Amyloidfibrilldannelse ved hjælp af UIP400MTP mikroplade Sonicator

Amyloidfibriller, ligesom krystaller, dannes gennem en proces med kimdannelse og efterfølgende vækst. På grund af den høje frienergibarriere for kimdannelse forekommer spontan dannelse af amyloidfibriller imidlertid først efter en langvarig forsinkelsesfase. Ultralydbehandling er dukket op som et kraftfuldt værktøj til at inducere amyloid-kimdannelse og derved accelerere fibrilldannelsen betydeligt. Når det kombineres med en mikropladelæser ved hjælp af thioflavin T (ThT) fluorescens, muliggør ultralydbehandling detektion af amyloidfibriller med høj kapacitet i flere prøver samtidigt.

Ultralyd induceret amyloidfibrilldannelse med UIP400MTP mikroplade Sonicator

Med den UIP400MTP multi-brønds pladesoniker kan amyloidfibriller af samme kvalitet i store mængder hurtigt syntetiseres til forskningsformål. Denne effektive tilgang gør det muligt at studere proteinamyloidogenicitet. Denne teknik letter hurtig og reproducerbar amyloidflimren, som demonstreret med β2-mikroglobulin (β2-m), et amyloidogent protein forbundet med dialyserelateret amyloidose.

Simpel eksperimentel tilgang: Ultralydsinduceret amyloidflimren

For at inducere fibrilldannelse blev en 96-brønds mikroplade placeret i midten af UIP400MTP multi-brønds plade sonicator, som sikrer ensartet ultralydseksponering på tværs af alle brønde. De eksperimentelle betingelser var som følger:

1. Hver brønd indeholdt 0,2 ml β2-mikroglobulinopløsning (0,3 mg/ml, pH 2,5) suppleret med 5 μM ThT.
2. Pladen blev udsat for ultralydbehandlingscyklusser, såsom 1 minuts ultralydbehandling efterfulgt af 9 minutters pause.
3. Efter sonikering blev ThT-fluorescens målt ved hjælp af en mikropladelæser.

(jf. So et al., 2011)

Sammenligning med konventionel omrøring

Sammenlignet med traditionelle omrøringsmetoder reducerede ultralydbehandling drastisk forsinkelsesfasen af fibrilldannelse. Under konventionelle mikropladerysteforhold udviste kun 1 ud af 10 brønde øget ThT-fluorescens efter 20 timer. I modsætning hertil blev der ved hjælp af cyklet ultralydbehandling (15 minutters sonikering efterfulgt af 5 minutters hvile) påvist en signifikant ThT-fluorescensstigning umiddelbart efter den første sonikeringsbehandling.

Hurtig acceleration af fibrilleringskinetik

Resultaterne opnået fra So et al. (2011) viste, at den spontane fibrilldannelse af β2-mikroglobulin ved pH 2,5 kan accelereres fra flere timer til kun 10-15 minutter med ultralydbehandling.
Atomkraftmikroskopi (AFM) billeder bekræftede, at fibriller genereret via 10-minutters ultralydbehandling hvert 15. minut var morfologisk umulige at skelne fra dem, der blev dannet ved hjælp af 1-minuts ultralydbehandling hvert 10. minut. Dette fremhæver reproducerbarheden og robustheden af ultralydsinduceret amyloidflimren.

AFM-billeder af amyloidfibriller produceret ved 1 minuts ultralydbehandling hvert 10. minut (i), ved 10 minutters sonikering hvert 15. minut (ii) og ved såningsreaktionen uden ultralydbehandling (iii). Den hvide skalabjælke repræsenterer 1 μm.
Studie og billeder: ©So et al., 2011

Fibrillering ved neutrale pH-forhold

Selv under neutrale pH-forhold blev fibrilldannelse opnået efter en forsinkelsestid på 1,5 timer, hvilket viser, at ultralydbehandling sænker den energiske barriere for kimdannelse og vækst betydeligt. Dette understøtter yderligere hypotesen om, at amyloidfibrillering primært er en fysisk reaktion, der i vid udstrækning er begrænset af kernedannelsesenergibarrieren, som ultralydbehandling effektivt reducerer.

Indvirkning på forskning i amyloidrelaterede sygdomme

Den lette og pålidelige dannelse af amyloidfibriller ved hjælp af UIP400MTP mikroplade sonicator har betydelige implikationer for Alzheimers sygdom (AD) forskning og andre amyloid-relaterede lidelser, såsom Parkinsons sygdom, type II-diabetes og systemiske amyloidoser. I AD er amyloid-β (Aβ) aggregering et vigtigt patologisk kendetegn, men det er stadig udfordrende at studere dets fibrilleringskinetik på grund af lange forsinkelsesfaser og variabilitet i konventionelle metoder. Ultralydsdrevet fibrilldannelse fremskynder kimdannelse, hvilket sikrer høj reproducerbarhed og reduceret variabilitet, hvilket er afgørende for screening af potentielle hæmmere og forståelse af amyloidogene mekanismer. Desuden muliggør UIP400MTP højkapacitetskapacitet storstilede undersøgelser af proteinfejlfoldning og aggregering, hvilket letter opdagelsen af terapeutiske midler, der kan modulere fibrilldannelse og potentielt afbøde neurodegenerativ progression.

Denne undersøgelse etablerer ultralydbehandling ved hjælp af UIP400MTP multi-brønd plade sonicator som en yderst effektiv metode til at fremskynde dannelsen af amyloidfibriller. De vigtigste fordele ved denne tilgang omfatter:

• Dramatisk reduktion i forsinkelsestiden for flimren.
• Ensartet ultralydseksponering på tværs af alle brønde, hvilket muliggør reproducerbar fibrilldannelse.
• Screeningskapacitet med høj gennemstrømning, hvilket gør den velegnet til genomomfattende søgninger af proteinamyloidogenicitet.

Ved at integrere ultralydbehandling med ThT-fluorescensdetektion giver denne metode en hurtig, skalerbar og pålidelig platform til undersøgelse af amyloidfibrillering. I betragtning af dens effektivitet og høje kapacitetspotentiale kan denne tilgang lette syntesen af amyloidfibriller til biofysisk og farmaceutisk forskning, hvilket giver et lovende værktøj til amyloidrelaterede undersøgelser og lægemiddelscreening.