Ultralydsassisteret tyndfilmshydrering til fremstilling af liposomer

Liposomer er sfæriske vesikler, der består af et eller flere fosfolipiddobbeltlag, som omslutter en vandig kerne. På grund af deres evne til at indkapsle hydrofile, lipofile og amfifile forbindelser anvendes liposomer i vid udstrækning inden for lægemidler, nutraceutiske produkter, kosmetik og fødevarer. Deres biologiske nedbrydelighed, biokompatibilitet og ikke-immunogene karakter gør dem til særligt attraktive leveringssystemer.
Blandt de forskellige metoder til fremstilling af liposomer er tyndfilmshydrering (TFH) fortsat en af de mest etablerede og alsidige teknikker. Kombineret med kontrolleret sonikering muliggør denne metode fremstilling af liposomer i nanostørrelse med forbedret homogenitet, indkapslingseffektivitet og stabilitet.

Ultralydens rolle i tyndfilmshydrering

Tyndfilmshydrering giver indledningsvis overvejende multilamellære vesikler (MLV’er) med relativt store diametre og brede størrelsesfordelinger. På grund af deres størrelse udviser disse vesikler begrænset cellulær optagelse og reduceret biotilgængelighed, især i anvendelser, der kræver effektiv interaktion med membraner eller penetration i væv. Derfor anvendes sonikering med sonde som et kontrolleret trin til størrelsesreduktion for at omdanne MLV’er til små unilamellære liposomer eller liposomer i nanostørrelse med et snævrere polydispersitetsindeks. Nanoliposomer, hvis størrelse er reduceret med ultralyd, giver et væsentligt højere forhold mellem overfladeareal og volumen, forbedret kolloid stabilitet og øget cellulær internalisering, hvilket resulterer i overlegen biotilgængelighed og leveringsevne.

1. Virkningsmekanisme
   Ultralyd med høj intensitet genererer akustisk kavitation – dannelse og kollaps af mikroskopiske bobler – som frembringer lokale forskydningskræfter, mikrostrømninger og kortvarige høje trykgradienter.

   Disse virkninger resulterer i:

   • Nedbrydning af store multilamellære vesikler
   • Fragmentering og reorganisering af dobbeltlag
   • Dannelse af små unilamellære vesikler (SUV’er)
   • Snævrere partikelstørrelsesfordeling

   I nanoliposomale systemer fremstillet ved hjælp af tyndfilm + ultralydsdispergering opnås pålideligt gennemsnitlige partikeldiametre i området ~80 nm med lav polydispersitet.

2. Procesfordele
   Ultralydsassisteret TFH giver:
   • Reduceret partikelstørrelse (nanometerområdet)
   • Lavere polydispersitetsindeks (PDI)
   • Øget indkapslingseffektivitet
   • Forbedret kolloid stabilitet
   • Øget termisk og oxidativ stabilitet af indkapslede forbindelser

   Disse forbedringer er afgørende for at stabilisere oxidationsfølsomme bioaktive stoffer såsom flerumættede fedtsyrer.

Efter dannelsen af en lipidfilm og den efterfølgende rehydrering anvendes sonikering til at fremme indkapslingen af aktive indholdsstoffer i liposomerne. Derudover sikrer sonikering den ønskede liposomstørrelse.

Generel vejledning: Fremstilling af liposomer ved ultralydsassisteret tyndfilmshydrering

1. Materialer og formulering
   1. Vælg fosfolipid (f.eks. lecithin / fosfatidylcholin) og eventuelt kolesterol.
   2. Vælg lipidforhold ud fra stabilitetsbehovet.

   Et lecithin/kolesterol-forhold på omkring 40:20 gav stabile nanoliposomer med højt zetapotentiale og lavt PDI i et fødevarerelateret system.

2. Opløsning af lipider (organisk fase)
   1. Opløs fosfolipid + kolesterol i et flygtigt organisk opløsningsmiddel (f.eks. chloroform).
   2. Hvis funktionelle tilsætningsstoffer kræver et hjælpeopløsningsmiddel, opløses de separat (f.eks. i methanol), og opløsningerne kombineres.

   Denne fremgangsmåde er udtrykkeligt beskrevet for liposomer fremstillet ved tyndfilmshydrering med chloroform (lipider) og methanol (tilsætningsstof).

3. Dannelse af tyndfilm
   1. Overfør lipidopløsningen til en rundbundet kolbe.
   2. Fjern opløsningsmidlerne ved rotationsinddampning ved moderat temperatur (f.eks. 40 °C) under reduceret tryk, indtil der dannes en tør, homogen film.
4. Hydrering af lipidfilm
   1. Hydrer lipidfilmen med en vandig fase, der indeholder det aktive stof (eller buffer, hvis der fremstilles tomme liposomer).
   2. Hydrer under omrøring og ved forhøjet temperatur (om nødvendigt over lipidets faseovergangstemperatur).

   Eksempel fra en biomedicinsk formulering: hydrering med HEPES-buffer (pH 7,4) og omrøring ved 60°C i 6 h.

5. Størrelsesreduktion med ultralyd
   Efter hydrering indeholder dispersionen typisk multilamellære vesikler, hvis størrelse skal reduceres.

   Generelle anbefalinger til sonikeringstrinnet:

   • Anvend sonikering med sonde.
   • Anvend pulseret sonikering til at styre temperaturen.
   • Hold prøven i et isbad, eller anvend ekstern køling.

   Eksempel på en sonikeringsprotokol med sonikatoren UP200Ht fra Hielscher:
   15 min i alt, 10 s ON / 5 s OFF, 100 W, 100% amplitude. (jf. Truszkowska et al., 2025 og Ahmadi et al, 2021)

6. Valgfri efterbehandling
   Afhængigt af anvendelsen:
   • Fjern ikke-indkapslet forbindelse ved centrifugering/filtrering.
   • Vask og resuspender i frisk buffer.

   Eksempel: Fjernelse af ubundet materiale ved centrifugering og resuspension er beskrevet til oprensning af liposomer.

7. Karakterisering
   De vedlagte studier behandler konsekvent følgende som væsentlige kvalitetsmål:
   • Partikelstørrelse (nm)
   • Polydispersitetsindeks (PDI)
   • Zetapotentiale
   • Indkapslingseffektivitet
   • Morfologi (TEM/SEM)
   • Stabilitet under opbevaring

   Eksempler på resultater, der viser god nanoliposomkvalitet, omfatter:
   Størrelse ≈82 nm, PDI ≈0,06, zetapotentiale ≈−56 mV, indkapslingseffektivitet ≈76,5%.

   Praktiske bemærkninger
   Kolesterol forbedrer stabiliteten. Studierne angiver udtrykkeligt, at tilsætning af kolesterol kan forbedre liposomstabiliteten ved at hæmme fosfolipidernes faseovergang.

Fordele ved Hielschers ultralydssystemer til fremstilling af liposomer

Hielscher Ultrasonics tilbyder avancerede ultralydsprocessorer, der er specifikt udviklet til fremstilling af liposomer i laboratorie-, pilot- og fuld industriel skala. Disse systemer er særligt velegnede til ultralydsassisteret tyndfilmshydrering, hvor præcis styring af den akustiske energi er afgørende for at opnå en defineret partikelstørrelse, en snæver størrelsesfordeling og reproducerbar produktkvalitet.
I laboratorieskala tilbyder Hielschers sonikatorer præcis amplitudestyring, reproducerbar energitilførsel, programmerbar pulsdrift og integreret temperaturovervågning. Dette styringsniveau sikrer ensartet kavitationsintensitet og en meget reproducerbar nanoliposomstørrelse med fremragende ensartethed fra batch til batch. En sådan processtabilitet er afgørende under udviklingen af formuleringer, især ved optimering af nøgleparametre som sonikeringstid, akustisk effekt, lipidsammensætning og indkapslingseffektivitet.

Industriel fremstilling af liposomer

Til industriel fremstilling er Hielschers systemer designet til lineær skalering, så procesparametre fastlagt i laboratorieskala kan overføres til pilot- og produktionsenheder, samtidig med at en tilsvarende energitæthed og tilsvarende procesbetingelser opretholdes. Ultralydsreaktorer med kontinuerlig gennemstrømning muliggør fremstilling af liposomer med høj produktionskapacitet, ensartet energifordeling og reducerede behandlingstider. Systemerne er bygget til robust drift 24/7 med høj energieffektivitet og lavt vedligeholdelsesbehov. Desuden kan de integreres i GMP-kompatible produktionsmiljøer, herunder lukkede kredsløbssystemer, automatiserede proceslinjer og renrumsinstallationer. Disse egenskaber gør Hielschers ultralydsteknologi velegnet til fremstilling af liposomer til lægemidler, nutraceutiske produkter og fødevarer i industriel skala.

Ultralydsassisteret tyndfilmshydrering er en meget effektiv, kontrollerbar og skalerbar metode til fremstilling af nanoliposomer. Videnskabelig evidens viser, at kombinationen af TFH og ultralyd forbedrer partikelstørrelsesfordelingen, indkapslingseffektiviteten og stabiliteten af følsomme bioaktive forbindelser betydeligt.
Hielschers sonikatorer giver:

• Præcis energistyring
• Reproducerbare resultater i nanoskala
• Problemfri opskalering fra laboratorie til industriel produktion
• Mulighed for kontinuerlig behandling
• Robust og GMP-kompatibel drift

For forskningslaboratorier, der udvikler avancerede liposomale formuleringer, og for industrielle producenter, der fremstiller lægemidler eller nutraceutiske produkter af høj værdi, tilbyder Hielschers ultralydssystemer en teknisk overlegen og økonomisk skalerbar løsning til fremstilling af liposomer ved ultralydsassisteret tyndfilmshydrering.

Tabellen nedenfor giver en indikation af vores ultralydsapparaters omtrentlige behandlingskapacitet:

Sammenligning med andre ultralydsassisterede metoder til fremstilling af liposomer

Selvom tyndfilmshydrering anvendes i vid udstrækning – især i laboratorier samt forskning og udvikling – forbedrer ultralyd også flere andre metoder til fremstilling af liposomer:

• Omvendt fasefordampning – Ultralyd forbedrer emulgering og vesikeldannelse.
• Ethanolinjektionsmetoder – Sonikering finjusterer partikelstørrelsen og reducerer aggregering.
• Direkte dispergering af lecithin – Ultralyd muliggør hurtig dannelse af liposomer fra fosfolipidsuspensioner.
• Sonoporation af allerede dannede liposomer – Akustisk energi øger midlertidigt membranpermeabiliteten med henblik på aktiv indkapsling.
• Størrelsesreduktion efter dannelse – Sonikering anvendes rutinemæssigt til at reducere multilamellære vesikler til systemer i nanoskala.

Ultralyd er således ikke blot et hjælpetrin, men en central teknologi, der muliggør forskellige strategier til fremstilling af liposomer.

Design, fremstilling og rådgivning – Sonikatorer fremstillet i Tyskland

Hielschers ultralydsapparater er bredt anerkendt for deres høje kvalitet, robuste konstruktion og avancerede designstandarder. Deres holdbarhed og brugervenlige betjening muliggør problemfri integration i industrielle produktionsanlæg. Selv under barske driftsbetingelser og i krævende miljøer leverer Hielschers ultralydsapparater pålidelig ydeevne og ensartede resultater.

Hielscher Ultrasonics er en ISO-certificeret virksomhed og lægger stor vægt på at fremstille højtydende ultralydssystemer, der kombinerer den nyeste teknologi med praktisk anvendelighed. Alle Hielschers ultralydsapparater opfylder CE-kravene og opfylder desuden kravene i UL, CSA og RoHS.