Πρωτόκολλο ASTM E2799-22 για την αξιολόγηση της αντιμικροβιακής δράσης

Το Hielscher UIP400MTP είναι μια ισχυρή και αποδοτική συσκευή υπερήχησης πλακών πολλαπλών φρεατίων, σχεδιασμένη για να απλοποιεί το στάδιο της υπερήχησης στο πρωτόκολλο ASTM E2799-22. Παρέχοντας ομοιόμορφη υπερηχητική ενέργεια σε ολόκληρη την πλάκα μικροτιτλοδότησης, το UIP400MTP εξασφαλίζει σταθερή και αξιόπιστη αποκόλληση των βιοϋμενίων από τα καπάκια με ακίδες χωρίς να καταστρέφει τα κύτταρα ή να υποβαθμίζει την ακεραιότητα του δείγματος. Η δυνατότητα υψηλής απόδοσης δειγμάτων και η φιλική προς τον χρήστη λειτουργία του μειώνουν σημαντικά τον χρόνο επεξεργασίας, ενώ ταυτόχρονα ενισχύουν την επαναληψιμότητα, καθιστώντας το ιδανική λύση για εργαστήρια που διεξάγουν δοκιμασίες βιωσιμότητας βιοϋμενίων και δοκιμές αντιμικροβιακής αποτελεσματικότητας.

ASTM E2799

Το ASTM E2799 είναι μια τυποποιημένη μέθοδος δοκιμής σχεδιασμένη για την αξιολόγηση της αποτελεσματικότητας αντιμικροβιακών παραγόντων έναντι βιοϋμενίων, με ειδική εστίαση στο Pseudomonas aeruginosa. Τα βιοϋμένια είναι σύνθετες μικροβιακές κοινότητες που προσκολλώνται σε επιφάνειες και παρουσιάζουν αυξημένη αντοχή στις αντιμικροβιακές αγωγές, γεγονός που τα καθιστά σημαντική πρόκληση στον τομέα της υγειονομικής περίθαλψης, στη βιομηχανία και στο περιβάλλον. Η μέθοδος αυτή χρησιμοποιεί τη δοκιμασία Ελάχιστης Συγκέντρωσης Εκρίζωσης Βιοϋμενίου (MBEC) για να παρέχει ένα αξιόπιστο και αναπαραγώγιμο πλαίσιο για τη δοκιμή απολυμαντικών υπό ρεαλιστικές συνθήκες βιοϋμενίου.

Πώς συμβάλλει η υπερήχηση στο ASTM E2799;

Η υπερήχηση διαδραματίζει κρίσιμο ρόλο στο πρωτόκολλο ASTM E2799, διευκολύνοντας την αποκόλληση των βιοϋμενίων από τις επιφάνειες δοκιμής και εξασφαλίζοντας ακριβή αξιολόγηση της μικροβιακής βιωσιμότητας μετά την επεξεργασία. Με τη χρήση ελεγχόμενης υπερηχητικής ενέργειας, το πρωτόκολλο επιτυγχάνει αποτελεσματική και σταθερή διάσπαση του βιοϋμενίου χωρίς να καταστρέφει τα κύτταρα, επιτρέποντας ακριβή και αναπαραγώγιμα αποτελέσματα. Αυτό καθιστά το ASTM E2799 ένα απαραίτητο εργαλείο για την προώθηση της έρευνας στα βιοϋμένια και την ανάπτυξη αποτελεσματικών αντιμικροβιακών στρατηγικών.

Πώς να εκτελέσετε τη δοκιμασία MBEC σύμφωνα με το ASTM E2799-22

Το πρωτόκολλο ASTM E2799-22 περιγράφει τα βήματα για την αξιολόγηση της αποτελεσματικότητας αντιμικροβιακών παραγόντων έναντι βιοϋμενίων. Όταν χρησιμοποιείται η συσκευή υπερήχησης πλακών μικροτιτλοδότησης Hielscher UIP400MTP, το πρωτόκολλο μπορεί να προσαρμοστεί ώστε να ενσωματώνει αυτή την προηγμένη μέθοδο υπερήχησης για την αποκόλληση των βιοϋμενίων. Ακολουθεί μια περιγραφή των βημάτων, προσαρμοσμένων στη χρήση της συσκευής υπερήχησης μικροπλακών UIP400MTP:

1. Προετοιμασία των βιοϋμενίων
   Προετοιμάστε μια αποστειρωμένη πλάκα μικροτιτλοδότησης 96 φρεατίων με αποσπώμενα καπάκια με ακίδες.
   Ενοφθαλμίστε τα φρεάτια με ένα τυποποιημένο βακτηριακό εναιώρημα σε κατάλληλο θρεπτικό μέσο ανάπτυξης.
   Τοποθετήστε το καπάκι με ακίδες πάνω στην πλάκα, βεβαιωνόμενοι ότι οι ακίδες είναι πλήρως βυθισμένες στο βακτηριακό εναιώρημα.
   Επωάστε την πλάκα υπό ελεγχόμενες συνθήκες (π.χ. θερμοκρασία και χρόνος) ώστε να επιτραπεί ο σχηματισμός βιοϋμενίου στις ακίδες.
2. Επεξεργασία με αντιμικροβιακούς παράγοντες
   Μετά τον σχηματισμό του βιοϋμενίου, αντικαταστήστε το θρεπτικό μέσο με φρέσκο θρεπτικό μέσο που περιέχει τους υπό δοκιμή αντιμικροβιακούς παράγοντες σε διαφορετικές συγκεντρώσεις.
   Τοποθετήστε ξανά το καπάκι με ακίδες και επωάστε υπό τις συνθήκες που καθορίζονται στον σχεδιασμό της δοκιμής.
3. Προετοιμασία για την αποκόλληση του βιοϋμενίου
   Μετά την επεξεργασία, ξεπλύνετε το καπάκι με ακίδες βυθίζοντάς το σε αποστειρωμένο διάλυμα έκπλυσης, ώστε να απομακρυνθούν οι υπολειμματικοί αντιμικροβιακοί παράγοντες και τα χαλαρά προσκολλημένα πλαγκτονικά κύτταρα.
4. Αποκόλληση του βιοϋμενίου με τη συσκευή υπερήχησης UIP400MTP
   Προετοιμάστε μια φρέσκια πλάκα μικροτιτλοδότησης 96 φρεατίων που περιέχει μέσο ανάκτησης (π.χ. εξουδετερωτικό ζωμό).
   Αποκολλήστε τα βιοϋμένια τοποθετώντας το καπάκι με ακίδες μέσα στα φρεάτια της πλάκας με το μέσο ανάκτησης.
   Εισαγάγετε την πλάκα στη συσκευή υπερήχησης UIP400MTP, βεβαιωνόμενοι ότι το καπάκι και η πλάκα είναι σωστά ευθυγραμμισμένα.
   Ρυθμίστε τη συσκευή υπερήχησης σε πλάτος 70%-80% και πραγματοποιήστε υπερήχηση για 3-4 λεπτά σε λειτουργία κύκλου, ώστε να εξασφαλιστεί σταθερή αποκόλληση του βιοϋμενίου χωρίς λύση των κυττάρων.
5. Αξιολόγηση της βιωσιμότητας του βιοϋμενίου
   Μετά την υπερήχηση, επεξεργαστείτε το μέσο ανάκτησης που περιέχει τα αποκολλημένα κύτταρα του βιοϋμενίου χρησιμοποιώντας τυπικές μικροβιολογικές ή αναλυτικές τεχνικές, όπως:
   • Μετρήσεις μονάδων σχηματισμού αποικιών (CFU): Πραγματοποιήστε διαδοχικές αραιώσεις και επιστρώστε σε άγαρ για την καταμέτρηση των βιώσιμων κυττάρων.
   • Μετρήσεις οπτικής πυκνότητας (OD): Χρησιμοποιήστε φασματοφωτομετρική ανάλυση για την εκτίμηση της κυτταρικής πυκνότητας.
   • Δοκιμασίες βιωσιμότητας με βάση τον φθορισμό: Ποσοτικοποιήστε τα ζωντανά και τα νεκρά κύτταρα χρησιμοποιώντας φθορίζουσες χρωστικές.
6. Ανάλυση δεδομένων
   Συγκρίνετε τα δεδομένα βιωσιμότητας των βιοϋμενίων που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία και εκείνων που δεν υποβλήθηκαν, για να προσδιορίσετε την αποτελεσματικότητα των αντιμικροβιακών παραγόντων.
   Υπολογίστε την ελάχιστη συγκέντρωση εκρίζωσης βιοϋμενίου (MBEC) με βάση τη συγκέντρωση που απαιτείται για την εξάλειψη των βιώσιμων κυττάρων του βιοϋμενίου.
7. Έλεγχος ποιότητας
   Εξασφαλίστε σταθερές συνθήκες υπερήχησης βαθμονομώντας τακτικά το UIP400MTP και επαληθεύοντας ότι η διαδικασία αποκόλλησης του βιοϋμενίου δεν οδηγεί σε σημαντική λύση ή καταστροφή των κυττάρων.
   Συμπεριλάβετε κατάλληλους μάρτυρες, όπως βιοϋμένια χωρίς επεξεργασία και τυφλά δείγματα μόνο με θρεπτικό μέσο, για την επικύρωση των αποτελεσμάτων.

Τα κύτταρα του βιοϋμενίου που σχηματίστηκαν στις ακίδες αποκολλήθηκαν με υπερήχηση (Hielscher Ultrasound Technology, Teltow, Γερμανία, UIP250MTP) για 5 min σε πλάκες 96 φρεατίων που περιείχαν φρέσκο θρεπτικό μέσο καλλιέργειας για την ανάκτηση των κυττάρων.
(Εικόνα και μελέτη: ©de Oliveira et al., 2016)

Με την ενσωμάτωση του UIP400MTP στη ροή εργασιών του ASTM E2799-22, η διαδικασία αποκόλλησης του βιοϋμενίου βελτιστοποιείται ως προς τη συνέπεια, την αποδοτικότητα και τις εφαρμογές υψηλής απόδοσης.