Ultralydsbaseret peptidsyntese ved hjælp af TAGGING-teknikken

Peptidsyntese er en hjørnesten i den farmaceutiske forskning og udvikling, men de konventionelle metoder – peptidsyntese i fast fase (SPPS) og klassisk kobling i opløsningsfase – er stadig arbejdskrævende, medfører spild af reagenser og er vanskelige at skalere. Et mere effektivt alternativ er opstået gennem kombinationen af to ortogonale strategier: TAGGING-teknikken (temporary anchoring group) til peptidsamling i opløsningsfase og ultralydsbehandling (sonokemisk) til at fremskynde koblings-, afbeskyttelses- og oparbejdningstrinene. Tilsammen muliggør de produktion af terapeutiske peptider i mængder fra gram til store mængder. – såsom det antibiotiske og kræftbekæmpende lipopeptid lipobactin – med høj renhed, mindre arbejdsbyrde i forbindelse med rensning og markant færre manuelle arbejdsgange.

Hvilke fordele er der ved ultralydsbaseret peptidsyntese?

• Økonomi i opløsningsfasen: Reaktionerne foregår i opløsning med et betydeligt lavere forbrug af aminosyrer end ved peptidsyntese i fast fase
• Rensning ved hjælp af filtrering: Det TAG-bundne peptid udfældes i polære opløsningsmidler, så mellemprodukterne isoleres ved simpel filtrering – Der er ikke behov for kolonnekromatografi eller karakterisering efter hvert trin.
• Enorm arbejdsbesparelse: Ved at undgå mellemliggende oprensninger og spektralkontroller spares der betydeligt mange mandetimer i løbet af en hel synteseforløb.
• Sonokemisk acceleration: Ultralydsbehandling forkorter hvert eneste afgørende trin – Fmoc-afbeskyttelse, kobling af sidekæder, cyklisering og global afbeskyttelse – uden at gå på kompromis med selektiviteten.
• Høje udbytter, høj renhed: Hver fragmentkobling og den afsluttende lipobactin-samling foregår med højt udbytte; den samlede afbeskyttelse giver målemolekylet med et udbytte på ca. 83 %.
• Beredskab i stor skala: TAGGING-teknikken beskrives udtrykkeligt som en metode, der muliggør fremstilling af peptider i stor skala med den højeste renhed, hvilket gør den til en praktisk fremgangsmåde til fremstilling af gram- og kilogram-mængder af terapeutisk vigtige lipopeptider.
• Fuld metodekompatibilitet: Metoden er fuldt ud kompatibel med konventionel SPPS og opløsningsfase-kemi, så eksisterende beskyttelsesgruppestrategier (Fmoc, Alloc, Pbf, tBu) og koblingsmidler (T3P, HATU, COMU, DIC/DMAP) kan anvendes uændret.

Hvad er TAGGING-teknikken?

I TAG-metoden forankres et peptidfragment kovalent til en aftagelig, harpiksagtig forankringsgruppe (TAG), som forbliver i opløsningen. Dette gør det muligt at håndtere den voksende kæde som et fastfasepeptid, men i væskefasen:

• Efter hver kobling eller afbeskyttelse udvindes det TAG-bundne peptid som et fast stof ved simpel filtrering eller udfældning i polære medier eller antisolventer, mens opløselige urenheder og biprodukter skylles væk.
• Da peptidet forbliver bundet til linkeren, undgås kolonnekromatografi og en fuldstændig karakterisering af hvert mellemprodukt i vid udstrækning, hvilket sparer betydelig tid og arbejdskraft.
• Reaktionerne kan udføres i opløsningsfase, hvor der anvendes langt mindre aminosyre end ved SPPS, og slutproduktet frigøres ved spaltning af TAG-gruppen mod slutningen af syntesen.

 
Ved retro-syntesen af lipobactin blev der anvendt tre fragmenter – Fmoc-Ala-Arg-TAG, Alloc-Thr(Ile-Fmoc)-OH og lipidfragmentet C₁₁H₂₃CONH-Ile-Ser(OᵗBu)-OH – kombineret med en fragmentkondensationsstrategi for at opnå det lange peptid med meget høje udbytter. (jf. Ramya et al., 2025)

Den TAG-assisterede fuldstændige syntese af peptidet lipobactin fremskyndes ved ultralydsbehandling.
(Undersøgelse: Ramya m.fl., 2025)

Hvordan ultralydsbehandling forbedrer syntesen af peptider i opløsningsfase

Ultralydbehandling anvendes til at intensivere og forkorte de centrale trin i opløsningsfasen. I lipobactinsyntesen, som beskrevet af Ramya et al. (2025), anvendes ultralydbehandling til:

Da TAG-kemien i forvejen leverer mellemprodukter i form af filtrerbare faste stoffer, supplerer ultralydsbehandling og TAGGING hinanden: Ultralyd fremskynder masseoverførsel, blanding og reaktionskinetik, mens ankeret sikrer, at peptidet forbliver et genvindeligt fast stof, hvilket muliggør en ren arbejdsgang med et minimalt behov for kromatografi.

Enkel opskalering af peptider med høj renhed ved hjælp af ultralydsbehandling

En hyppig udfordring i forbindelse med overførslen af peptid- og peptidlægemiddelprocesser fra laboratoriet til produktionen er at bevare den sonokemiske effekt ved større volumener og kontinuerlig gennemstrømning. Hielscher løser dette problem med et komplet sortiment af ultralydsprocessorer, der dækker alt fra laboratorie- til fuld industriel skala, og som leverer valideret, reproducerbar effekt samt dokumenteret processtyring.
 

Industriel ultralydsapparat UIP4000hdT (4000 W, 20 kHz) til ultralydsforstærket peptidsyntese

Litteratur / Referencer