Αποπαραφίνωση και εκχύλιση πρωτεϊνών από FFPE

Διευκολύνετε την εκχύλιση πρωτεϊνών από τομές ιστών μονιμοποιημένων με φορμόλη και εγκλεισμένων σε παραφίνη (FFPE), χρησιμοποιώντας έναν βελτιστοποιημένο συνδυασμό αποπαραφίνωσης, διαλυτοποίησης και κατεργασίας με υπερήχους με μια συσκευή υπερήχων πολλαπλών σωληναρίων VialTweeter. Αυτό το πρωτόκολλο υποστηρίζει την επακόλουθη πρωτεωμική ανάλυση με βάση τη φασματομετρία μάζας και είναι συμβατό με ροές εργασίας καθαρισμού SP3 και ενζυμικής πέψης.

Αυτή η τυποποιημένη διαδικασία λειτουργίας (SOP) προορίζεται για εργαστηριακό προσωπικό που ασχολείται με την πρωτεωμική ανάλυση δειγμάτων ιστού FFPE χρησιμοποιώντας κατεργασία με υπερήχους υψηλής απόδοσης. Είναι βελτιστοποιημένη για έως και δέκα δείγματα FFPE που υποβάλλονται σε παράλληλη επεξεργασία με τη συσκευή υπερήχων πολλαπλών σωληναρίων VialTweeter.

Πρωτόκολλο: Εκχύλιση πρωτεϊνών από δείγματα FFPE με χρήση του VialTweeter

Υλικά και αντιδραστήρια

Αντιδραστήρια

• Ξυλόλιο (ποιότητας κατάλληλης για ιστολογία)
• Αιθανόλη (απόλυτη 96%)
• Ρυθμιστικό διάλυμα λύσης:

6 M υδροχλωρική γουανιδίνη
50 mM Tris-HCl, pH 8,5
10 mM TCEP (τρις(2-καρβοξυαιθυλ)φωσφίνη)
40 mM CAA (2-χλωροακεταμίδιο)

• Αναστολέας πρωτεασών (προαιρετικά· π.χ., cOmplete™ mini χωρίς EDTA)

Εξοπλισμός

• Συσκευή υπερήχων πολλαπλών σωληναρίων VialTweeter
• Σωληνάρια μικροφυγοκέντρησης χαμηλής δέσμευσης 1,5 mL ή 2,0 mL
• Θερμαντικό μπλοκ ή επωαστήρας (ρυθμίσεις 95°C και 80°C)
• Μικροφυγόκεντρος
• Θερμοαναμικτήρας (προαιρετικός αλλά συνιστώμενος)

Αρχική ποσότητα δείγματος

• 1–2 τομές ιστού FFPE πάχους 10 µm ανά δείγμα (δηλ., ανά φιαλίδιο)

Ή

• Συνολικά ~100 µg ιστού ανά δείγμα (δηλ., ανά φιαλίδιο)

Σημείωση: Χρησιμοποιήστε καινούργιες λεπίδες για τη μικροτομία, ώστε να ελαχιστοποιηθεί η επιμόλυνση από υπολείμματα παραφίνης.

Διαδικασία

1. Αποπαραφίνωση
   1. Μεταφέρετε τις τομές FFPE σε σωληνάρια μικροφυγοκέντρησης χαμηλής δέσμευσης.
   2. Προσθέστε 1 mL ξυλολίου και αναμείξτε σύντομα σε αναδευτήρα τύπου vortex.
   3. Επωάστε για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου.
   4. Φυγοκεντρήστε στα 14.000 × g για 2 λεπτά· απορρίψτε το υπερκείμενο.
   5. Επαναλάβετε την πλύση με ξυλόλιο μία ακόμη φορά (Βήματα 2–4).
   6. Πλύνετε το ίζημα με 1 mL αιθανόλης 96%, αναμείξτε σε αναδευτήρα τύπου vortex και στη συνέχεια φυγοκεντρήστε στα 14.000 × g για 2 λεπτά. Απορρίψτε το υπερκείμενο.
   7. Επαναλάβετε την πλύση με αιθανόλη μία ακόμη φορά (συνολικά 2 πλύσεις με αιθανόλη).
   8. Αφήστε το ίζημα να στεγνώσει στον αέρα για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, με τα πώματα ανοιχτά, ώστε να εξατμιστεί η υπολειμματική αιθανόλη.
2. Εκχύλιση πρωτεϊνών και κατεργασία με υπερήχους
   1. Προσθέστε 200 µL ρυθμιστικού διαλύματος λύσης σε κάθε ξηρό ίζημα.

      Σημείωση: Παρότι η συσκευή υπερήχων δέχεται έως και 1 mL, τα 200 µL είναι η βέλτιστη ποσότητα για την επακόλουθη επεξεργασία.

   2. Αναμείξτε σε αναδευτήρα τύπου vortex ή με ήπια αναρρόφηση και εκροή με πιπέτα.
3. Πρώτη θερμική επώαση
   1. Επωάστε τα σωληνάρια στους 95 °C για 30 min, με ανάδευση στις 400 rpm, χρησιμοποιώντας θερμοαναμικτήρα ή θερμαντικό μπλοκ.
   2. Αφήστε τα δείγματα να κρυώσουν σε θερμοκρασία δωματίου για 5 min.
4. Πρώτη κατεργασία με υπερήχους με το VialTweeter
   1. Τοποθετήστε τα σωληνάρια στο VialTweeter.
   2. Ρυθμίστε το VialTweeter UP200St στις παρακάτω τιμές και εκτελέστε κατεργασία με υπερήχους.
Ρυθμίσεις συσκευής υπερήχων
• Ρυθμίστε το πλάτος ταλάντωσης (A) στο 100%
• Ρυθμίστε την παλμική λειτουργία (C) στο 100%
• Χρονοδιακόπτης περιόδου: Ενεργός
• Χρόνος ενεργοποίησης: 60s
• Χρόνος απενεργοποίησης: 30s
• Οριακή τιμή: 15 min (αντιστοιχεί σε 10 κύκλους)
(Σημείωση υπολογισμού: (60 s ενεργοποίησης + 30 s απενεργοποίησης) × 10 κύκλοι = 900 s = 15 min)
5. Δεύτερη θερμική επώαση
   Αφαιρέστε τα σωληνάρια και επωάστε ξανά στους 95 °C για 15 min, στις 400 rpm.
6. Δεύτερη κατεργασία με υπερήχους
   Επαναλάβετε την κατεργασία με υπερήχους στο VialTweeter χρησιμοποιώντας τις ίδιες ρυθμίσεις (όπως παραπάνω) για 10 επιπλέον κύκλους (15 min συνολικά).
7. Διαύγαση του προϊόντος λύσης
   1. Φυγοκεντρήστε τα δείγματα στα 13.000 × g για 10 min στους 23°C (θερμοκρασία δωματίου).
   2. Συλλέξτε προσεκτικά το υπερκείμενο σε ένα νέο σωληνάριο Safe-lock Eppendorf 2,0 mL. Αποφύγετε τη διατάραξη του ιζήματος.
8. Επακόλουθη επεξεργασία
   Το προϊόν λύσης είναι πλέον έτοιμο για καθαρισμό SP3 και ενζυμική πέψη.

Σημειώσεις και βέλτιστες πρακτικές

1. Ο κίνδυνος υπερθέρμανσης κατά την κατεργασία με υπερήχους μετριάζεται με προγραμματισμένους κύκλους ενεργοποίησης/απενεργοποίησης.
2. Αποφύγετε την ανάμειξη σε αναδευτήρα τύπου vortex μετά την κατεργασία με υπερήχους, ώστε να αποτραπεί η συσσωμάτωση των πρωτεϊνών.

Διάθεση αποβλήτων και ασφάλεια

Ο παρακάτω πίνακας παρέχει μια ένδειξη της κατά προσέγγιση δυναμικότητας επεξεργασίας των συσκευών υπερήχων εργαστηριακού μεγέθους που διαθέτουμε: