Αποπαραφινοποίηση και εκχύλιση πρωτεΐνης από το FFPE

Διευκολύνετε την εκχύλιση πρωτεΐνης από τμήματα ιστού ενσωματωμένων σε παραφίνη (FFPE) με φορμαλίνη χρησιμοποιώντας έναν βελτιστοποιημένο συνδυασμό αποπαραφινοποίησης, διαλυτοποίησης και υπερήχων με υπερήχων πολλαπλών σωλήνων VialTweeter. Αυτό το πρωτόκολλο υποστηρίζει πρωτεομική βασισμένη στη φασματομετρία μάζας κατάντη και είναι συμβατό με ροές εργασιών καθαρισμού SP3 και ενζυματικής πέψης.

Αυτό το SOP προορίζεται για εργαστηριακό προσωπικό που ασχολείται με πρωτεομική ανάλυση δειγμάτων ιστού FFPE χρησιμοποιώντας υπερήχους υψηλής απόδοσης. Είναι βελτιστοποιημένο για έως και δέκα δείγματα FFPE που υποβάλλονται σε παράλληλη επεξεργασία χρησιμοποιώντας το VialTweeter Multi-Tube Sonicator.

Πρωτόκολλο: Εκχύλιση πρωτεΐνης από δείγματα FFPE χρησιμοποιώντας το VialTweeter

Υλικά και αντιδραστήρια

Αντιδραστήρια

• Ξυλόλιο (ιστολογικός βαθμός)
• Αιθανόλη (απόλυτη 96%)
• Ρυθμιστικό διάλυμα λύσης:

6 Μ Υδροχλωρική γουανιδίνη
50 mM Tris-HCl, pH 8,5
10 mM TCEP [τρις(2-καρβοξυαιθυλο)φωσφίνη]
40 mM CAA (2-χλωροακεταμίδιο)

• Αναστολέας πρωτεάσης (προαιρετικός, π.χ., cOmplete™ mini EDTA-free)

Εξοπλισμός

• VialTweeter Multi-σωλήνα υπερήχων
• 1,5 mL ή 2,0 mL σωλήνες μικροφυγοκέντρησης χαμηλής δέσμευσης
• Μπλοκ θερμότητας ή θερμοκοιτίδα (ρυθμίσεις 95°C και 80°C)
• Μικροφυγόκεντρος
• Thermomixer (προαιρετικό αλλά συνιστάται)

Εισαγωγή δείγματος

• 1–2 τμήματα ιστού FFPE πάχους 10 μm ανά δείγμα (δηλ. ανά φιαλίδιο)

ή

• Συνολικά ~100 μg ιστού ανά δείγμα (δηλ. ανά φιαλίδιο)

Σημείωση: Χρησιμοποιήστε φρέσκες λεπίδες για μικροτομία για να ελαχιστοποιήσετε τη μόλυνση από υπολείμματα παραφίνης.

Διαδικασία

1. αποπαραφινοποίηση
   1. Μεταφέρετε τα τμήματα FFPE σε σωλήνες μικροφυγοκέντρησης χαμηλής σύνδεσης.
   2. Προσθέστε 1 mL ξυλολίου, δίνη για λίγο.
   3. Επωάστε 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου.
   4. Φυγοκεντρείται στα 14.000 × g επί 2 λεπτά. Απορρίψτε το υπερκείμενο υγρό.
   5. Επαναλάβετε το πλύσιμο ξυλολίου άλλη μια φορά (βήματα 2-4).
   6. Εκπλύνεται το σφαιρίδιο με 1 mL αιθανόλης 96%, στροβίλου, κατόπιν φυγοκεντρείται στα 14.000 × g για 2 λεπτά. Απορρίψτε το υπερκείμενο υγρό.
   7. Επαναλάβετε την έκπλυση αιθανόλης άλλη μια φορά (συνολικά 2 πλύσεις αιθανόλης).
   8. Ξήρανση σφαιριδίων στον αέρα για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου με ανοιχτά καπάκια για την εξάτμιση της υπολειμματικής αιθανόλης.
2. Εκχύλιση πρωτεϊνών και κατεργασία με υπερήχους
   1. Προστίθενται 200 μL ρυθμιστικού διαλύματος λύσης σε κάθε ξηρό σφαιρίδιο.
      Σημείωση: Αν και ο υπερηχητικός μπορεί να φιλοξενήσει έως 1 mL, 200 μL είναι βέλτιστα για κατάντη επεξεργασία.

   2. Ανακατέψτε με στροβιλισμό ή απαλή πιπέτα.
3. Πρώτη θερμική επώαση
   1. Οι σωλήνες επωάζονται στους 95 °C επί 30 λεπτά, με ανάδευση στις 400 rpm με τη βοήθεια θερμομίκτη ή θερμικού μπλοκ.
   2. Αφήστε τα δείγματα να κρυώσουν σε θερμοκρασία δωματίου για 5 λεπτά.
4. Πρώτη κατεργασία με υπερήχους με το VialTweeter
   1. Τοποθετήστε τους σωλήνες στο VialTweeter.
   2. Ρυθμίστε το VialTweeter UP200St στις παρακάτω τιμές και sonicate.
Ρυθμίσεις Sonicator
• Ρυθμίστε το πλάτος (A) στο 100%
• Ρυθμίστε τη λειτουργία παλμών (C) στο 100%
• Ρολόι περιόδου: Ενεργοποιημένο
• Εγκαίρως: 60s
• Off Time: 30s
• Οριακή τιμή: 15 λεπτά (αντιστοιχεί σε 10 κύκλους)
(Σημείωση υπολογισμού: (60 s On + 30 s Off) × 10 κύκλοι = 900 s = 15 λεπτά)
5. Δεύτερη θερμική επώαση
   Απομακρύνονται οι σωλήνες και επωάζονται εκ νέου στους 95 °C επί 15 λεπτά, 400 rpm.
6. Δεύτερη κατεργασία με υπερήχους
   Επαναλάβετε την υπερήχηση στο VialTweeter χρησιμοποιώντας τις ίδιες ρυθμίσεις (όπως παραπάνω) για επιπλέον 10 κύκλους (15 λεπτά συνολικά).
7. Αποσαφήνιση του Lysate
   1. Τα δείγματα φυγοκεντρούνται στα 13.000 × g επί 10 λεπτά στους 23°C (θερμοκρασία δωματίου).
   2. Συλλέξτε προσεκτικά το υπερκείμενο υγρό σε ένα νέο σωλήνα Eppendorf 2,0 mL Safe-lock. Αποφύγετε να ενοχλείτε το σφαιρίδιο.
8. Κατάντη μεταποίηση
   Το προϊόν λύσης είναι τώρα έτοιμο για καθαρισμό SP3 και ενζυματική πέψη.

Σημειώσεις και βέλτιστες πρακτικές

1. Ο κίνδυνος υπερθέρμανσης κατά τη διάρκεια της υπερήχησης μετριάζεται με προγραμματισμένη ποδηλασία ON / OFF.
2. Αποφύγετε τη δίνη μετά από υπερήχους για να αποτρέψετε τη συσσώρευση πρωτεϊνών.

Διάθεση και ασφάλεια αποβλήτων

Ο παρακάτω πίνακας σας δίνει μια ένδειξη της κατά προσέγγιση ικανότητας επεξεργασίας των υπερήχων εργαστηριακού μεγέθους μας: