Πρωτόκολλο ASTM E2799-22 για αντιμικροβιακή αξιολόγηση

Το Hielscher UIP400MTP είναι ένας ισχυρός και αποτελεσματικός υπερηχητικός πλάκας πολλαπλών φρεατίων που έχει σχεδιαστεί για τον εξορθολογισμό του βήματος υπερήχων στο πρωτόκολλο ASTM E2799-22. Παρέχοντας ομοιόμορφη υπερηχητική ενέργεια σε ολόκληρη την πλάκα μικροτιτλοδότησης, η UIP400MTP εξασφαλίζει συνεπή και αξιόπιστη αποκόλληση βιοφίλμ από τα καπάκια των πείρων χωρίς να καταστρέφει τα κύτταρα ή να θέτει σε κίνδυνο την ακεραιότητα του δείγματος. Η ικανότητα υψηλής απόδοσης και η φιλική προς το χρήστη λειτουργία του μειώνουν σημαντικά το χρόνο επεξεργασίας, ενισχύοντας παράλληλα την αναπαραγωγιμότητα, καθιστώντας το ιδανική λύση για εργαστήρια που διεξάγουν δοκιμές βιωσιμότητας βιοϋμενίου και δοκιμές αντιμικροβιακής αποτελεσματικότητας.

ASTM E2799

Το ASTM E2799 είναι μια τυποποιημένη μέθοδος δοκιμών που έχει σχεδιαστεί για την αξιολόγηση της αποτελεσματικότητας των αντιμικροβιακών παραγόντων έναντι των βιοφίλμ, εστιάζοντας ειδικά στην Pseudomonas aeruginosa. Τα βιοφίλμ είναι πολύπλοκες μικροβιακές κοινότητες που προσκολλώνται σε επιφάνειες και παρουσιάζουν αυξημένη αντοχή στις αντιμικροβιακές θεραπείες, καθιστώντας τα σημαντική πρόκληση σε υγειονομικά, βιομηχανικά και περιβαλλοντικά πλαίσια. Αυτή η μέθοδος χρησιμοποιεί τη δοκιμασία ελάχιστης συγκέντρωσης εξάλειψης βιοϋμενίου (MBEC) για να παρέχει ένα αξιόπιστο και αναπαραγώγιμο πλαίσιο για τη δοκιμή απολυμαντικών υπό ρεαλιστικές συνθήκες βιοϋμενίου.

Πώς Sonication συμβάλλει στην ASTM E2799?

Κατεργασία με υπερήχους διαδραματίζει κρίσιμο ρόλο στο πρωτόκολλο ASTM E2799 διευκολύνοντας την αποκόλληση βιοφίλμ από τις επιφάνειες δοκιμής, εξασφαλίζοντας ακριβή αξιολόγηση της μικροβιακής βιωσιμότητας μετά τη θεραπεία. Με τη χρήση ελεγχόμενης υπερηχητικής ενέργειας, το πρωτόκολλο επιτυγχάνει αποτελεσματική και συνεπή διαταραχή του βιοϋμενίου χωρίς να καταστρέφει τα κύτταρα, επιτρέποντας ακριβή και αναπαραγώγιμα αποτελέσματα. Αυτό καθιστά το ASTM E2799 ένα ουσιαστικό εργαλείο για την προώθηση της έρευνας βιοϋμενίου και την ανάπτυξη αποτελεσματικών αντιμικροβιακών στρατηγικών.

Πώς να εκτελέσετε τη δοκιμασία MBEC σύμφωνα με το ASTM E2799-22

Το πρωτόκολλο ASTM E2799-22 περιγράφει τα βήματα για την αξιολόγηση της αποτελεσματικότητας των αντιμικροβιακών παραγόντων έναντι των βιοφίλμ. Όταν χρησιμοποιείτε το Hielscher UIP400MTP υπερήχων πλάκας μικροτιτλοδότησης, το πρωτόκολλο μπορεί να προσαρμοστεί για να ενσωματώσει αυτήν την προηγμένη μέθοδο υπερήχων για αποκόλληση βιοφίλμ. Ακολουθεί μια περιγραφή των βημάτων που είναι προσαρμοσμένα στη χρήση του UIP400MTP υπερήχων μικροπλακών:

1. Παρασκευή βιοφίλμ
   Προετοιμάστε μια αποστειρωμένη πλάκα μικροτιτλοδότησης 96 φρεατίων με αποσπώμενα καπάκια.
   Εμβολιάστε τα φρεάτια με τυποποιημένο βακτηριακό εναιώρημα σε κατάλληλο μέσο ανάπτυξης.
   Τοποθετήστε το καπάκι του πείρου στην πλάκα, διασφαλίζοντας ότι οι γόμφοι είναι πλήρως βυθισμένοι στο βακτηριακό εναιώρημα.
   Επώαση της πλάκας υπό ελεγχόμενες συνθήκες (π.χ. θερμοκρασία και χρόνος) για να επιτραπεί ο σχηματισμός βιοφίλμ στους πασσάλους.
2. Θεραπεία με αντιμικροβιακούς παράγοντες
   Μετά το σχηματισμό βιοφίλμ, αντικαθίσταται το θρεπτικό μέσο με νέο θρεπτικό μέσο που περιέχει τους δοκιμαζόμενους αντιμικροβιακούς παράγοντες σε διαφορετικές συγκεντρώσεις.
   Επανατοποθετήστε το καπάκι του πασσάλου και επωάστε υπό τις συνθήκες που καθορίζονται στο σχεδιασμό της δοκιμής.
3. Προετοιμασία για αποκόλληση βιοϋμενίου
   Μετά τη θεραπεία, ξεπλύνετε το καπάκι του πείρου βυθίζοντάς το σε ένα αποστειρωμένο διάλυμα έκπλυσης για να αφαιρέσετε τους υπολειμματικούς αντιμικροβιακούς παράγοντες και τα χαλαρά προσκολλημένα πλαγκτονικά κύτταρα.
4. Αποκόλληση βιοϋμενίου χρησιμοποιώντας το UIP400MTP Sonicator
   Προετοιμάστε μια νέα πλάκα μικροτιτλοδότησης 96 κοιλοτήτων που περιέχει ένα μέσο ανάκτησης (π.χ. εξουδετερωτικό ζωμό).
   Αποσυνδέστε τα βιοφίλμ τοποθετώντας το καπάκι του πείρου στις κοιλότητες της πλάκας του μέσου ανάκτησης.
   Τοποθετήστε την πλάκα στον UIP400MTP υπερήχων, διασφαλίζοντας ότι το καπάκι και η πλάκα είναι σωστά ευθυγραμμισμένα.
   Ρυθμίστε τον υπερήχων σε πλάτος 70%-80% και υπερήχων για 3-4 λεπτά σε λειτουργία κύκλου, για να εξασφαλίσετε συνεπή αποκόλληση βιοϋμενίου χωρίς κυτταρική λύση.
5. Αξιολόγηση Βιωσιμότητας Βιοϋμενίου
   Μετά από υπερήχους, επεξεργαστείτε το μέσο ανάκτησης που περιέχει αποσπασμένα κύτταρα βιοφίλμ χρησιμοποιώντας τυποποιημένες μικροβιολογικές ή αναλυτικές τεχνικές, όπως:
   • Μετρήσεις μονάδων σχηματισμού αποικιών (CFU): Εκτελούνται διαδοχικές αραιώσεις και πλάκα σε άγαρ για βιώσιμη καταμέτρηση κυττάρων.
   • Μετρήσεις οπτικής πυκνότητας (OD): Χρησιμοποιήστε φασματοφωτομετρική ανάλυση για την εκτίμηση της πυκνότητας των κυττάρων.
   • Δοκιμασίες βιωσιμότητας με βάση τον φθορισμό: Ποσοτικοποίηση ζωντανών και νεκρών κυττάρων χρησιμοποιώντας φθορίζουσες βαφές.
6. Ανάλυση δεδομένων
   Συγκρίνετε τα δεδομένα βιωσιμότητας των επεξεργασμένων και μη επεξεργασμένων βιοφίλμ για να προσδιορίσετε την αποτελεσματικότητα των αντιμικροβιακών παραγόντων.
   Υπολογίζεται η ελάχιστη συγκέντρωση εκρίζωσης βιοϋμενίου (MBEC) με βάση τη συγκέντρωση που απαιτείται για την εξάλειψη βιώσιμων κυττάρων βιοϋμενίου.
7. έλεγχος ποιότητας
   Εξασφαλίστε συνεπείς συνθήκες υπερήχων βαθμονομώντας τακτικά το UIP400MTP και επαληθεύοντας ότι η διαδικασία αποκόλλησης βιοϋμενίου δεν οδηγεί σε σημαντική κυτταρική λύση ή καταστροφή.
   Συμπεριλάβετε κατάλληλους μάρτυρες, όπως ακατέργαστα βιοφίλμ και ακατέργαστα τεμάχια μόνο μεσαίου μεγέθους, για την επικύρωση των αποτελεσμάτων.

Τα κύτταρα βιοφίλμ που σχηματίστηκαν στις ακίδες αποσπάστηκαν με υπερήχους (Hielscher Ultrasound Technology, Teltow, Γερμανία, UIP250MTP) για 5 λεπτά σε πλάκες 96 φρεατίων που περιείχαν φρέσκο μέσο καλλιέργειας για την ανάκτηση των κυττάρων.
(Εικόνα και μελέτη: ©de Oliveira et al., 2016)

Με την ενσωμάτωση του UIP400MTP στη ροή εργασίας ASTM E2799-22, η διαδικασία αποκόλλησης βιοϋμενίου βελτιστοποιείται για εφαρμογές συνέπειας, αποτελεσματικότητας και υψηλής απόδοσης.