ανάδευση σε αναδευτήρα vortex. Οι καταμετρήσεις βιώσιμων κυττάρων, η οπτική πυκνότητα, η κυτταρομετρία ροής και ο προσδιορισμός του προφίλ του μικροβιώματος βασίζονται όλα στην παραδοχή ότι ένα σωματίδιο αντιστοιχεί σε ένα κύτταρο. Η αποσυσσωμάτωση κυττάρων με υπερήχους επιλύει αυτή την αντίφαση: σύντομοι, ελεγχόμενοι παλμοί κατεργασίας με υπερήχους διαχωρίζουν τα συσσωματώματα σε μεμονωμένα κύτταρα χωρίς να προκαλούν τη λύση τους.

Γιατί η συσσωμάτωση των κυττάρων υπονομεύει τα αποτελέσματά σας

Η συσσωμάτωση είναι βιολογικό χαρακτηριστικό, όχι σφάλμα προετοιμασίας. Τα Staphylococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Actinomyces και πολλά είδη του περιβάλλοντος αναπτύσσονται σε αλυσίδες, συστάδες ή θραύσματα βιοϋμενίων, ενώ το εξωκυτταρικό DNA και οι πολυσακχαρίτες συγκολλούν τα κύτταρα μεταξύ τους στα ιζήματα και στα εκλούσματα στυλεών δειγματοληψίας. Οι συνέπειες στην ανάλυση είναι συστηματικές:

• Ο αριθμός των αποικιών υποεκτιμάται, επειδή κάθε κυτταρικό συσσωμάτωμα παράγει μία αποικία, ανεξάρτητα από το πόσα κύτταρα περιέχει.
• Η οπτική πυκνότητα και οι μετρητές σωματιδίων καταγράφουν συσσωματώματα αντί για κύτταρα, προκαλώντας μεροληψία στις καμπύλες ανάπτυξης.
• Η κυτταρομετρία ροής και η κυτταρική διαλογή καταμετρούν εσφαλμένα τα συμβάντα που αντιστοιχούν σε συσσωματωμένα κύτταρα και τα αποκλείουν από την ανάλυση.
• Οι εκχυλίσεις DNA και πρωτεϊνών αντιπροσωπεύουν μόνο τα κύτταρα στην επιφάνεια των συσσωματωμάτων, διαστρεβλώνοντας τα δεδομένα του μικροβιώματος και των ομικών αναλύσεων.

Οι συμβατικές μέθοδοι αντιμετώπισης είναι αργές, ατελείς ή προκαλούν χημικές αλλοιώσεις. Η έντονη αναρρόφηση και εκροή με πιπέτα και η ανάδευση σε αναδευτήρα vortex αφήνουν μικροσυσσωματώματα. Η διασπορά με ένζυμα ή χηλικούς παράγοντες τροποποιεί την κυτταρική επιφάνεια που ενδέχεται να θέλετε να αναλύσετε. Η μηχανική αποσυσσωμάτωση μέσω ελεγχόμενης σπηλαίωσης δρα μέσα σε δευτερόλεπτα και δεν απαιτεί πρόσθετα.

Πώς η κατεργασία με υπερήχους αποσυσσωματώνει τα κύτταρα χωρίς να προκαλεί τη λύση τους

Η αποσυσσωμάτωση κυττάρων με υπερήχους αξιοποιεί μια διαφορά στη μηχανική αντοχή. Τα βακτηριακά συσσωματώματα συγκρατούνται από σχετικά ασθενείς διακυτταρικούς δεσμούς και μια εξωκυτταρική μήτρα, ενώ ένα άθικτο κυτταρικό περίβλημα αντέχει σε σημαντικά υψηλότερες διατμητικές καταπονήσεις. Καθώς οι βαθμονομημένοι υπέρηχοι εισέρχονται στο εναιώρημα, η ακουστική σπηλαίωση δημιουργεί μικροροές, παλμούς πίεσης και δυνάμεις διάτμησης που δρουν πρώτα στις διεπιφάνειες των συσσωματωμάτων. Τα κυτταρικά συσσωματώματα, οι αλυσίδες και τα θραύσματα βιοϋμενίων διαχωρίζονται με διάτμηση (αποσυσσωμάτωση) προτού επιτευχθεί το ενεργειακό επίπεδο στο οποίο οι μεμβράνες διαρρηγνύονται (λύση).

Αποσυσσωμάτωση βακτηριακών κυτταρικών συσσωματωμάτων με υπερήχους

Αποσυσσωμάτωση ή λύση – Πώς επηρεάζουν τη διαδικασία οι παράμετροι κατεργασίας με υπερήχους

Στην πράξη, αυτό σημαίνει ότι η αποσυσσωμάτωση και η λύση πραγματοποιούνται με το ίδιο όργανο, το οποίο λειτουργεί με διαφορετικές παραμέτρους. Με μέτριο πλάτος ταλάντωσης, σύντομους παλμικούς κύκλους και ελεγχόμενη θερμοκρασία λαμβάνετε ένα βιώσιμο εναιώρημα μεμονωμένων κυττάρων. Η αύξηση του πλάτους ταλάντωσης, του χρόνου έκθεσης ή της θερμοκρασίας του δείγματος μετατοπίζει τη διαδικασία προς την πλήρη κυτταρική διάρρηξη για την ανάκτηση ενδοκυτταρικών στόχων. Οι γεννήτριες Hielscher σάς επιτρέπουν να ρυθμίζετε με ακρίβεια το πλάτος ταλάντωσης, την ισχύ, την παλμική λειτουργία και την εισαγόμενη ενέργεια και να αποθηκεύετε τη μέθοδο, ώστε το στάδιο αποσυσσωμάτωσης να είναι αναπαραγώγιμο μεταξύ δειγμάτων, χειριστών και εκτελέσεων.

Αποτελεσματική κατεργασία με υπερήχους χωρίς επαφή

Η κατεργασία με υπερήχους σε λουτρό δεν μπορεί να προσφέρει αυτόν τον βαθμό ελέγχου. Τα λουτρά και οι δεξαμενές καθαρισμού με υπερήχους παρέχουν μόνο χαμηλή ενέργεια υπερήχων, με αποτέλεσμα την ατελή προετοιμασία, ενώ η σπηλαίωση εμφανίζεται ανομοιόμορφα, οπότε κάθε σωληνάριο υποβάλλεται σε κατεργασία ανάλογα με τη θέση του στο λουτρό. Το VialTweeter μεταδίδει έντονες, εστιασμένες δυνάμεις υπερήχων απευθείας μέσω του τοιχώματος του δοχείου σε έως και 10 σφραγισμένα δείγματα ταυτόχρονα. Οι κατεργασίες που απαιτούν παρατεταμένη έκθεση μεταβλητής διάρκειας σε λουτρό ολοκληρώνονται με ένα τυποποιημένο σχήμα παλμών.
Οι συσκευές υπερήχων χωρίς επαφή της Hielscher εφαρμόζουν έντονους, εστιασμένους υπερήχους μέσω των τοιχωμάτων κλειστών φιαλιδίων. Το VialTweeter επεξεργάζεται έως και 10 φιαλίδια ταυτόχρονα με πανομοιότυπη ένταση, χωρίς εμβαπτιζόμενο εξάρτημα στο δείγμα, χωρίς διασταυρούμενη επιμόλυνση και χωρίς απελευθέρωση αερολυμάτων. Όπου το απαιτεί ο ρυθμός επεξεργασίας δειγμάτων, οι συσκευές υπερήχων μικροπλακών UIP400MTP και UIP550MTP επεκτείνουν την ίδια ελεγχόμενη μεταφορά ενέργειας σε πλάκες πολλαπλών βοθρίων.

Πλεονεκτήματα της αποσυσσωμάτωσης με υπερήχους χωρίς επαφή

• Μηδενική διασταυρούμενη επιμόλυνση: Επειδή τα φιαλίδια παραμένουν διαρκώς κλειστά και κανένα εξάρτημα δεν εμβαπτίζεται στο δείγμα, η διασταυρούμενη επιμόλυνση και η απώλεια δείγματος αποφεύγονται πλήρως. Δεν υπάρχει τίποτα προς αποστείρωση μεταξύ των δειγμάτων και ένας κύκλος επεξεργασίας δεν μπορεί να επηρεάσει τον επόμενο.
• Προστασία από αερολύματα: Η κατεργασία με υπερήχους με εμβαπτιζόμενο εξάρτημα σε ανοικτό δοχείο παράγει μολυσματικά αερολύματα και επιμολύνει τις επιφάνειες του οργάνου. Η κατεργασία με υπερήχους σε σφραγισμένα φιαλίδια διατηρεί το δείγμα περιορισμένο μέσα στο δικό του σωληνάριο, κάτι που έχει σημασία κατά τον χειρισμό παθογόνων βακτηρίων όπως το Mycobacterium tuberculosis και άλλων παραγόντων BSL-2 ή BSL-3.
• Χωρίς διάβρωση του άκρου: Τα εμβαπτιζόμενα εξαρτήματα τιτανίου μπορούν να αποβάλουν μικρή ποσότητα μικροσωματιδίων στο δείγμα κατά τη λειτουργία. Αυτά τα σωματίδια μεταβάλλουν την οπτική πυκνότητα και τις μετρήσεις αριθμού σωματιδίων στα επόμενα στάδια. Η έμμεση κατεργασία με υπερήχους μέσω του τοιχώματος του δοχείου εξαλείφει πλήρως αυτή την πηγή στερεών.
• Ομοιόμορφος ρυθμός επεξεργασίας δειγμάτων: Το VialTweeter παρέχει την ίδια ένταση υπερήχων σε καθένα από τα έως και 10 φιαλίδια, ώστε τα αποτελέσματα της κατεργασίας με υπερήχους να είναι ομοιόμορφα και αναπαραγώγιμα. Οι επιδράσεις της θέσης που ταλαιπωρούν τα λουτρά και την κατεργασία με εμβαπτιζόμενο εξάρτημα ενός δείγματος κάθε φορά εξαφανίζονται και οι τιμές αναφοράς σας παραμένουν συγκρίσιμες μεταξύ των επαναλήψεων.
• Ακεραιότητα δείγματος: Τα σωληνάρια παραμένουν κλειστά καθ’ όλη τη διάρκεια της επεξεργασίας, οπότε το δείγμα δεν μπορεί να επιμολυνθεί, να αλλοιωθεί ή να εξατμιστεί. Μπορούν να υποβληθούν σε επεξεργασία μικροί όγκοι χωρίς αραίωση, συμπεριλαμβανομένων πολύτιμων κλινικών ιζημάτων που δεν επιδέχονται επιπλέον στάδιο μεταφοράς.
• Έλεγχος διεργασίας: Το πλάτος ταλάντωσης είναι ρυθμιζόμενο από 20 έως 100%, η παλμική λειτουργία από 0 έως 100%, και τα συστήματα υποστηρίζουν παρακολούθηση της θερμοκρασίας, ώστε τα θερμοευαίσθητα στελέχη και οι πρωτεΐνες να παραμένουν κάτω από τα όρια πρόκλησης βλάβης.

Τυπικές εφαρμογές

• Ανάλυση μικροβιώματος και εντερικού περιεχομένου: διασπορά Lactobacillus, Bifidobacterium και δειγμάτων κοπράνων πριν από την επίστρωση σε τρυβλία ή την αλληλούχηση, ώστε οι καταμετρήσεις να μην υποεκτιμώνται λόγω συσσωματωμάτων.
• Μικροβιολογία τροφίμων και νερού: αποσυσσωμάτωση κροκίδων σε δείγματα από στυλεούς, υγρά έκπλυσης και ζωμούς εμπλουτισμού για ακριβή προσδιορισμό του αριθμού αποικιών και της βιωσιμότητας.
• Έρευνα βιοϋμενίων: ανάκτηση κυττάρων από φορείς και επιφάνειες ως εναιωρημάτων μεμονωμένων κυττάρων, χωρίς ενζυμική κατεργασία που θα αφαιρούσε επιφανειακές πρωτεΐνες.
• Κλινική διαγνωστική: επαναιώρηση πτυέλων, πύου και εκλουσμάτων στυλεών υπό συνθήκες περιορισμού.
• Κυτταροκαλλιέργεια: διαχωρισμός συσσωματωμάτων κυττάρων θηλαστικών, εντόμων και CHO πριν από την καταμέτρηση και την ανακαλλιέργεια.
• Προετοιμασία για ολόκληρη τη ροή εργασίας: το ίδιο όργανο που εκτελεί αποσυσσωμάτωση σε χαμηλό πλάτος ταλάντωσης πραγματοποιεί πλήρη κυτταρική διάρρηξη σε υψηλότερες ρυθμίσεις, οπότε η λύση, η εκχύλιση πρωτεϊνών και ο κατακερματισμός DNA ακολουθούν χωρίς μεταφορές μεταξύ σωληναρίων.

Βιβλιογραφία / Αναφορές

• FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
• FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
• FactSheet UIP550MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
• Bahnan W, Happonen L, Khakzad H, Kumra Ahnlide V, de Neergaard T, Wrighton S, André O, Bratanis E, Tang D, Hellmark T, Björck L, Shannon O, Malmström L, Malmström J, Nordenfelt P. (2023): A human monoclonal antibody bivalently binding two different epitopes in streptococcal M protein mediates immune function. EMBO Mol Med. 2023 Feb 8;15(2):e16208.
• Wrighton S., Ahnlide V.K., André O., Bahnan W., Nordenfelt P. (2023): Group A streptococci induce stronger M protein-fibronectin interaction when specific human antibodies are bound. Frontiers in Microbiology 14:1069789.
• De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.