Πρωτόκολλο ανάλυσης MBEC χρησιμοποιώντας το UIP400MTP Plate Sonicator 96 φρεατίων

Η δοκιμασία MBEC χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης αντιμικροβιακών παραγόντων που απαιτούνται για την εξάλειψη των βιοφίλμ που σχηματίζονται στα καπάκια. Για να εκτιμηθεί η βιωσιμότητα του βιοϋμενίου, τα βιοφίλμ πρέπει πρώτα να αποσπαστούν από τα καπάκια ενός τρυβλίου 96 κοιλοτήτων. Κατεργασία με υπερήχους είναι η πιο αξιόπιστη και αποτελεσματική μέθοδος για αυτή την απόσπαση. Η UIP400MTP υπερήχων πλάκας πολλαπλών φρεατίων έχει σχεδιαστεί ειδικά για την επεξεργασία πλακών ανάλυσης με μέγιστη απόδοση και ευκολία, εξορθολογίζοντας και επιταχύνοντας τις δοκιμασίες MBEC υψηλής απόδοσης.

Υπερήχηση για αποκόλληση βιοϋμενίου

Κατεργασία με υπερήχους είναι ένα κρίσιμο βήμα στις δοκιμές ελάχιστης συγκέντρωσης εξάλειψης βιοϋμενίου (MBEC), επιτρέποντας την αποτελεσματική απομάκρυνση των κυττάρων βιοφίλμ από την προσκόλλησή τους στην επιφάνεια. Τα βιοφίλμ είναι εγγενώς δομημένες κοινότητες μικροοργανισμών εγκλωβισμένων σε μια εξωκυτταρική μήτρα, γεγονός που τα καθιστά σημαντικά πιο ανθεκτικά στους αντιμικροβιακούς παράγοντες σε σύγκριση με τα πλαγκτονικά κύτταρα. Κατά τη διάρκεια των δοκιμασιών MBEC, κατεργασία με υπερήχους χρησιμοποιεί υπερηχητικά κύματα για τη δημιουργία ελεγχόμενης σπηλαίωσης, διαταράσσοντας τη μήτρα βιοφίλμ και απελευθερώνοντας ενσωματωμένα κύτταρα σε ένα εναιώρημα. Αυτό το βήμα διασφαλίζει ότι τα κύτταρα βιοϋμενίου είναι ομοιόμορφα διασκορπισμένα στο μέσο ανάκτησης, διευκολύνοντας τις ακριβείς εκτιμήσεις βιωσιμότητας μέσω επιμετάλλωσης, αραίωσης ή φασματοφωτομετρικών μεθόδων. Χωρίς την κατάλληλη αποκόλληση του βιοϋμενίου, τα υπολειμματικά συστατικά της μήτρας θα μπορούσαν να προστατεύσουν τα κύτταρα, οδηγώντας σε υποεκτίμηση της αντιμικροβιακής αποτελεσματικότητας. Ως εκ τούτου, υπερήχηση είναι απαραίτητη για την απόκτηση αξιόπιστων και αναπαραγώγιμων τιμών MBEC, αντανακλώντας το πραγματικό δυναμικό εξάλειψης των δοκιμασμένων παραγόντων. Ο υπερηχητικός UIP400MTP πλάκα πολλαπλών φρεατίων επιτρέπει την εύκολη προετοιμασία δείγματος υψηλής απόδοσης σε πλάκες ανάλυσης.

Πρωτόκολλο δοκιμασίας ελάχιστης συγκέντρωσης εξάλειψης βιοϋμενίου (MBEC)

Βήμα 1: Σχηματισμός βιοϋμενίου

1. Προετοιμάστε το βακτηριακό εναιώρημα:
   Αναπτύξτε βακτήρια σε κατάλληλα μέσα για να αναπτύξετε τη φάση καταγραφής.
   Αραιώστε τη βακτηριακή καλλιέργεια σε καθορισμένη οπτική πυκνότητα (π.χ. OD600 ~0,1).
2. Εμβολιάστε την πλάκα 96 κοιλοτήτων:
   Προσθέστε το βακτηριακό εναιώρημα (π.χ. 150-200 μL) σε κάθε κοιλότητα μιας τυπικής πλάκας μικροτιτλοδότησης 96 κοιλοτήτων.
3. Συνδέστε το καπάκι του πείρου:
   Τοποθετήστε το καπάκι του πείρου στην εμβολιασμένη πλάκα για να επιτρέψετε το σχηματισμό βιοϋμενίου στις επιφάνειες των πασσάλων.
4. Επωάστε την πλάκα:
   Επωάστε τη διάταξη σε κατάλληλη θερμοκρασία (π.χ. 37°C) για 24–48 ώρες χωρίς ανακίνηση για την προώθηση της ανάπτυξης βιοϋμενίου.

Βήμα 2: Θεραπεία με αντιμικροβιακούς παράγοντες

• Προετοιμάστε αντιμικροβιακά διαλύματα:
  Προετοιμάστε μια σειρά αντιμικροβιακών συγκεντρώσεων σε νέα μέσα.
  Εκθέστε τα βιοφίλμ σε αντιμικροβιακούς παράγοντες:
  Αφαιρέστε το καπάκι από τη βακτηριακή καλλιέργεια και ξεπλύνετε με αποστειρωμένο φυσιολογικό ορό ή PBS για να αφαιρέσετε τα πλαγκτονικά κύτταρα.
  Τοποθετήστε το καπάκι του πείρου σε μια νέα πλάκα 96 κοιλοτήτων που περιέχει τα αντιμικροβιακά διαλύματα.
• Επωάστε την πλάκα:
  Επώαση για καθορισμένο χρονικό διάστημα (π.χ. 24 ώρες) ώστε να επιτρέπεται η έκθεση σε αντιμικροβιακά.

Βήμα 3: Υπερήχηση με το 96-Well Plate Sonicator UIP400MTP

Το βήμα υπερήχων είναι κρίσιμο για την απόσπαση βιοφίλμ από τα καπάκια των πείρων για την αξιολόγηση της βιωσιμότητας. Ακολουθήστε αυτά τα βήματα για τον UIP400MTP υπερήχων:

1. Προετοιμάστε τη ρύθμιση:
   Γεμίστε μια φρέσκια πλάκα 96 φρεατίων με μέσο ανάκτησης (π.χ. εξουδετερωτικό ζωμό ή φρέσκο μέσο ανάπτυξης) σε κάθε φρεάτιο.
2. Μεταφέρετε το καπάκι του πείρου:
   Αφαιρέστε το καπάκι του πείρου από την πλάκα αντιμικροβιακής επεξεργασίας.
   Ξεπλύνετε το καπάκι του πείρου με αποστειρωμένο φυσιολογικό ορό ή PBS για να αφαιρέσετε τους υπολειμματικούς αντιμικροβιακούς παράγοντες.
3. Τοποθετήστε την πλάκα και τον υπερήχων:
   Συνδέστε το καπάκι του πείρου στην πλάκα του μέσου ανάκτησης.
   Τοποθετήστε την πλάκα μέσου ανάκτησης στην πλατφόρμα UIP400MTP υπερήχων, διασφαλίζοντας ότι η πλάκα είναι κεντραρισμένη και σταθερή.
4. Ρυθμίστε τις παραμέτρους υπερήχων:
   Ρυθμίστε τις παραμέτρους υπερήχων στο UIP400MTP (Οι ρυθμίσεις μπορούν να προσαρμοστούν στο βιοφίλμ):
   Πλάτος: 70-100%.
   Χρόνος κατεργασίας με υπερήχους: 1-3 λεπτά (ρυθμίστε με βάση την ευρωστία του βιοϋμενίου) σε λειτουργία κύκλου.
5. Υπερήχηση:
   Ξεκινήστε τη διαδικασία υπερήχων. Η υπερηχητική δόνηση θα απομακρύνει τα βιοφίλμ από τις επιφάνειες των πείρων στο μέσο ανάκτησης.
6. Παρακολουθήστε τη διαδικασία:
   Χρησιμοποιήστε τον αισθητήρα θερμοκρασίας με δυνατότητα σύνδεσης για να παρακολουθήσετε τη θερμοκρασία δείγματος στις κοιλότητες. Το UIP400MTP μπορεί να συνδεθεί με εργαστηριακό ψυκτικό συγκρότημα για ψύξη.
7. Χειρισμός μετά από υπερήχους:
   Μεταφέρεται αμέσως το υπόστρωμα ανάκτησης (που περιέχει πλέον αποσπασμένα βιοφίλμ) σε νέα αποστειρωμένη πλάκα για κατάντη ανάλυση.

(Α) Πλάκα που περιέχει TSB με 2% γλυκόζη που χρησιμοποιείται για το σχηματισμό βιοφίλμ, την ανάκτηση κυττάρων και
προσδιορισμός των MIC και MBCB· (Β) Καπάκι με πείρους για σχηματισμό σταφυλοκοκκικών βιοφίλμ. προσδιορισμός των MIC και MBCB· (Β) Καπάκι με πείρους για σχηματισμό σταφυλοκοκκικών βιοφίλμ.
Τα κύτταρα βιοφίλμ που σχηματίστηκαν στις ακίδες αποσπάστηκαν με υπερήχους (Hielscher Ultrasound Technology) για 5 λεπτά σε πλάκες 96 φρεατίων που περιέχουν φρέσκο μέσο καλλιέργειας για ανάκτηση των κυττάρων.
(Εικόνα και μελέτη: ©de Oliveira et al., 2016)

Βήμα 4: Αξιολόγηση βιωσιμότητας

Αποσπασμένα βιοφίλμ με πλάκες και καλλιέργειες:

1. Εκτελούνται διαδοχικές αραιώσεις του μέσου ανάκτησης και πλάκες σε άγαρ για την απαρίθμηση μονάδων σχηματισμού αποικιών (CFU).
   Εναλλακτικά, χρησιμοποιήστε χρωματομετρική δοκιμασία βιωσιμότητας ή δοκιμασία βιωσιμότητας με βάση τον φθορίζοντα.
2. Καταγραφή αποτελεσμάτων:
   Προσδιορίστε το MBEC ως τη χαμηλότερη συγκέντρωση αντιμικροβιακού που εξάλειψε την ανιχνεύσιμη βιωσιμότητα του βιοϋμενίου.

Σχεδιασμός, Κατασκευή και Συμβουλευτική – Ποιότητα Made in Germany

Hielscher υπερήχων είναι γνωστή για την υψηλότερη ποιότητα και τα πρότυπα σχεδιασμού τους. Η ευρωστία και η εύκολη λειτουργία επιτρέπουν την ομαλή ενσωμάτωση των υπερήχων μας σε βιομηχανικές εγκαταστάσεις. Οι σκληρές συνθήκες και τα απαιτητικά περιβάλλοντα αντιμετωπίζονται εύκολα από τους υπερήχους Hielscher.

Hielscher Υπέρηχοι είναι μια πιστοποιημένη εταιρεία ISO και δίνουν ιδιαίτερη έμφαση σε υψηλής απόδοσης υπερήχων που διαθέτουν state-of-the-art τεχνολογία και φιλικότητα προς το χρήστη. Φυσικά, Hielscher υπερήχων είναι CE συμβατό και πληρούν τις απαιτήσεις των UL, CSA και RoHs.

Διαβάστε εδώ πώς χρησιμοποιείται το UIP400MTP για την αποκόλληση βιοϋμενίου ως βήμα προετοιμασίας δείγματος κατά τη διάρκεια του πρωτοκόλλου ASTM E2799 για τον έλεγχο της απολυμαντικής αποτελεσματικότητας έναντι του βιοϋμενίου Pseudomonas aeruginosa χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία MBEC.