Προετοιμασία δείγματος υψηλής απόδοσης FFPE: Εκχύλιση πρωτεϊνών και διάτμηση νουκλεϊκών οξέων

Συχνές ερωτήσεις
Παρακάτω, απαντάμε σε συχνές ερωτήσεις, οι οποίες σχετίζονται με την προετοιμασία ιστών FFPE και υπερήχους δειγμάτων FFPE.

Πώς παρασκευάζεται ο ιστός FFPE;

Βήματα για την προετοιμασία ιστών FFPE: Ο σχολαστικός χειρισμός και η επεξεργασία του φρέσκου ιστού είναι ζωτικής σημασίας για τη δημιουργία δειγμάτων FFPE υψηλής ποιότητας. Η διασφάλιση της διατήρησης της κυτταρικής αρχιτεκτονικής, των νουκλεϊνικών οξέων και των πρωτεϊνών είναι απαραίτητη για την ακριβή ανάλυση κατάντη. Κάθε βήμα - από τη συλλογή έως την ενσωμάτωση - απαιτεί ακρίβεια για τη διατήρηση της ακεραιότητας του δείγματος για διάφορες αναλύσεις, συμπεριλαμβανομένης της ιστολογικής εξέτασης, της ανοσοϊστοχημείας και των μοριακών μελετών. Όταν εκτελείται σωστά, αυτή η διαδικασία σταθεροποίησης και ενσωμάτωσης διασφαλίζει ότι ο διατηρημένος ιστός αντικατοπτρίζει με ακρίβεια την κατάσταση in vivo, επιτρέποντας αξιόπιστα διαγνωστικά και ερευνητικά αποτελέσματα.
Σας καθοδηγούμε στα 6 κύρια βήματα της διαδικασίας ενσωμάτωσης δειγμάτων ιστών FFPE.

• Συλλογή ιστών
  Οι βιοψίες από ζώντα θηλαστικά και οι ιστοκαλλιέργειες είναι και οι δύο βιώσιμες πηγές για τη λήψη φρέσκου ιστού για την προετοιμασία δείγματος FFPE.
  Είναι σημαντικό να χρησιμοποιήσετε μια άσηπτη τεχνική: Χρησιμοποιήστε αποστειρωμένα εργαλεία και γάντια για να αποφύγετε τη μόλυνση. Ιδανικά, συλλέξτε ιστούς σε αποστειρωμένο περιβάλλον, όπως χειρουργική σουίτα ή κουκούλα στρωτής ροής.
  Καθώς το δείγμα είναι πολύ εύθραυστο, ο ευαίσθητος χειρισμός του είναι απαραίτητος: Ελαχιστοποιήστε τις καθυστερήσεις στην επεξεργασία και ξεκινήστε αμέσως μετά την επεξεργασία του ιστού μετά την εκτομή. Αυτό είναι ζωτικής σημασίας για την πρόληψη της αυτόλυσης και της υποβάθμισης. Κρατήστε τον ιστό σε θερμοκρασία δωματίου. Αποφύγετε την κατάψυξη, καθώς μπορεί να προκαλέσει σχηματισμό κρυστάλλων πάγου και βλάβη ιστών.
• Καθήλωση ιστών
  Πρώτον, ο ιστός υποβάλλεται σε επεξεργασία με σταθεροποιητικό διάλυμα: Χρησιμοποιήστε 10% φορμαλίνη με ουδέτερο ρυθμιστικό διάλυμα (NBF), η οποία ισοδυναμεί με 4% φορμαλδεΰδη σε νερό, ρυθμισμένη σε ουδέτερο pH.
  Βυθίστε τον ιστό εντελώς σε φορμαλίνη. Εξασφαλίστε αναλογία όγκου σταθερού προς ιστό τουλάχιστον 10:1. Ο χρόνος καθήλωσης κυμαίνεται συνήθως από 6 έως 24 ώρες, ανάλογα με τον τύπο και το μέγεθος του ιστού. Είναι σημαντικό το σταθεροποιητικό να μπορεί να διεισδύσει καλά στον ιστό. Ωστόσο, η υπερβολική σταθεροποίηση μπορεί να οδηγήσει σε διασταυρούμενη σύνδεση που περιπλέκει την ανάκτηση αντιγόνου, ενώ η υπο-σταθεροποίηση μπορεί να οδηγήσει σε κακή διατήρηση των ιστών.
• Κοπή ιστών
  Δεύτερον, κόψτε τον ιστό σε πάχος περίπου 3-5 mm για να επιτρέψετε επαρκή διείσδυση στερεωτικού. Εξασφαλίστε τον σωστό προσανατολισμό του ιστού για να συλλάβετε τις σχετικές ιστολογικές δομές. Αυτό διευκολύνει τη διαδικασία εκχύλισης όταν ο ιστός χρησιμοποιείται αργότερα για ανάλυση.
• Επεξεργασία του σταθεροποιημένου δείγματος
  Τώρα, ο σταθερός ιστός πρέπει να αφυδατωθεί: Μετά τη σταθεροποίηση, ο ιστός πρέπει να αφυδατωθεί για να εξασφαλιστεί πλήρης διείσδυση από το κερί παραφίνης. Περάστε τον ιστό μέσα από μια διαβαθμισμένη σειρά αιθανόλης (70%, 80%, 90% και 100%) για να αφαιρέσετε το νερό.
  Καθαρισμός με ξυλόλιο: Το κερί παραφίνης είναι αδιάλυτο στο νερό, αλλά διαλυτό στο ξυλόλιο. Επομένως, το νερό στον ιστό πρέπει να αντικατασταθεί με ξυλόλιο. Ωστόσο, το ίδιο το ξυλόλιο είναι αδιάλυτο στο νερό αλλά διαλυτό στην αλκοόλη, απαιτώντας ένα ενδιάμεσο στάδιο όπου το νερό αντικαθίσταται πρώτα με αλκοόλη. Βυθίστε τον ιστό σε ξυλόλιο ή υποκατάστατο ξυλολίου για να αφαιρέσετε την αιθανόλη και να προετοιμάσετε τον ιστό για διήθηση παραφίνης.
  Διήθηση με χρήση παραφίνης: Ενσωματώστε τον ιστό σε λιωμένο κερί παραφίνης, εξασφαλίζοντας πλήρη διήθηση. Αυτό το βήμα συνήθως περιλαμβάνει αρκετές αλλαγές παραφίνης για να εξασφαλιστεί πλήρης εμποτισμός.
• Ενσωμάτωση του ιστού
  Σε αυτό το βήμα, ο ιστός χυτεύεται σε ένα μπλοκ ιστού: Τοποθετήστε τον ιστό σε ένα καλούπι με τον επιθυμητό προσανατολισμό και ρίξτε τετηγμένη παραφίνη πάνω του. Αφήστε την παραφίνη να στερεοποιηθεί ψύχοντας σε θερμοκρασία δωματίου ή σε κρύα πλάκα.
• Διατομή και τοποθέτηση
  Μικροτομία: Για να κόψετε τον ενσωματωμένο ιστό, χρησιμοποιήστε έναν μικροτόμο για να κόψετε λεπτά τμήματα (συνήθως 4-5 μικρόμετρα) από το μπλοκ παραφίνης. Στη συνέχεια τοποθετείται το δείγμα, τοποθετώντας τα τμήματα σε γυάλινες αντικειμενοφόρες πλάκες για επακόλουθη χρώση και μικροσκοπική ανάλυση.
  Τέλος, ελέγξτε την ποιότητα της ιστολογίας: Αξιολογήστε τα πρώτα τμήματα κάτω από ένα μικροσκόπιο για να εξασφαλίσετε τη σωστή στερέωση και επεξεργασία. Προσαρμόστε τα πρωτόκολλα ανάλογα με τις ανάγκες με βάση τον τύπο ιστού και την παρατηρούμενη ποιότητα.

 
Οι ιστοί FFPE μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την ανάκτηση RNA, DNA και πρωτεϊνών, καθώς και για την ανακάλυψη σημείων καρκίνου ή άλλης ασθένειας. Μπορούν να αποθηκευτούν για χρόνια και αποτελούν ουσιαστικό μέρος του τρόπου με τον οποίο οι ερευνητές και οι γιατροί αξιοποιούν δείγματα ιστών για διάγνωση και έρευνα.

Ποια είναι τα κοινά προβλήματα και οι προκλήσεις με τον ιστό FFPE;

Τα δείγματα ιστών Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded (FFPE) χρησιμοποιούνται ευρέως στην έρευνα και τη διάγνωση, αλλά παρουσιάζουν αρκετές προκλήσεις και κοινά προβλήματα:

• Αποικοδόμηση βιομορίων: Η παρατεταμένη καθήλωση μπορεί να οδηγήσει στην αποικοδόμηση του DNA, του RNA και των πρωτεϊνών, καθιστώντας δύσκολη την εξαγωγή υψηλής ποιότητας νουκλεϊνικών οξέων ή πρωτεϊνών για μεταγενέστερες εφαρμογές. Η σωστή καθήλωση (αποφυγή υποσταθεροποίησης και υπερβολικής καθήλωσης) είναι απαραίτητη για τη διατήρηση των ιστών.

Διασύνδεση: Η σταθεροποίηση φορμαλίνης προκαλεί διασταυρούμενη σύνδεση πρωτεϊνών και νουκλεϊνικών οξέων, η οποία μπορεί να εμποδίσει τη μοριακή ανάλυση και να επηρεάσει την ακρίβεια της ανοσοϊστοχημείας και άλλων δοκιμασιών.

• Κάλυψη αντιγόνου: Η διαδικασία σταθεροποίησης μπορεί να καλύψει αντιγονικές θέσεις, μειώνοντας την αποτελεσματικότητα της δέσμευσης αντισωμάτων στην ανοσοϊστοχημεία και σε άλλες ανοσολογικές δοκιμασίες. Αυτό συχνά απαιτεί ανάκτηση αντιγόνου, μια διαδικασία μέσω της οποίας αντιστρέφεται η κάλυψη ενός επιτόπου και αποκαθίσταται η σύνδεση επιτόπου-αντισώματος. Ωστόσο, η πλήρης αντιγονικότητα μπορεί να μην αποκαθίσταται πάντα.
• Μεταβλητή ποιότητα σταθεροποίησης: Οι διαφορές στους χρόνους και τις συνθήκες σταθεροποίησης μπορούν να οδηγήσουν σε ασυνεπή ποιότητα δείγματος, επηρεάζοντας την αναπαραγωγιμότητα και τη συγκρισιμότητα των αποτελεσμάτων. Χρησιμοποιήστε αξιόπιστα πρωτόκολλα σταθεροποίησης και αποφύγετε την υποσταθεροποίηση και την υπερβολική σταθεροποίηση.
• Βλάβη και κατακερματισμός DNA: Η σταθεροποίηση φορμαλίνης των δειγμάτων FFPE μπορεί να προκαλέσει διάφορους τύπους βλάβης του DNA, συμπεριλαμβανομένης της απαμίνωσης κυτοσίνης (μεταλλάξεις C έως T), οξειδωτική βλάβη (π.χ. 8-οξο-γουανίνη που οδηγεί σε μεταλλάξεις G έως T), καθώς και φυσικές διαταραχές όπως εγκοπές, κενά και αβασικές θέσεις που εμποδίζουν τη δραστηριότητα της DNA πολυμεράσης. Η διαδικασία δέσμευσης φορμαλίνης μπορεί να προκαλέσει κατακερματισμό του DNA, περιπλέκοντας γενετικές και γονιδιωματικές αναλύσεις όπως η PCR και η αλληλούχιση.
• Ποιότητα RNA: Το RNA που εξάγεται από ιστούς FFPE είναι συχνά κατακερματισμένο και χημικά τροποποιημένο, καθιστώντας δύσκολη την εκτέλεση μεταγραφομικών αναλύσεων υψηλής ποιότητας.
• Τροποποιήσεις πρωτεϊνών: Η φορμαλίνη μπορεί να προκαλέσει χημικές τροποποιήσεις στις πρωτεΐνες, επηρεάζοντας τη δομή και τη λειτουργία τους, γεγονός που μπορεί να επηρεάσει τις πρωτεομικές αναλύσεις.
• Τεχνουργήματα επεξεργασίας δειγμάτων: Κατά τη διάρκεια της διαδικασίας ενσωμάτωσης και διατομής, η μηχανική καταπόνηση και η θερμότητα μπορούν να εισάγουν τεχνουργήματα και να προκαλέσουν περαιτέρω βλάβη στον ιστό.
• Μεταβλητότητα από παρτίδα σε παρτίδα: Οι παραλλαγές στα πρωτόκολλα σταθεροποίησης και ενσωμάτωσης μεταξύ διαφορετικών παρτίδων μπορούν να οδηγήσουν σε σημαντική μεταβλητότητα στα αποτελέσματα, περιπλέκοντας τις συγκρίσεις μεταξύ μελετών.
• Προβλήματα αποθήκευσης: Η μακροχρόνια αποθήκευση μπλοκ FFPE μπορεί να οδηγήσει σε πρόσθετη υποβάθμιση και απώλεια ακεραιότητας νουκλεϊκών οξέων με την πάροδο του χρόνου, επηρεάζοντας τη βιωσιμότητα των αρχειακών δειγμάτων για αναδρομικές μελέτες.

Η χρήση βελτιστοποιημένων πρωτοκόλλων, ο προσεκτικός χειρισμός δειγμάτων και η εφαρμογή προηγμένων τεχνικών συμβάλλουν στη βελτίωση της ποιότητας και της αξιοπιστίας των δεδομένων που λαμβάνονται από ιστούς FFPE.

Ποια είναι η διαφορά μεταξύ FFPE και κατεψυγμένου ιστού;

Ο ιστός FFPE (Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded) διατηρείται χρησιμοποιώντας φορμαλίνη για τη σταθεροποίηση του ιστού και στη συνέχεια ενσωματώνεται σε κερί παραφίνης, επιτρέποντας τη μακροχρόνια αποθήκευση σε θερμοκρασία δωματίου, διατηρώντας παράλληλα τη μορφολογία του ιστού. Αντίθετα, ο κατεψυγμένος ιστός διατηρείται γρήγορα με κατάψυξη, η οποία διατηρεί καλύτερα την ακεραιότητα των νουκλεϊνικών οξέων και πρωτεϊνών, αλλά απαιτεί αποθήκευση σε πολύ χαμηλές θερμοκρασίες.

Ποιες χημικές ουσίες χρησιμοποιούνται για την ενσωμάτωση FFPE;

Οι χημικές ουσίες που χρησιμοποιούνται για την ενσωμάτωση FFPE περιλαμβάνουν συνήθως φορμαλίνη για σταθεροποίηση και κηρό παραφίνης για ενσωμάτωση. Για την ενσωμάτωση του FFPE, οι ιστοί συνήθως σταθεροποιούνται χρησιμοποιώντας είτε 10% (v/v) ουδέτερη ρυθμιστική φορμαλίνη (FA) είτε ένα πρόσφατα παρασκευασμένο διάλυμα φορμαλδεΰδης (PFA) 4% (w/v) που παρασκευάζεται από σκόνη παραφορμαλδεΰδης. Η φορμαλίνη, η οποία είναι ένα διάλυμα φορμαλδεΰδης στο νερό, ρυθμίζεται σε ουδέτερο pH για να διατηρηθεί η μορφολογία των ιστών και να αποφευχθεί η υπερβολική διασύνδεση. Το διάλυμα με βάση την παραφορμαλδεΰδη παρέχει επίσης αποτελεσματική σταθεροποίηση με διασταυρούμενες πρωτεΐνες, σταθεροποιώντας έτσι τη δομή του ιστού για επακόλουθη ενσωμάτωση σε κερί παραφίνης. Αυτές οι χημικές ουσίες είναι απαραίτητες για τη διατήρηση της ακεραιότητας και της μορφολογίας των ιστών κατά τη διάρκεια της διαδικασίας σταθεροποίησης και ενσωμάτωσης.

Πώς αφαιρείται η παραφίνη από τα δείγματα FFPE;

Για να αφαιρεθεί η παραφίνη από δείγματα FFPE, τα τμήματα ιστού υποβάλλονται συνήθως σε μια σειρά πλύσεων ξυλολίου ακολουθούμενες από επανυδάτωση μέσω μιας διαβαθμισμένης σειράς αλκοολών και τελικά νερού. Δεδομένου ότι το ξυλόλιο είναι εξαιρετικά τοξικό, θέτοντας κινδύνους για την υγεία, όπως αναπνευστικά προβλήματα, ερεθισμό του δέρματος και πιθανές μακροπρόθεσμες επιπτώσεις με επαναλαμβανόμενη έκθεση, η απομάκρυνση υπερήχων παραφίνης αναδύεται ως μια πολλά υποσχόμενη εναλλακτική λύση σε πολλά εργαστήρια. Αυτή η μέθοδος χρησιμοποιεί έντονα υπερηχητικά κύματα για την αποτελεσματική και ασφαλή απομάκρυνση της παραφίνης χωρίς την ανάγκη τοξικών διαλυτών όπως το ξυλόλιο, μειώνοντας έτσι τον κίνδυνο για το προσωπικό του εργαστηρίου και δημιουργώντας ένα ασφαλέστερο περιβάλλον εργασίας.

Πόσο καιρό πρέπει να σταθεροποιήσω τους ιστούς μου για καλή ποιότητα δείγματος FFPE;

Οι γενικές συστάσεις για τη διάρκεια της σταθεροποίησης συνήθως προτείνουν τον καθορισμό δειγμάτων ιστών σε φορμαλίνη για 24 έως 48 ώρες. Αυτή η διάρκεια είναι γενικά επαρκής για τη διατήρηση της μορφολογίας των ιστών και των κυτταρικών δομών, ελαχιστοποιώντας παράλληλα την υπερβολική καθήλωση, η οποία μπορεί να οδηγήσει σε υπερβολική διασύνδεση και αποικοδόμηση νουκλεϊνικών οξέων και πρωτεϊνών. Ωστόσο, ο βέλτιστος χρόνος σταθεροποίησης μπορεί να ποικίλει ανάλογα με το μέγεθος και τον τύπο του ιστού, με μικρότερα ή πιο ευαίσθητα δείγματα που απαιτούν μικρότερους χρόνους σταθεροποίησης. Είναι ζωτικής σημασίας να εξισορροπηθεί η επαρκής σταθεροποίηση για την πρόληψη της αυτόλυσης και της υποβάθμισης των ιστών, αποφεύγοντας παράλληλα την παρατεταμένη καθήλωση που θα μπορούσε να περιπλέξει τις κατάντη μοριακές αναλύσεις.