Dannelse af amyloidfibriller med mikropladesonikatoren UIP400MTP

Amyloidfibriller dannes ligesom krystaller gennem en proces med kernedannelse og efterfølgende vækst. På grund af den høje frie energibarriere for kernedannelse sker spontan dannelse af amyloidfibriller dog først efter en lang latenstid. Sonikering har vist sig at være et effektivt værktøj til at inducere amyloidkernedannelse og dermed fremskynde fibrildannelsen betydeligt. I kombination med en mikropladelæser, der anvender fluorescens fra thioflavin T (ThT), muliggør sonikering detektion af amyloidfibriller i flere prøver samtidigt med høj prøvekapacitet.

Ultralydsinduceret dannelse af amyloidfibriller med mikropladesonikatoren UIP400MTP

Med sonikatoren UIP400MTP til multibrøndplader kan amyloidfibriller af ensartet kvalitet hurtigt syntetiseres i store mængder til forskningsformål. Denne effektive fremgangsmåde gør det muligt at undersøge proteiners amyloidogenicitet. Teknikken muliggør hurtig og reproducerbar amyloidfibrillering, som demonstreret med β2-mikroglobulin (β2-m), et amyloidogent protein, der er forbundet med dialyserelateret amyloidose.

Enkel eksperimentel fremgangsmåde: Ultralydsinduceret amyloidfibrillering

For at inducere fibrildannelse blev en mikroplade med 96 brønde placeret i midten af sonikatoren UIP400MTP til multibrøndplader, som sikrer ensartet ultralydseksponering i alle brønde. Forsøgsbetingelserne var som følger:

1. Hver brønd indeholdt 0,2 ml β2-mikroglobulinopløsning (0,3 mg/ml, pH 2,5) tilsat 5 μM ThT.
2. Pladen blev udsat for sonikeringscyklusser, såsom 1 minuts sonikering efterfulgt af 9 minutters pause.
3. Efter sonikering blev ThT-fluorescensen målt med en mikropladelæser.

(jf. So et al., 2011)

Sammenligning med konventionel omrystning

Sammenlignet med traditionelle omrystningsmetoder reducerede sonikering fibrildannelsens latenstid drastisk. Under konventionelle betingelser for omrystning af mikroplader viste kun 1 ud af 10 brønde øget ThT-fluorescens efter 20 timer. Ved cyklisk sonikering (15 minutters sonikering efterfulgt af 5 minutter i hvile) blev der derimod registreret en betydelig stigning i ThT-fluorescensen umiddelbart efter den første sonikeringsbehandling.

Hurtig acceleration af fibrilleringskinetikken

Resultaterne fra So et al. (2011) viste, at den spontane fibrildannelse af β2-mikroglobulin ved pH 2,5 kan fremskyndes fra flere timer til blot 10–15 minutter med sonikering.
Billeder fra atomkraftmikroskopi (AFM) bekræftede, at fibriller dannet ved 10 minutters sonikering hvert 15. minut morfologisk ikke kunne skelnes fra dem, der blev dannet ved 1 minuts sonikering hvert 10. minut. Dette fremhæver reproducerbarheden og robustheden af ultralydsinduceret amyloidfibrillering.

AFM-billeder af amyloidfibriller fremstillet ved 1 minuts sonikering hvert 10. minut (i), ved 10 minutters sonikering hvert 15. minut (ii) og ved seedningsreaktionen uden sonikering (iii). Den hvide målestok repræsenterer 1 μm.
Undersøgelse og billeder: ©So et al., 2011

Fibrillering ved neutral pH

Selv ved neutral pH blev fibrildannelse opnået efter en latenstid på 1,5 timer, hvilket viser, at sonikering sænker energibarrieren for kernedannelse og vækst betydeligt. Dette understøtter yderligere hypotesen om, at amyloidfibrillering primært er en fysisk reaktion, der i høj grad begrænses af energibarrieren for kernedannelse, som sonikering effektivt reducerer.

Betydning for forskning i amyloidrelaterede sygdomme

Den nemme og pålidelige dannelse af amyloidfibriller med mikropladesonikatoren UIP400MTP har væsentlig betydning for forskning i Alzheimers sygdom (AD) og andre amyloidrelaterede sygdomme, såsom Parkinsons sygdom, type II-diabetes og systemiske amyloidoser. Ved AD er aggregering af amyloid-β (Aβ) et centralt patologisk kendetegn, men undersøgelse af dets fibrilleringskinetik er fortsat udfordrende på grund af lange latenstider og variabilitet ved konventionelle metoder. Sonikeringsdrevet fibrildannelse fremskynder kernedannelsen og sikrer høj reproducerbarhed og reduceret variabilitet, hvilket er afgørende for screening af potentielle hæmmere og forståelse af amyloidogene mekanismer. Desuden muliggør UIP400MTP’s høje prøvekapacitet undersøgelser i stor skala af proteiners fejlfoldning og aggregering, hvilket fremmer opdagelsen af terapeutiske midler, der kan modulere fibrildannelsen og potentielt begrænse neurodegenerativ progression.

Denne undersøgelse fastslår, at sonikering med sonikatoren UIP400MTP til multibrøndplader er en meget effektiv metode til at fremskynde dannelsen af amyloidfibriller. De vigtigste fordele ved denne fremgangsmåde omfatter:

• Markant reduktion af latenstiden for fibrillering.
• Ensartet ultralydseksponering i alle brønde, hvilket muliggør reproducerbar fibrildannelse.
• Mulighed for screening med høj kapacitet, hvilket gør metoden velegnet til genomdækkende undersøgelser af proteiners amyloidogenicitet.

Ved at kombinere sonikering med detektion af ThT-fluorescens giver denne metode en hurtig, skalerbar og pålidelig platform til undersøgelse af amyloidfibrillering. På grund af dens effektivitet og potentiale for høj prøvekapacitet kan denne fremgangsmåde gøre det nemmere at syntetisere amyloidfibriller til biofysisk og farmaceutisk forskning og tilbyde et lovende værktøj til amyloidrelaterede undersøgelser og lægemiddelscreening.