Πρωτόκολλο χρήσης συσκευών υπερήχων πολλαπλών δειγμάτων της Hielscher στην ανάλυση βιοϋμενίων και την πρωτεωμική ανάλυση

Η χρήση συσκευών υπερήχων πολλαπλών δειγμάτων, όπως το VialTweeter Multi-Tube Sonicator και το UIP400MTP Microplate Sonicator, απλοποιεί τις εργαστηριακές ροές εργασίας για εφαρμογές υψηλής διεκπεραιωτικής ικανότητας. Και οι δύο συσκευές επιτρέπουν την ακριβή και ομοιόμορφη κατεργασία πολλαπλών δειγμάτων με υπερήχους, ελαχιστοποιώντας τη μεταβλητότητα και ενισχύοντας την αναπαραγωγιμότητα. Αυτό είναι ιδιαίτερα επωφελές σε πειράματα που απαιτούν σταθερά αποτελέσματα στη λύση δειγμάτων, την αποκόλληση βιοϋμενίων, την εκχύλιση πρωτεϊνών ή την πρωτεολυτική πέψη, όπου οι χειροκίνητες μέθοδοι ή οι μέθοδοι επεξεργασίας ενός δείγματος κάθε φορά είναι λιγότερο αποδοτικές και επιρρεπείς σε ασυνέπειες.

Απλοποιήστε τις ροές εργασίας με συσκευές υπερήχων πολλαπλών δειγμάτων

Το UIP400MTP, για παράδειγμα, επιτρέπει την ταυτόχρονη κατεργασία των φρεατίων μικροπλακών με υπερήχους, εξασφαλίζοντας ομοιόμορφη αποκόλληση βιοϋμενίων ή κυτταρικού υλικού. Παράλληλα, το VialTweeter προσφέρει ακριβή λύση και ομογενοποίηση πολλαπλών δειγμάτων σε σωληνάρια χωρίς διασταυρούμενη επιμόλυνση. Αυτές οι συσκευές υπερήχων μειώνουν σημαντικά τους χρόνους επεξεργασίας, βελτιώνουν την αναπαραγωγιμότητα των πειραμάτων και διατηρούν υψηλή ακεραιότητα των δειγμάτων, καθιστώντας τις απαραίτητα εργαλεία για την έρευνα στη μικροβιολογία, την πρωτεωμική και τη μοριακή βιολογία.
Ακολουθεί ένα λεπτομερές πρωτόκολλο που παρουσιάζει ενδεικτικά τη χρήση των μοντέλων συσκευών υπερήχων πολλαπλών δειγμάτων της Hielscher, VialTweeter Multi-Tube Sonicator και Microplate Sonicator UIP400MTP, σε μια μελέτη που περιλαμβάνει τον σχηματισμό βιοϋμενίων E. coli και την επακόλουθη πρωτεωμική ανάλυση.

Πρωτόκολλο: Σχηματισμός και αποκόλληση βιοϋμενίων και πρωτεωμική ανάλυση με συσκευές υπερήχων πολλαπλών δειγμάτων της Hielscher

1. Προετοιμασία βακτηριακής καλλιέργειας

• Καλλιεργήστε βακτήρια E. coli (στέλεχος W3110) στους 30°C, θερμοκρασία ευνοϊκή για τον σχηματισμό βιοϋμενίων E. coli, σε θρεπτικό μέσο ζωμού τρυπτόνης (TB) που περιέχει:
  – 10 g/L τρυπτόνης
  – 5 g/L NaCl
• Προσθέστε αντιβιοτικά ανάλογα με τις ανάγκες για να εξασφαλίσετε τη διατήρηση του πλασμιδίου.
• Για μελέτες μικροσκοπίας και δραστικότητας υποκινητών, χρησιμοποιήστε το στέλεχος E. coli W3110 με έναν γονιδιωματικά ενσωματωμένο αναφορέα ενισχυμένης GFP (eGFP) υπό τον έλεγχο του υποκινητή rplL.
• Χρησιμοποιήστε πλασμίδια αναφοράς GFP για διάφορους υποκινητές (π.χ., csgA, csgD, fliA, fliC, flhD ) για να μετρήσετε τη δραστικότητα των υποκινητών.

2. Καλλιέργεια και αποκόλληση βιοϋμενίων

• Ενοφθαλμίστε 1,5 mL αραιωμένης βακτηριακής καλλιέργειας ανά φρεάτιο σε πλάκα 12 φρεατίων (πλάκες CellStar 12 φρεατίων, Greiner Bio-One).
• Επωάστε ώστε να σχηματιστεί βιοϋμένιο.
• Αφαιρέστε προσεκτικά την πλαγκτονική (μη προσκολλημένη) καλλιέργεια.

– Πλύνετε κάθε φρεάτιο με 500 µL PBS.
– Αποκολλήστε τα προσκολλημένα κύτταρα υποβάλλοντας την πλάκα 12 φρεατίων σε κατεργασία με υπερήχους στη συσκευή υπερήχων μικροπλακών UIP400MTP. Το UIP400MTP εξασφαλίζει ομοιόμορφη αποκόλληση παρέχοντας σταθερή ενέργεια υπερήχων σε όλα τα φρεάτια.
– Ρυθμίσεις κατεργασίας με υπερήχους: πλάτος ταλάντωσης 60%, κυκλική λειτουργία: 60 sec ΕΝΕΡΓΟ / 30 sec ΑΝΕΝΕΡΓΟ.

3. Συλλογή και λύση κυττάρων

• Φυγοκεντρήστε τα αποκολλημένα κύτταρα του βιοϋμενίου στα 4.500 g για 5 λεπτά.
• Πλύνετε τα κύτταρα του ιζήματος με PBS.
• Επαναιωρήστε τα κύτταρα σε 100 µL διαλύματος λαυροϋλοσαρκοσινικού νατρίου (SLS) 2% και επωάστε στους 95°C για 15 λεπτά.
• Πραγματοποιήστε κατεργασία με υπερήχους χρησιμοποιώντας το VialTweeter Multi-Tube Sonicator για να εξασφαλίσετε πλήρη κυτταρική λύση.
  – Ρυθμίσεις κατεργασίας με υπερήχους: πλάτος ταλάντωσης 100%, 50 s ΕΝΕΡΓΟ / 10 s ΑΝΕΝΕΡΓΟ για συνολικό χρόνο λειτουργίας 10 min· διατηρείτε τα δείγματα σε πάγο.

4. Αναγωγή και αλκυλίωση

• Προσθέστε 5 mM τρις(2-καρβοξυαιθυλο)φωσφίνης (TCEP) για την αναγωγή των δισουλφιδικών δεσμών και επωάστε στους 95°C για 15 λεπτά.
• Αλκυλιώστε τις πρωτεΐνες με 10 mM ιωδοακεταμιδίου για 30 λεπτά στους 25°C.

5. Ποσοτικός προσδιορισμός και πέψη πρωτεϊνών

• Φυγοκεντρήστε τα κυτταρικά λύματα για να απομακρύνετε τα υπολείμματα.
• Προσδιορίστε ποσοτικά τη συνολική περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη χρησιμοποιώντας το Pierce BCA Protein Assay Kit.
• Πραγματοποιήστε πέψη 50 µg συνολικής πρωτεΐνης με 1 µg θρυψίνης σε διάλυμα που περιέχει 2% SLS και 100 mM όξινου ανθρακικού αμμωνίου.
• Επωάστε το μείγμα της αντίδρασης πέψης καθ’ όλη τη διάρκεια της νύχτας στους 30°C.

6. Καθαρισμός πεπτιδίων

• Κατακρημνίστε το SLS προσθέτοντας 1,5% τριφθοροξικού οξέος (TFA) και στη συνέχεια φυγοκεντρήστε.
• Καθαρίστε τα πεπτίδια χρησιμοποιώντας μικροστήλες φυγοκέντρησης C18.
• Ξηράνετε τα καθαρισμένα πεπτίδια και επαναιωρήστε τα σε 0,1% TFA.

7. Υγρή χρωματογραφία–φασματομετρία μάζας (LC-MS/MS)

• Αναλύστε τα πεπτίδια σε φασματόμετρο μάζας Q-Exactive Plus συζευγμένο με σύστημα Ultimate 3000 RSLC nano.
• Διαχωρίστε τα πεπτίδια χρησιμοποιώντας στήλη HPLC αντίστροφης φάσης (75 µm × 42 cm) πληρωμένη με ρητίνη C18 (2,4 µm).
• Εφαρμόστε βαθμιδωτή μεταβολή από 2% έως 35% του διαλύτη B (ακετονιτρίλιο με 0,15% μυρμηκικό οξύ) σε διάστημα 140 λεπτών.
• Συλλέξτε δεδομένα με σαρώσεις MS υψηλής διακριτικής ικανότητας, ακολουθούμενες από σαρώσεις διαδοχικής φασματομετρίας μάζας MS/MS των 10 ιόντων με τη μεγαλύτερη ένταση.

8. Ανάλυση δεδομένων

• Επεξεργαστείτε τα πρωτογενή δεδομένα LC-MS χρησιμοποιώντας το λογισμικό Progenesis.
• Εξαγάγετε αρχεία .mgf και αναλύστε τα με το MASCOT.
• Πραγματοποιήστε ποσοτικό προσδιορισμό των πεπτιδίων χρησιμοποιώντας το SafeQuant για έλεγχο ποιότητας και προσαρμογή ως προς τον ρυθμό ψευδών ανακαλύψεων.
• Διεξάγετε όλα τα πειράματα σε δύο ή τρεις επαναλήψεις για να εξασφαλίσετε την αναπαραγωγιμότητα.

Συσκευές υπερήχων πολλαπλών δειγμάτων για προετοιμασία δειγμάτων υψηλής διεκπεραιωτικής ικανότητας

Τα μοντέλα συσκευών υπερήχων πολλαπλών δειγμάτων VialTweeter και UIP400MTP βελτιώνουν σημαντικά την ακρίβεια και την αποδοτικότητα των πειραματικών ροών εργασίας, ιδιαίτερα στην έρευνα των βιοϋμενίων και την πρωτεωμική. Η ικανότητά τους να επεξεργάζονται ομοιόμορφα πολλαπλά δείγματα εξασφαλίζει υψηλή διεκπεραιωτική ικανότητα χωρίς να διακυβεύεται η ποιότητα των δεδομένων. Αυτά τα οφέλη, σε συνδυασμό με τις απλοποιημένες ροές εργασίας που περιγράφονται παραπάνω, καθιστούν τις συσκευές υπερήχων πολλαπλών δειγμάτων της Hielscher απαραίτητα εργαλεία για τη σύγχρονη βιολογική έρευνα.

Σχεδιασμός, κατασκευή και συμβουλευτική – Ποιότητα κατασκευής από τη Γερμανία

Οι συσκευές υπερήχων της Hielscher είναι γνωστές για τα υψηλότατα πρότυπα ποιότητας και σχεδιασμού τους. Η ανθεκτικότητα και ο εύκολος χειρισμός επιτρέπουν την ομαλή ενσωμάτωση των συσκευών υπερήχων μας σε βιομηχανικές εγκαταστάσεις. Οι συσκευές υπερήχων της Hielscher ανταποκρίνονται με ευκολία σε αντίξοες συνθήκες και απαιτητικά περιβάλλοντα.

Η Hielscher Ultrasonics είναι εταιρεία πιστοποιημένη κατά ISO και δίνει ιδιαίτερη έμφαση στις συσκευές υπερήχων υψηλών επιδόσεων που διαθέτουν τεχνολογία αιχμής και ευχρηστία. Φυσικά, οι συσκευές υπερήχων της Hielscher συμμορφώνονται με τις απαιτήσεις CE και πληρούν τις απαιτήσεις των UL, CSA και RoHs.