Προετοιμασία δειγμάτων FFPE υψηλής διεκπεραιωτικής ικανότητας: Εκχύλιση πρωτεϊνών και κατακερματισμός νουκλεϊκών οξέων μέσω διάτμησης

Συχνές ερωτήσεις
Παρακάτω απαντάμε σε συχνές ερωτήσεις που αφορούν την προετοιμασία ιστών FFPE και την κατεργασία δειγμάτων FFPE με υπερήχους.

Πώς προετοιμάζεται ο ιστός FFPE;

Βήματα προετοιμασίας ιστών FFPE: Ο σχολαστικός χειρισμός και η επεξεργασία του νωπού ιστού είναι κρίσιμης σημασίας για την παραγωγή δειγμάτων FFPE υψηλής ποιότητας. Η διασφάλιση της διατήρησης της κυτταρικής αρχιτεκτονικής, των νουκλεϊκών οξέων και των πρωτεϊνών είναι απαραίτητη για την ακρίβεια των επακόλουθων αναλύσεων. Κάθε βήμα – από τη συλλογή έως την έγκλειση – απαιτεί ακρίβεια για τη διατήρηση της ακεραιότητας του δείγματος για διάφορες αναλύσεις, συμπεριλαμβανομένων της ιστολογικής εξέτασης, της ανοσοϊστοχημείας και των μοριακών μελετών. Όταν εκτελείται σωστά, αυτή η διαδικασία μονιμοποίησης και έγκλεισης διασφαλίζει ότι ο διατηρημένος ιστός αντικατοπτρίζει με ακρίβεια την κατάσταση in vivo, επιτρέποντας αξιόπιστα διαγνωστικά και ερευνητικά αποτελέσματα.
Σας καθοδηγούμε στα 6 κύρια βήματα της διαδικασίας έγκλεισης δειγμάτων ιστών FFPE.

• Συλλογή ιστού
  Τόσο οι βιοψίες από ζώντα θηλαστικά όσο και οι ιστοκαλλιέργειες αποτελούν κατάλληλες πηγές λήψης νωπού ιστού για την προετοιμασία δειγμάτων FFPE.
  Είναι σημαντικό να εφαρμόζετε άσηπτη τεχνική: Χρησιμοποιείτε αποστειρωμένα εργαλεία και γάντια για να αποφύγετε την επιμόλυνση. Ιδανικά, συλλέγετε τους ιστούς σε αποστειρωμένο περιβάλλον, όπως μια χειρουργική αίθουσα ή ένας θάλαμος στρωτής ροής.
  Καθώς το δείγμα είναι πολύ εύθραυστο, ο προσεκτικός χειρισμός του είναι απαραίτητος: Ελαχιστοποιήστε τις καθυστερήσεις στην επεξεργασία και ξεκινήστε την επακόλουθη επεξεργασία του ιστού αμέσως μετά την εκτομή. Αυτό είναι κρίσιμο για την αποτροπή της αυτόλυσης και της αποδόμησης. Διατηρείτε τον ιστό σε θερμοκρασία δωματίου· αποφεύγετε την κατάψυξη, καθώς μπορεί να προκαλέσει σχηματισμό κρυστάλλων πάγου και βλάβη του ιστού.
• Μονιμοποίηση ιστού
  Πρώτα, ο ιστός υποβάλλεται σε κατεργασία με μονιμοποιητικό διάλυμα: Χρησιμοποιήστε φορμόλη 10% με ουδέτερο ρυθμιστικό διάλυμα (NBF), η οποία ισοδυναμεί με φορμαλδεΰδη 4% σε νερό, ρυθμισμένη σε ουδέτερο pH.
  Βυθίστε πλήρως τον ιστό στη φορμόλη. Διασφαλίστε αναλογία όγκου μονιμοποιητικού προς ιστό τουλάχιστον 10:1. Ο χρόνος μονιμοποίησης κυμαίνεται συνήθως από 6 έως 24 ώρες, ανάλογα με τον τύπο και το μέγεθος του ιστού. Είναι σημαντικό το μονιμοποιητικό να μπορεί να διεισδύσει πλήρως στον ιστό. Ωστόσο, η υπερβολική μονιμοποίηση μπορεί να οδηγήσει σε σχηματισμό διασταυρούμενων δεσμών που δυσχεραίνει την ανάκτηση αντιγόνων, ενώ η ανεπαρκής μονιμοποίηση μπορεί να οδηγήσει σε κακή διατήρηση του ιστού.
• Περικοπή ιστού
  Δεύτερον, περικόψτε τον ιστό σε πάχος περίπου 3–5 mm, ώστε να επιτρέπεται η επαρκής διείσδυση του μονιμοποιητικού. Διασφαλίστε τον σωστό προσανατολισμό του ιστού, ώστε να συμπεριληφθούν οι σχετικές ιστολογικές δομές. Αυτό διευκολύνει τη διαδικασία εκχύλισης όταν ο ιστός χρησιμοποιηθεί αργότερα για ανάλυση.
• Επεξεργασία του μονιμοποιημένου δείγματος
  Τώρα, ο μονιμοποιημένος ιστός πρέπει να αφυδατωθεί: Μετά τη μονιμοποίηση, ο ιστός πρέπει να αφυδατωθεί, ώστε να διασφαλιστεί η πλήρης διείσδυση της παραφίνης. Περάστε τον ιστό διαδοχικά από διαλύματα αιθανόλης αυξανόμενης συγκέντρωσης (70%, 80%, 90% και 100%) για να απομακρύνετε το νερό.
  Διαύγαση με ξυλόλιο: Η παραφίνη είναι αδιάλυτη στο νερό, αλλά διαλυτή στο ξυλόλιο. Επομένως, το νερό στον ιστό πρέπει να αντικατασταθεί με ξυλόλιο. Ωστόσο, το ίδιο το ξυλόλιο είναι αδιάλυτο στο νερό αλλά διαλυτό στην αλκοόλη, γεγονός που καθιστά απαραίτητο ένα ενδιάμεσο βήμα κατά το οποίο το νερό αντικαθίσταται πρώτα με αλκοόλη. Βυθίστε τον ιστό σε ξυλόλιο ή σε υποκατάστατο ξυλολίου για να απομακρύνετε την αιθανόλη και να προετοιμάσετε τον ιστό για διήθηση με παραφίνη.
  Διήθηση με παραφίνη: Εγκλείστε τον ιστό σε τηγμένη παραφίνη, διασφαλίζοντας την πλήρη διήθησή του. Αυτό το βήμα συνήθως περιλαμβάνει αρκετές αλλαγές παραφίνης για να διασφαλιστεί ο πλήρης εμποτισμός.
• Έγκλειση του ιστού
  Σε αυτό το βήμα, ο ιστός διαμορφώνεται σε κύβο ιστού: Τοποθετήστε τον ιστό σε καλούπι με τον επιθυμητό προσανατολισμό και ρίξτε τηγμένη παραφίνη επάνω του. Αφήστε την παραφίνη να στερεοποιηθεί με ψύξη σε θερμοκρασία δωματίου ή πάνω σε ψυχρή πλάκα.
• Κοπή και τοποθέτηση τομών
  Μικροτομία: Για την κοπή του εγκλεισμένου ιστού, χρησιμοποιήστε μικροτόμο για να κόψετε λεπτές τομές (συνήθως 4–5 μικρόμετρα) από τον κύβο παραφίνης. Στη συνέχεια, το δείγμα τοποθετείται σε αντικειμενοφόρες πλάκες, μεταφέροντας τις τομές σε αυτές για επακόλουθη χρώση και μικροσκοπική ανάλυση.
  Τέλος, ελέγξτε την ποιότητα του ιστολογικού παρασκευάσματος: Αξιολογήστε τις πρώτες τομές στο μικροσκόπιο για να διασφαλίσετε τη σωστή μονιμοποίηση και επεξεργασία. Προσαρμόστε τα πρωτόκολλα όπως απαιτείται, με βάση τον τύπο του ιστού και την παρατηρούμενη ποιότητα.

 
Οι ιστοί FFPE μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την ανάκτηση RNA, DNA και πρωτεϊνών, καθώς και για τον εντοπισμό ενδείξεων καρκίνου ή άλλης νόσου. Μπορούν να αποθηκευτούν για χρόνια και αποτελούν ουσιώδες μέρος του τρόπου με τον οποίο οι ερευνητές και οι γιατροί αξιοποιούν δείγματα ιστών για διάγνωση και έρευνα.

Ποια είναι τα συνήθη προβλήματα και οι προκλήσεις με τους ιστούς FFPE;

Τα δείγματα ιστών που έχουν μονιμοποιηθεί σε φορμόλη και εγκλειστεί σε παραφίνη (FFPE) χρησιμοποιούνται ευρέως στην έρευνα και τη διαγνωστική, αλλά παρουσιάζουν αρκετές προκλήσεις και συνήθη προβλήματα:

• Αποδόμηση βιομορίων: Η παρατεταμένη μονιμοποίηση μπορεί να οδηγήσει στην αποδόμηση του DNA, του RNA και των πρωτεϊνών, δυσχεραίνοντας την εκχύλιση νουκλεϊκών οξέων ή πρωτεϊνών υψηλής ποιότητας για επακόλουθες εφαρμογές. Η σωστή μονιμοποίηση (με αποφυγή της ανεπαρκούς και της υπερβολικής μονιμοποίησης) είναι απαραίτητη για τη διατήρηση των ιστών.

Σχηματισμός διασταυρούμενων δεσμών: Η μονιμοποίηση σε φορμόλη προκαλεί τον σχηματισμό διασταυρούμενων δεσμών μεταξύ πρωτεϊνών και νουκλεϊκών οξέων, γεγονός που μπορεί να παρεμποδίσει τη μοριακή ανάλυση και να επηρεάσει την ακρίβεια της ανοσοϊστοχημείας και άλλων δοκιμασιών.

• Κάλυψη αντιγόνων: Η διαδικασία μονιμοποίησης μπορεί να καλύψει αντιγονικές θέσεις, μειώνοντας την αποτελεσματικότητα της δέσμευσης αντισωμάτων στην ανοσοϊστοχημεία και σε άλλες ανοσολογικές δοκιμασίες. Αυτό συχνά απαιτεί ανάκτηση αντιγόνων, μια διαδικασία μέσω της οποίας αντιστρέφεται η κάλυψη ενός επιτόπου και αποκαθίσταται η δέσμευση επιτόπου–αντισώματος. Ωστόσο, η πλήρης αντιγονικότητα ενδέχεται να μην αποκαθίσταται πάντα.
• Μεταβλητή ποιότητα μονιμοποίησης: Οι διαφορές στους χρόνους και στις συνθήκες μονιμοποίησης μπορούν να οδηγήσουν σε μη ομοιόμορφη ποιότητα δειγμάτων, επηρεάζοντας την αναπαραγωγιμότητα και τη συγκρισιμότητα των αποτελεσμάτων. Χρησιμοποιήστε αξιόπιστα πρωτόκολλα μονιμοποίησης και αποφύγετε την ανεπαρκή και την υπερβολική μονιμοποίηση.
• Βλάβες και κατακερματισμός του DNA: Η μονιμοποίηση των δειγμάτων FFPE σε φορμόλη μπορεί να προκαλέσει διάφορους τύπους βλαβών στο DNA, όπως απαμίνωση της κυτοσίνης (μεταλλάξεις από C σε T), οξειδωτικές βλάβες (π.χ. 8-οξογουανίνη που οδηγεί σε μεταλλάξεις από G σε T), καθώς και φυσικές βλάβες, όπως μονόκλωνες θραύσεις, κενά και θέσεις χωρίς βάση, που παρεμποδίζουν τη δραστικότητα της DNA πολυμεράσης. Η διαδικασία μονιμοποίησης σε φορμόλη μπορεί να προκαλέσει κατακερματισμό του DNA, δυσχεραίνοντας γενετικές και γονιδιωματικές αναλύσεις, όπως η PCR και η αλληλούχηση.
• Ποιότητα RNA: Το RNA που εκχυλίζεται από ιστούς FFPE είναι συχνά κατακερματισμένο και χημικά τροποποιημένο, γεγονός που δυσχεραίνει τη διεξαγωγή μεταγραφωμικών αναλύσεων υψηλής ποιότητας.
• Τροποποιήσεις πρωτεϊνών: Η φορμόλη μπορεί να προκαλέσει χημικές τροποποιήσεις στις πρωτεΐνες, επηρεάζοντας τη δομή και τη λειτουργία τους, γεγονός που μπορεί να παρεμποδίσει τις πρωτεωμικές αναλύσεις.
• Τεχνουργήματα από την επεξεργασία των δειγμάτων: Κατά τη διαδικασία εγκλεισμού και κοπής τομών, η μηχανική καταπόνηση και η θερμότητα μπορούν να δημιουργήσουν τεχνουργήματα και να προκαλέσουν περαιτέρω βλάβη στον ιστό.
• Μεταβλητότητα μεταξύ παρτίδων: Οι διαφοροποιήσεις στα πρωτόκολλα μονιμοποίησης και εγκλεισμού μεταξύ διαφορετικών παρτίδων μπορούν να οδηγήσουν σε σημαντική μεταβλητότητα των αποτελεσμάτων, δυσχεραίνοντας τις συγκρίσεις μεταξύ μελετών.
• Προβλήματα αποθήκευσης: Η μακροχρόνια αποθήκευση κύβων FFPE μπορεί να οδηγήσει σε πρόσθετη αποδόμηση και απώλεια της ακεραιότητας των νουκλεϊκών οξέων με την πάροδο του χρόνου, επηρεάζοντας την καταλληλότητα των αρχειακών δειγμάτων για αναδρομικές μελέτες.

Η χρήση βελτιστοποιημένων πρωτοκόλλων, ο προσεκτικός χειρισμός των δειγμάτων και η εφαρμογή προηγμένων τεχνικών συμβάλλουν στη βελτίωση της ποιότητας και της αξιοπιστίας των δεδομένων που λαμβάνονται από ιστούς FFPE.

Ποια είναι η διαφορά μεταξύ ιστού FFPE και κατεψυγμένου ιστού;

Ο ιστός FFPE (μονιμοποιημένος σε φορμόλη και εγκλεισμένος σε παραφίνη) συντηρείται με χρήση φορμόλης για τη μονιμοποίησή του και στη συνέχεια εγκλείεται σε παραφίνη, επιτρέποντας τη μακροχρόνια αποθήκευσή του σε θερμοκρασία δωματίου, ενώ διατηρείται η μορφολογία του ιστού. Αντίθετα, ο κατεψυγμένος ιστός συντηρείται ταχέως με κατάψυξη, η οποία διατηρεί καλύτερα την ακεραιότητα των νουκλεϊκών οξέων και των πρωτεϊνών, αλλά απαιτεί αποθήκευση σε πολύ χαμηλές θερμοκρασίες.

Ποιες χημικές ουσίες χρησιμοποιούνται για τον εγκλεισμό FFPE;

Οι χημικές ουσίες που χρησιμοποιούνται για την έγκλειση FFPE περιλαμβάνουν συνήθως φορμόλη για τη μονιμοποίηση και παραφίνη για την έγκλειση. Για την έγκλειση FFPE, οι ιστοί μονιμοποιούνται συνήθως είτε με ουδέτερη ρυθμισμένη φορμόλη 10% (v/v) (FA) είτε με πρόσφατα παρασκευασμένο διάλυμα φορμαλδεΰδης 4% (w/v) (PFA) από σκόνη παραφορμαλδεΰδης. Η φορμόλη, η οποία είναι διάλυμα φορμαλδεΰδης σε νερό, ρυθμίζεται σε ουδέτερο pH ώστε να διατηρείται η μορφολογία των ιστών και να αποτρέπεται ο υπερβολικός σχηματισμός διασταυρούμενων δεσμών. Το διάλυμα με βάση την παραφορμαλδεΰδη παρέχει επίσης αποτελεσματική μονιμοποίηση μέσω του σχηματισμού διασταυρούμενων δεσμών μεταξύ των πρωτεϊνών, σταθεροποιώντας έτσι τη δομή του ιστού για τη μετέπειτα έγκλειση σε παραφίνη. Αυτές οι χημικές ουσίες είναι απαραίτητες για τη διατήρηση της ακεραιότητας και της μορφολογίας των ιστών κατά τη διαδικασία μονιμοποίησης και έγκλεισης.

Πώς αφαιρείται η παραφίνη από τα δείγματα FFPE;

Για την αφαίρεση της παραφίνης από δείγματα FFPE, οι τομές ιστού υποβάλλονται συνήθως σε μια σειρά πλύσεων με ξυλόλιο, ακολουθούμενες από επανυδάτωση μέσω μιας σειράς αλκοολών διαβαθμισμένων συγκεντρώσεων και, τέλος, νερού. Καθώς το ξυλόλιο είναι ιδιαίτερα τοξικό και ενέχει κινδύνους για την υγεία, όπως αναπνευστικά προβλήματα, ερεθισμό του δέρματος και πιθανές μακροπρόθεσμες επιπτώσεις από την επανειλημμένη έκθεση, η αφαίρεση παραφίνης με υπερήχους αναδεικνύεται ως μια πολλά υποσχόμενη εναλλακτική λύση σε πολλά εργαστήρια. Η μέθοδος αυτή χρησιμοποιεί έντονα υπερηχητικά κύματα για την αποτελεσματική και ασφαλή αφαίρεση της παραφίνης χωρίς την ανάγκη τοξικών διαλυτών όπως το ξυλόλιο, μειώνοντας έτσι τον κίνδυνο για το προσωπικό του εργαστηρίου και δημιουργώντας ένα ασφαλέστερο περιβάλλον εργασίας.

Για πόσο χρόνο πρέπει να μονιμοποιώ τους ιστούς μου ώστε να εξασφαλίζεται καλή ποιότητα δειγμάτων FFPE;

Οι γενικές συστάσεις για τη διάρκεια μονιμοποίησης προτείνουν συνήθως τη μονιμοποίηση δειγμάτων ιστού σε φορμόλη για 24 έως 48 ώρες. Η διάρκεια αυτή είναι γενικά επαρκής για τη διατήρηση της μορφολογίας των ιστών και των κυτταρικών δομών, ελαχιστοποιώντας παράλληλα την υπερβολική μονιμοποίηση, η οποία μπορεί να οδηγήσει σε υπερβολικό σχηματισμό διασταυρούμενων δεσμών και αποικοδόμηση νουκλεϊκών οξέων και πρωτεϊνών. Ωστόσο, ο βέλτιστος χρόνος μονιμοποίησης μπορεί να ποικίλλει ανάλογα με το μέγεθος και τον τύπο του ιστού, με τα μικρότερα ή πιο ευαίσθητα δείγματα να απαιτούν μικρότερους χρόνους μονιμοποίησης. Είναι ζωτικής σημασίας να επιτυγχάνεται ισορροπία μεταξύ της επαρκούς μονιμοποίησης για την αποτροπή της αυτόλυσης και της αποικοδόμησης των ιστών και της αποφυγής παρατεταμένης μονιμοποίησης, η οποία θα μπορούσε να δυσχεράνει τις επακόλουθες μοριακές αναλύσεις.