Πρωτόκολλο δοκιμασίας ελάχιστης ανασταλτικής συγκέντρωσης (MIC)

Η δοκιμασία ελάχιστης ανασταλτικής συγκέντρωσης (MIC) με βάση το βιοφίλμ είναι μια ουσιαστική μέθοδος για την αξιολόγηση της αποτελεσματικότητας των αντιμικροβιακών παραγόντων έναντι μικροοργανισμών που σχετίζονται με το βιοφίλμ, οι οποίοι παρουσιάζουν αυξημένη αντοχή λόγω της προστατευτικής εξωκυτταρικής μήτρας τους. Ένα κρίσιμο βήμα σε αυτόν τον προσδιορισμό είναι η διαταραχή των δομών βιοφίλμ για την απελευθέρωση ενσωματωμένων κυττάρων για ακριβή αξιολόγηση βιωσιμότητας. Ο υπερηχητικός UIP400MTP πλάκας πολλαπλών φρεατίων διευκολύνει αυτή τη διαδικασία χρησιμοποιώντας εστιασμένους υπερήχους για τη δημιουργία ελεγχόμενης σπηλαίωσης, αποσπώντας αποτελεσματικά τα κύτταρα βιοφίλμ και διασκορπίζοντάς τα σε ομοιόμορφο εναιώρημα. Αυτή η ακριβής και αναπαραγώγιμη διαταραχή του βιοϋμενίου ενισχύει την αξιοπιστία και την απόδοση των δοκιμασιών MIC, καθιστώντας το UIP400MTP απαραίτητο εργαλείο για την προώθηση της έρευνας βιοϋμενίου.

Υπερήχηση για αποκόλληση βιοϋμενίου

Η δοκιμασία MIC με βάση το βιοφίλμ συνήθως μετρά τη βακτηριακή βιωσιμότητα ή την αναστολή της ανάπτυξης χρησιμοποιώντας μεθόδους όπως επιμετάλλωση, καταμέτρηση αποικιών ή μετρήσεις οπτικής πυκνότητας. Κατεργασία με υπερήχους είναι ένα κρίσιμο βήμα στις δοκιμασίες MIC με βάση το βιοφίλμ κατά την αξιολόγηση της αντιμικροβιακής ευαισθησίας των μικροοργανισμών που σχετίζονται με το βιοφίλμ. Η κύρια λειτουργία του είναι να αποσπά και να διασκορπίζει κύτταρα ενσωματωμένα στη μήτρα βιοφίλμ σε ένα ομοιόμορφο εναιώρημα για ακριβή ανάλυση.
Τα βιοφίλμ είναι σημαντικά πιο ανθεκτικά στους αντιμικροβιακούς παράγοντες σε σύγκριση με τα πλαγκτονικά κύτταρα, καθιστώντας τη σωστή αποκόλληση κρίσιμη για ακριβή ανάλυση. Κατά τη διάρκεια αυτής της διαδικασίας, τα υπερηχητικά κύματα δημιουργούν ελεγχόμενη σπηλαίωση, διασπώντας τη μήτρα βιοφίλμ και απελευθερώνοντας ενσωματωμένα κύτταρα σε ομοιόμορφο εναιώρημα μέσα στο μέσο ανάκτησης. Αυτό το βήμα επιτρέπει ακριβείς εκτιμήσεις βιωσιμότητας κυττάρων διασκορπισμένων σε βιοφίλμ μέσω μεθόδων όπως η επιμετάλλωση, η αραίωση και η καταμέτρηση αποικιών. Η σωστή διαταραχή του βιοϋμενίου μέσω υπερήχων εμποδίζει τα υπολειμματικά συστατικά της μήτρας να θωρακίζουν τα κύτταρα, γεγονός που διαφορετικά θα μπορούσε να οδηγήσει σε υποτίμηση της αντιμικροβιακής δραστηριότητας. Η UIP400MTP υπερήχων πλάκας πολλαπλών φρεατίων είναι ιδιαίτερα κατάλληλη για το σκοπό αυτό, προσφέροντας ακριβείς και αναπαραγώγιμες συνθήκες υπερήχων για να εξασφαλιστεί αξιόπιστη και υψηλής απόδοσης προετοιμασία πλακών ανάλυσης.

Γιατί κατεργασία με υπερήχους είναι απαραίτητη σε δοκιμασίες ελάχιστης αναστολής συγκέντρωσης με βάση το βιοφίλμ

Για τις μετρήσεις βιωσιμότητας και την καταμέτρηση των κυττάρων, απαιτείται πλήρης και αξιόπιστη αποκόλληση και διασπορά μεμονωμένων κυττάρων. Το UIP400MTP προωθεί μια ομοιόμορφη, μη επιβλαβή αποκόλληση βιοϋμενίου και κυτταρική διασπορά για ισχυρά αποτελέσματα ανάλυσης.

• Πολυπλοκότητα βιοϋμενίου: Τα βιοφίλμ είναι δομημένες μικροβιακές κοινότητες που περικλείονται σε μια μήτρα εξωκυτταρικής πολυμερούς ουσίας (EPS), η οποία προστατεύει τους μικροοργανισμούς και τους καθιστά πιο ανθεκτικούς στους αντιμικροβιακούς παράγοντες.
• Ομοιόμορφη διασπορά: Για να μετρηθεί με ακρίβεια η βιωσιμότητα των κυττάρων που είναι ενσωματωμένα στο βιοφίλμ ή η ευαισθησία τους σε αντιμικροβιακά, το βιοφίλμ πρέπει πρώτα να αποσπαστεί και να διασπαστεί σε ομοιογενές εναιώρημα.

Πρωτόκολλο δοκιμασίας ελάχιστης ανασταλτικής συγκέντρωσης με βάση το βιοϋμένιο

Η δοκιμασία ελάχιστης ανασταλτικής συγκέντρωσης (MIC) προσδιορίζει τη χαμηλότερη συγκέντρωση ενός αντιμικροβιακού παράγοντα που απαιτείται για την αναστολή της ορατής ανάπτυξης μικροοργανισμών. Αυτό το πρωτόκολλο έχει σχεδιαστεί για μικροοργανισμούς που σχετίζονται με το βιοφίλμ, χρησιμοποιώντας UIP400MTP υπερήχων πλάκας πολλαπλών φρεατίων για διαταραχή βιοφίλμ.

Βήμα 1: Παρασκευή βακτηριακού εμβολίου

1. Προετοιμάστε το βακτηριακό εναιώρημα:
   Αναπτύξτε βακτήρια σε κατάλληλα μέσα στη μέση λογαριθμική φάση.
   Αραιώστε την καλλιέργεια για να επιτύχετε μια τυποποιημένη πυκνότητα κυττάρων (π.χ. πρότυπο McFarland 0,5 ή OD600 ~ 0,1).
2. Προετοιμάστε αντιμικροβιακά διαλύματα:
   Αραιώνεται ο αντιμικροβιακός παράγοντας σε κατάλληλο θρεπτικό μέσο για να δημιουργηθεί ένα εύρος συγκεντρώσεων (π.χ. διπλές διαδοχικές αραιώσεις).
3. Διανείμετε στην πλάκα 96 φρεατίων:
   Προσθέστε τα αντιμικροβιακά διαλύματα στις κοιλότητες μιας τυποποιημένης πλάκας 96 κοιλοτήτων, με τελικό όγκο φρεατίου ~150-200 μL.
   Συμπεριλάβετε ελέγχους ανάπτυξης (χωρίς αντιμικροβιακά) και ελέγχους στειρότητας (χωρίς βακτηριακό εμβόλιο).

Βήμα 2: Σχηματισμός βιοϋμενίου στο καπάκι του μανταλάκι

• Συνδέστε το καπάκι του πείρου:
  Τοποθετήστε το ειδικό καπάκι του πείρου στις εμβολιασμένες κοιλότητες, διασφαλίζοντας ότι οι γόμφοι είναι πλήρως βυθισμένοι στο βακτηριακό εναιώρημα.
• Επωάστε την πλάκα:
  Επώαση στην κατάλληλη θερμοκρασία (π.χ. 37°C) για καθορισμένη διάρκεια (π.χ. 24 ώρες) υπό στατικές συνθήκες ώστε να επιτρέπεται ο σχηματισμός βιοφίλμ στους πασσάλους.

Βήμα 3: Έκθεση σε αντιμικροβιακά

• Ξεπλύνετε τους γόμφους:
  Αφαιρέστε το καπάκι από το βακτηριακό εναιώρημα και ξεπλύνετε απαλά με αποστειρωμένο φυσιολογικό ορό ή PBS για να αφαιρέσετε χαλαρά συνδεδεμένα πλαγκτονικά κύτταρα.
• Έκθεση σε αντιμικροβιακά:
  Μεταφέρετε το καπάκι του πείρου σε μια νέα πλάκα 96 κοιλοτήτων που περιέχει τις αντιμικροβιακές αραιώσεις που είχαν παρασκευαστεί νωρίτερα.
  Επώαση για καθορισμένο χρονικό διάστημα (π.χ. 24 ώρες) υπό στατικές συνθήκες ώστε ο αντιμικροβιακός παράγοντας να δράσει στα βιοφίλμ.

Βήμα 4: Υπερήχηση με το Microplate Sonicator UIP400MTP

Το βήμα υπερήχων είναι κρίσιμο για την απόσπαση βιοφίλμ από τα καπάκια των πείρων για την αξιολόγηση της βιωσιμότητας. Ακολουθήστε αυτά τα βήματα για τον UIP400MTP υπερήχων:

1. Προετοιμάστε τη ρύθμιση:
   Γεμίστε μια φρέσκια πλάκα 96 φρεατίων με μέσο ανάκτησης (π.χ. εξουδετερωτικό ζωμό ή αποστειρωμένο μέσο ανάπτυξης) σε κάθε φρεάτιο.
2. Μεταφέρετε το καπάκι του πείρου:
   Αφαιρέστε το καπάκι του πείρου από την πλάκα αντιμικροβιακής επεξεργασίας.
   Ξεπλύνετε το καπάκι του πείρου με αποστειρωμένο φυσιολογικό ορό ή PBS για να αφαιρέσετε τους υπολειμματικούς αντιμικροβιακούς παράγοντες.
3. Τοποθετήστε την πλάκα στον υπερηχητή:
   Συνδέστε το καπάκι του πείρου στην πλάκα του μέσου ανάκτησης.
   Τοποθετήστε την πλάκα του μέσου ανάκτησης στον UIP400MTP υπερήχων, διασφαλίζοντας ότι η πλάκα βρίσκεται κεντραρισμένη και σταθερή όπως στο εγχειρίδιο που περιγράφεται.
4. Ρυθμίστε τις παραμέτρους υπερήχων:
   Ρυθμίστε τις παραμέτρους υπερήχων στο UIP400MTP (οι ρυθμίσεις μπορούν να προσαρμοστούν στο βιοφίλμ):
   Πλάτος: 70-100%.
   Χρόνος υπερήχων: 1-3 λεπτά (ρυθμίστε με βάση τη δομή του βιοφίλμ) σε λειτουργία κύκλου.
5. Υπερήχηση:
   Ξεκινήστε τη διαδικασία υπερήχων. Τα υπερηχητικά κύματα θα διαταράξουν τη μήτρα βιοφίλμ και θα απομακρύνουν τα κύτταρα στο μέσο ανάκτησης.
6. Παρακολουθήστε τη διαδικασία:
   Χρησιμοποιήστε τον αισθητήρα θερμοκρασίας με δυνατότητα σύνδεσης για να παρακολουθήσετε τη θερμοκρασία δείγματος στις κοιλότητες. Το UIP400MTP μπορεί να συνδεθεί με εργαστηριακό ψυκτικό συγκρότημα για ψύξη.
7. Χειρισμός μετά από υπερήχους:
   Μεταφέρεται αμέσως το υπόστρωμα ανάκτησης που περιέχει αποσπασμένα βιοφίλμ σε νέα αποστειρωμένη πλάκα για μετέπειτα ανάλυση.

(Α) Πλάκα που περιέχει TSB με 2% γλυκόζη που χρησιμοποιείται για το σχηματισμό βιοφίλμ, την ανάκτηση κυττάρων και τον προσδιορισμό MIC και MBEC. (Β) Καπάκι με πείρους για σχηματισμό σταφυλοκοκκικών βιοφίλμ.
Τα κύτταρα βιοφίλμ που σχηματίστηκαν στις ακίδες αποσπάστηκαν με υπερήχους (Hielscher Ultrasound Technology) για 5 λεπτά σε πλάκες 96 φρεατίων που περιέχουν φρέσκο μέσο καλλιέργειας για ανάκτηση των κυττάρων.
(Εικόνα και μελέτη: ©de Oliveira et al., 2016)

Βήμα 4: Αξιολόγηση βιωσιμότητας

Αποσπασμένα βιοφίλμ με πλάκες και καλλιέργειες:

1. Εκτελούνται διαδοχικές αραιώσεις του μέσου ανάκτησης και πλάκες σε άγαρ για την απαρίθμηση μονάδων σχηματισμού αποικιών (CFU).
2. Αξιολογήστε το MIC:
   Προσδιορίστε το MIC ως τη χαμηλότερη αντιμικροβιακή συγκέντρωση που αναστέλλει πλήρως την ορατή μικροβιακή ανάπτυξη στο μέσο ανάκτησης.

Ελάχιστη ανασταλτική συγκέντρωση MIC: Παράδειγμα πλάκας μικροτιτλοδότησης και ερμηνεία των αποτελεσμάτων μικροαραίωσης.
(Μελέτη και εικόνα: ©Jaskiewicz et al. 2019)

Σχεδιασμός, Κατασκευή και Συμβουλευτική – Ποιότητα Made in Germany

Hielscher υπερήχων είναι γνωστή για την υψηλότερη ποιότητα και τα πρότυπα σχεδιασμού τους. Η ευρωστία και η εύκολη λειτουργία επιτρέπουν την ομαλή ενσωμάτωση των υπερήχων μας σε βιομηχανικές εγκαταστάσεις. Οι σκληρές συνθήκες και τα απαιτητικά περιβάλλοντα αντιμετωπίζονται εύκολα από τους υπερήχους Hielscher.

Hielscher Υπέρηχοι είναι μια πιστοποιημένη εταιρεία ISO και δίνουν ιδιαίτερη έμφαση σε υψηλής απόδοσης υπερήχων που διαθέτουν state-of-the-art τεχνολογία και φιλικότητα προς το χρήστη. Φυσικά, Hielscher υπερήχων είναι CE συμβατό και πληρούν τις απαιτήσεις των UL, CSA και RoHs.

Διαβάστε εδώ πώς χρησιμοποιείται το UIP400MTP για αποκόλληση βιοϋμενίου στο πρωτόκολλο ASTM E2799 – Έλεγχος της απολυμαντικής αποτελεσματικότητας έναντι του βιοϋμενίου Pseudomonas aeruginosa χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία MBEC.