Πρωτόκολλο δοκιμασίας MBEC με τη συσκευή υπερήχησης πλακών 96 βοθρίων UIP400MTP

Η δοκιμασία MBEC χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης αντιμικροβιακών παραγόντων που απαιτείται για την εξάλειψη βιοϋμενίων που σχηματίζονται σε καπάκια με ακίδες. Για την αξιολόγηση της βιωσιμότητας των βιοϋμενίων, τα βιοϋμένια πρέπει πρώτα να αποκολληθούν από τα καπάκια με ακίδες μιας πλάκας 96 βοθρίων. Η υπερήχηση είναι η πιο αξιόπιστη και αποτελεσματική μέθοδος για αυτή την αποκόλληση. Η συσκευή υπερήχησης πλακών πολλαπλών βοθρίων UIP400MTP έχει σχεδιαστεί ειδικά για την επεξεργασία πλακών δοκιμασιών με μέγιστη αποτελεσματικότητα και ευχρηστία, απλοποιώντας και επιταχύνοντας τις δοκιμασίες MBEC υψηλής διεκπεραιωτικής ικανότητας.

Υπερήχηση για την αποκόλληση βιοϋμενίων

Η υπερήχηση αποτελεί κρίσιμο στάδιο στις δοκιμασίες ελάχιστης συγκέντρωσης εκρίζωσης βιοϋμενίου (MBEC), επιτρέποντας την αποτελεσματική αποκόλληση των κυττάρων του βιοϋμενίου από την επιφάνεια στην οποία είναι προσκολλημένα. Τα βιοϋμένια είναι εκ φύσεως δομημένες κοινότητες μικροοργανισμών που περιβάλλονται από μια εξωκυττάρια μήτρα, η οποία τα καθιστά σημαντικά πιο ανθεκτικά στους αντιμικροβιακούς παράγοντες σε σύγκριση με τα πλαγκτονικά κύτταρα. Κατά τις δοκιμασίες MBEC, η υπερήχηση χρησιμοποιεί υπερηχητικά κύματα για τη δημιουργία ελεγχόμενης σπηλαίωσης, διασπώντας τη μήτρα του βιοϋμενίου και απελευθερώνοντας τα εγκλωβισμένα κύτταρα σε εναιώρημα. Αυτό το στάδιο διασφαλίζει την ομοιόμορφη διασπορά των κυττάρων του βιοϋμενίου στο μέσο ανάκτησης, διευκολύνοντας την ακριβή αξιολόγηση της βιωσιμότητας με μεθόδους επίστρωσης σε πλάκες, αραίωσης ή φασματοφωτομετρίας. Χωρίς κατάλληλη αποκόλληση του βιοϋμενίου, τα υπολειμματικά συστατικά της μήτρας θα μπορούσαν να προστατεύσουν τα κύτταρα, οδηγώντας σε υποεκτίμηση της αντιμικροβιακής αποτελεσματικότητας. Επομένως, η υπερήχηση είναι απαραίτητη για την απόκτηση αξιόπιστων και αναπαραγώγιμων τιμών MBEC, οι οποίες αντανακλούν την πραγματική δυνατότητα εκρίζωσης των υπό δοκιμή παραγόντων. Η συσκευή υπερήχησης πλακών πολλαπλών βοθρίων UIP400MTP επιτρέπει την εύκολη προετοιμασία δειγμάτων υψηλής διεκπεραιωτικής ικανότητας σε πλάκες δοκιμασιών.

Πρωτόκολλο δοκιμασίας ελάχιστης συγκέντρωσης εκρίζωσης βιοϋμενίου (MBEC)

Βήμα 1: Σχηματισμός βιοϋμενίου

1. Προετοιμάστε το βακτηριακό εναιώρημα:
   Καλλιεργήστε τα βακτήρια σε κατάλληλα μέσα μέχρι τη λογαριθμική φάση ανάπτυξης.
   Αραιώστε τη βακτηριακή καλλιέργεια σε καθορισμένη οπτική πυκνότητα (π.χ. OD600 ~0,1).
2. Ενοφθαλμίστε την πλάκα 96 βοθρίων:
   Προσθέστε το βακτηριακό εναιώρημα (π.χ. 150–200 µL) σε κάθε βοθρίο μιας τυπικής πλάκας μικροτιτλοδότησης 96 βοθρίων.
3. Τοποθετήστε το καπάκι με ακίδες:
   Τοποθετήστε το καπάκι με ακίδες στην ενοφθαλμισμένη πλάκα, ώστε να επιτραπεί ο σχηματισμός βιοϋμενίου στις επιφάνειες των ακίδων.
4. Επωάστε την πλάκα:
   Επωάστε τη διάταξη σε κατάλληλη θερμοκρασία (π.χ. 37°C) για 24–48 ώρες χωρίς ανακίνηση, ώστε να προαχθεί η ανάπτυξη βιοϋμενίου.

Βήμα 2: Επεξεργασία με αντιμικροβιακούς παράγοντες

• Προετοιμάστε τα αντιμικροβιακά διαλύματα:
  Προετοιμάστε μια σειρά συγκεντρώσεων αντιμικροβιακών παραγόντων σε φρέσκα μέσα.
  Εκθέστε τα βιοϋμένια σε αντιμικροβιακούς παράγοντες:
  Αφαιρέστε το καπάκι με ακίδες από τη βακτηριακή καλλιέργεια και ξεπλύνετέ το με στείρο φυσιολογικό ορό ή PBS για την απομάκρυνση των πλαγκτονικών κυττάρων.
  Τοποθετήστε το καπάκι με ακίδες σε νέα πλάκα 96 βοθρίων που περιέχει τα αντιμικροβιακά διαλύματα.
• Επωάστε την πλάκα:
  Επωάστε για καθορισμένο χρονικό διάστημα (π.χ. 24 ώρες), ώστε να επιτραπεί η έκθεση στους αντιμικροβιακούς παράγοντες.

Βήμα 3: Υπερήχηση με τη συσκευή υπερήχησης πλακών 96 βοθρίων UIP400MTP

Το στάδιο της υπερήχησης είναι κρίσιμο για την αποκόλληση των βιοϋμενίων από τα καπάκια με ακίδες, ώστε να αξιολογηθεί η βιωσιμότητά τους. Ακολουθήστε τα παρακάτω βήματα για τη συσκευή υπερήχησης UIP400MTP:

1. Προετοιμάστε τη διάταξη:
   Γεμίστε κάθε βοθρίο μιας νέας πλάκας 96 βοθρίων με μέσο ανάκτησης (π.χ. ζωμό εξουδετέρωσης ή φρέσκο θρεπτικό μέσο).
2. Μεταφέρετε το καπάκι με ακίδες:
   Αφαιρέστε το καπάκι με ακίδες από την πλάκα επεξεργασίας με αντιμικροβιακούς παράγοντες.
   Ξεπλύνετε το καπάκι με ακίδες με στείρο φυσιολογικό ορό ή PBS για την απομάκρυνση των υπολειμματικών αντιμικροβιακών παραγόντων.
3. Τοποθετήστε την πλάκα και τη συσκευή υπερήχησης:
   Τοποθετήστε το καπάκι με ακίδες στην πλάκα με το μέσο ανάκτησης.
   Τοποθετήστε την πλάκα με το μέσο ανάκτησης στην πλατφόρμα της συσκευής υπερήχησης UIP400MTP, διασφαλίζοντας ότι η πλάκα είναι κεντραρισμένη και σταθερή.
4. Ρυθμίστε τις παραμέτρους υπερήχησης:
   Ορίστε τις παραμέτρους υπερήχησης στο UIP400MTP (οι ρυθμίσεις μπορούν να προσαρμοστούν στο βιοϋμένιο):
   Πλάτος ταλάντωσης: 70–100%.
   Χρόνος υπερήχησης: 1–3 λεπτά (προσαρμόστε ανάλογα με την ανθεκτικότητα του βιοϋμενίου) σε κυκλική λειτουργία.
5. Εφαρμόστε υπερήχηση:
   Ξεκινήστε τη διαδικασία υπερήχησης. Η υπερηχητική δόνηση θα αποκολλήσει τα βιοϋμένια από τις επιφάνειες των ακίδων και θα τα μεταφέρει στο μέσο ανάκτησης.
6. Παρακολουθήστε τη διαδικασία:
   Χρησιμοποιήστε τον συνδεόμενο αισθητήρα θερμοκρασίας για την παρακολούθηση της θερμοκρασίας των δειγμάτων στα βοθρία. Το UIP400MTP μπορεί να συνδεθεί με εργαστηριακό ψύκτη για ψύξη.
7. Χειρισμός μετά την υπερήχηση:
   Μεταφέρετε αμέσως το μέσο ανάκτησης (που πλέον περιέχει αποκολλημένα βιοϋμένια) σε νέα στείρα πλάκα για επακόλουθη ανάλυση.

(A) Πλάκα που περιέχει TSB με 2% γλυκόζη και χρησιμοποιείται για τον σχηματισμό βιοϋμενίου, την ανάκτηση κυττάρων και
τον προσδιορισμό των MIC και MBCB· (B) Καπάκι με ακίδες για τον σχηματισμό σταφυλοκοκκικών βιοϋμενίων. προσδιορισμός των MIC και MBCB· (B) Καπάκι με ακίδες για τον σχηματισμό σταφυλοκοκκικών βιοϋμενίων.
Τα κύτταρα του βιοϋμενίου που σχηματίστηκαν στις ακίδες αποκολλήθηκαν με υπερήχηση (Hielscher Ultrasound Technology) για 5 min σε πλάκες 96 βοθρίων που περιείχαν φρέσκο μέσο καλλιέργειας για την ανάκτηση των κυττάρων.
(Εικόνα και μελέτη: ©de Oliveira et al., 2016)

Βήμα 4: Αξιολόγηση βιωσιμότητας

Επιστρώστε σε πλάκες και καλλιεργήστε τα αποκολλημένα βιοϋμένια:

1. Πραγματοποιήστε διαδοχικές αραιώσεις του μέσου ανάκτησης και επιστρώστε σε άγαρ για την καταμέτρηση των μονάδων σχηματισμού αποικιών (CFU).
   Εναλλακτικά, χρησιμοποιήστε χρωματομετρική δοκιμασία βιωσιμότητας ή δοκιμασία βιωσιμότητας με βάση τον φθορισμό.
2. Καταγράψτε τα αποτελέσματα:
   Προσδιορίστε την MBEC ως τη χαμηλότερη συγκέντρωση αντιμικροβιακού παράγοντα που εξάλειψε την ανιχνεύσιμη βιωσιμότητα του βιοϋμενίου.

Σχεδιασμός, κατασκευή και συμβουλευτική – Ποιότητα γερμανικής κατασκευής

Οι συσκευές υπερήχησης Hielscher είναι γνωστές για τα υψηλότατα πρότυπα ποιότητας και σχεδιασμού τους. Η στιβαρότητα και η ευκολία χειρισμού επιτρέπουν την ομαλή ενσωμάτωση των συσκευών υπερήχησής μας σε βιομηχανικές εγκαταστάσεις. Οι συσκευές υπερήχησης Hielscher ανταποκρίνονται με ευκολία σε δύσκολες συνθήκες και απαιτητικά περιβάλλοντα.

Η Hielscher Ultrasonics είναι εταιρεία πιστοποιημένη κατά ISO και δίνει ιδιαίτερη έμφαση σε συσκευές υπερήχησης υψηλών επιδόσεων που διαθέτουν τεχνολογία αιχμής και ευχρηστία. Φυσικά, οι συσκευές υπερήχησης Hielscher συμμορφώνονται με το CE και πληρούν τις απαιτήσεις των UL, CSA και RoHs.

Διαβάστε εδώ πώς χρησιμοποιείται το UIP400MTP για την αποκόλληση βιοϋμενίων ως στάδιο προετοιμασίας δειγμάτων κατά το πρωτόκολλο ASTM E2799 για τον έλεγχο της αποτελεσματικότητας απολυμαντικών έναντι βιοϋμενίου Pseudomonas aeruginosa με τη δοκιμασία MBEC.