Πρωτόκολλο που χρησιμοποιεί υπερήχους πολλαπλών δειγμάτων Hielscher σε βιοϋμένιο και πρωτεομική ανάλυση

Η χρήση υπερήχων πολλαπλών δειγμάτων, όπως το VialTweeter Multi-Tube Sonicator και το UIP400MTP Microplate Sonicator, βελτιστοποιεί τις εργαστηριακές ροές εργασίας για εφαρμογές υψηλής απόδοσης. Και οι δύο συσκευές επιτρέπουν ακριβή και ομοιόμορφη επεξεργασία υπερήχων σε πολλαπλά δείγματα, ελαχιστοποιώντας τη μεταβλητότητα και ενισχύοντας την αναπαραγωγιμότητα. Αυτό είναι ιδιαίτερα επωφελές σε πειράματα που απαιτούν συνεπή λύση δείγματος, αποκόλληση βιοϋμενίου, εκχύλιση πρωτεϊνών ή πρωτεολυτική πέψη, όπου οι χειροκίνητες μέθοδοι ή οι μέθοδοι ενός δείγματος είναι λιγότερο αποτελεσματικές και επιρρεπείς σε ασυνέπεια.

Βελτιώστε τις ροές εργασίας με υπερήχους πολλαπλών δειγμάτων

Η UIP400MTP, για παράδειγμα, επιτρέπει την ταυτόχρονη υπερηχητική επεξεργασία φρεατίων μικροπλακών, εξασφαλίζοντας ομοιόμορφη αποκόλληση βιοφίλμ ή κυτταρικού υλικού. Εν τω μεταξύ, το VialTweeter προσφέρει ακριβή λύση και ομογενοποίηση πολλαπλών δειγμάτων σωλήνων χωρίς διασταυρούμενη μόλυνση. Αυτοί οι υπερήχων μειώνουν σημαντικά τους χρόνους επεξεργασίας, βελτιώνουν την πειραματική αναπαραγωγιμότητα και διατηρούν υψηλή ακεραιότητα δείγματος, καθιστώντας τα απαραίτητα εργαλεία στη μικροβιολογία, την πρωτεομική και την έρευνα μοριακής βιολογίας.
Παρακάτω είναι ένα λεπτομερές πρωτόκολλο που αποτελεί παράδειγμα της χρήσης των μοντέλων υπερήχων πολλαπλών δειγμάτων Hielscher, του VialTweeter Multi-Tube Sonicator και του Microplate Sonicator UIP400MTP, σε μια μελέτη που περιλαμβάνει σχηματισμό βιοφίλμ E. coli και επακόλουθη πρωτεομική ανάλυση.

Πρωτόκολλο: Σχηματισμός βιοφίλμ, αποκόλληση και πρωτεομική ανάλυση χρησιμοποιώντας υπερήχους πολλαπλών δειγμάτων Hielscher

1. Προετοιμασία βακτηριακής καλλιέργειας

• Καλλιέργεια βακτηρίων E. coli (στέλεχος W3110) στους 30°C, θερμοκρασία ευνοϊκή για το σχηματισμό βιοφίλμ E. coli, σε θρεπτικό μέσο ζωμού τρυπτόνης (TB) που περιέχει:
  – 10 g/L τρυπτόνη
  – 5 g/L NaCl
• Συμπληρώστε με αντιβιοτικά, όπως απαιτείται, για να εξασφαλιστεί η κατακράτηση πλασμιδίων.
• Για μελέτες μικροσκοπίας και δράσης υποκινητή, χρησιμοποιείται το στέλεχος W3110 E. coli με έναν ανταποκριτή ενισχυμένης με γονιδιωματική GFP (eGFP) υπό τον έλεγχο του υποκινητή rplL.
• Χρησιμοποιήστε πλασμίδια αναφοράς GFP για διάφορους υποκινητές (π.χ. csgA, csgD, fliA, fliC, flhD ) για τη μέτρηση των δραστηριοτήτων των φορέων υλοποίησης.

2. Καλλιέργεια και αποκόλληση βιοϋμενίου

• Σπεύστε 1,5 mL αραιωμένης βακτηριακής καλλιέργειας ανά φρεάτιο σε ένα τρυβλίο 12 κοιλοτήτων (πλάκες CellStar 12-well, Greiner Bio-One).
• Επώαση για να επιτραπεί ο σχηματισμός βιοφίλμ.
• Αφαιρέστε προσεκτικά την πλαγκτονική (μη προσκολλημένη) καλλιέργεια.

– Έκπλυση κάθε κοιλότητας με 500 μL PBS.
– Αποσυνδέστε τα συνδεδεμένα κύτταρα με υπερήχους την πλάκα 12 κοιλοτήτων στον υπερηχητικό UIP400MTP μικροπλακών. Το UIP400MTP εξασφαλίζει ομοιόμορφη αποκόλληση παρέχοντας συνεπή υπερηχητική ενέργεια σε όλα τα πηγάδια.
– Ρυθμίσεις υπερήχων: 60% πλάτος, λειτουργία κύκλου: 60 sec ON / 30 sec OFF.

3. Συλλογή κυττάρων και λύση

• Φυγοκεντρούνται αποσπασμένα κύτταρα βιοϋμενίου στα 4.500 g επί 5 λεπτά.
• Πλύνετε τα σφαιροποιημένα κύτταρα με PBS.
• Επαναιωρούνται τα κύτταρα σε 100 μL λαουρυλοσαρκοσινικού νατρίου 2% (SLS) και επωάζονται στους 95°C επί 15 λεπτά.
• Υπερήχηση χρησιμοποιώντας το VialTweeter Multi-Tube Sonicator για να εξασφαλιστεί η πλήρης λύση των κυττάρων.
  – Ρυθμίσεις υπερήχων: 100% πλάτος, 50 s ON / 10 s OFF για συνολικό χρόνο λειτουργίας 10 λεπτών. Κρατήστε δείγματα σε πάγο.

4. Μείωση και αλκυλίωση

• Προστίθενται 5 mM Tris(2-καρβοξυαιθυλο)φωσφίνη (TCEP) για τη μείωση των δισουλφιδικών δεσμών και επωάζεται στους 95°C επί 15 λεπτά.
• Αλκυλικές πρωτεΐνες με ιωδοακεταμίδιο 10 mM για 30 λεπτά στους 25°C.

5. Ποσοτικοποίηση πρωτεϊνών και πέψη

• Προϊόντα λύσης φυγοκέντρησης για τον καθαρισμό των υπολειμμάτων.
• Ποσοτικοποιήστε τη συνολική περιεκτικότητα σε πρωτεΐνες χρησιμοποιώντας το Pierce BCA Protein Assay Kit.
• Χωνεύονται 50 μg ολικής πρωτεΐνης με 1 μg θρυψίνης σε διάλυμα που περιέχει 2% SLS και 100 mM όξινο ανθρακικό αμμώνιο.
• Επώαση της αντίδρασης πέψης κατά τη διάρκεια της νύχτας στους 30°C.

6. Καθαρισμός πεπτιδίων

• Καταβυθίζεται το SLS προσθέτοντας 1,5% τριφθοροξικό οξύ (TFA) και στη συνέχεια φυγοκεντρείται.
• Καθαρίστε τα πεπτίδια χρησιμοποιώντας στήλες μικροπεριστροφής C18.
• Ξηρά καθαρισμένα πεπτίδια και επαναιώρηση σε 0,1% TFA.

7. Υγρή Χρωματογραφία-Φασματομετρία Μάζας (LC-MS/MS)

• Αναλύστε τα πεπτίδια σε ένα φασματόμετρο μάζας Q-Exactive Plus σε συνδυασμό με ένα νανοσύστημα Ultimate 3000 RSLC.
• Τα πεπτίδια διαχωρίζονται χρησιμοποιώντας στήλη HPLC αντίστροφης φάσης (75 μm × 42 cm) γεμάτη με ρητίνη C18 (2,4 μm).
• Εφαρμόστε μια κλίση από 2% έως 35% διαλύτη Β (ακετονιτρίλιο με 0,15% μυρμηκικό οξύ) για 140 λεπτά.
• Αποκτήστε δεδομένα χρησιμοποιώντας σαρώσεις MS υψηλής ανάλυσης ακολουθούμενες από διαδοχικές σαρώσεις MS / MS των 10 πιο έντονων ιόντων.

8. Ανάλυση δεδομένων

• Επεξεργασία πρωτογενών δεδομένων LC-MS χρησιμοποιώντας το λογισμικό Progenesis.
• Εξαγωγή .mgf αρχείων και ανάλυσή τους με MASCOT.
• Εκτελέστε ποσοτικοποίηση πεπτιδίων χρησιμοποιώντας το SafeQuant για ποιοτικό έλεγχο και ρύθμιση ψευδούς ανακάλυψης.
• Διεξάγετε όλα τα πειράματα σε διπλότυπα ή τριπλά για να εξασφαλίσετε την αναπαραγωγιμότητα.

Υπερήχων πολλαπλών δειγμάτων για προετοιμασία δειγμάτων υψηλής απόδοσης

Τα μοντέλα υπερήχων πολλαπλών δειγμάτων VialTweeter και UIP400MTP ενισχύουν σημαντικά την ακρίβεια και την αποτελεσματικότητα των πειραματικών ροών εργασίας, ειδικά στην έρευνα βιοϋμενίου και την πρωτεομική. Η ικανότητά τους να επεξεργάζονται πολλαπλά δείγματα εξασφαλίζει ομοιόμορφα υψηλή χωρητικότητα απόδοσης χωρίς συμβιβασμούς στην ποιότητα των δεδομένων. Αυτά τα οφέλη, σε συνδυασμό με τις βελτιωμένες ροές εργασίας που περιγράφονται παραπάνω, καθιστούν Hielscher πολλαπλών δειγμάτων υπερήχων απαραίτητα εργαλεία για τη σύγχρονη βιολογική έρευνα.

Σχεδιασμός, Κατασκευή και Συμβουλευτική – Ποιότητα Made in Germany

Hielscher υπερήχων είναι γνωστή για την υψηλότερη ποιότητα και τα πρότυπα σχεδιασμού τους. Η ευρωστία και η εύκολη λειτουργία επιτρέπουν την ομαλή ενσωμάτωση των υπερήχων μας σε βιομηχανικές εγκαταστάσεις. Οι σκληρές συνθήκες και τα απαιτητικά περιβάλλοντα αντιμετωπίζονται εύκολα από τους υπερήχους Hielscher.

Hielscher Υπέρηχοι είναι μια πιστοποιημένη εταιρεία ISO και δίνουν ιδιαίτερη έμφαση σε υψηλής απόδοσης υπερήχων που διαθέτουν state-of-the-art τεχνολογία και φιλικότητα προς το χρήστη. Φυσικά, Hielscher υπερήχων είναι CE συμβατό και πληρούν τις απαιτήσεις των UL, CSA και RoHs.