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Lyse Ultrasonique: Désintegration Cellulaire & Extraction

La désintégration cellulaire ou la lyse est une partie commune de la préparation quotidienne des échantillons dans les laboratoires biotechnologiques. Le but de la lyse est de perturber des parties de la paroi cellulaire ou de la cellule complète pour libérer des molécules biologiques. Le soi-disant lysat peut consister par exemple en un plasmide, des dosages de récepteurs, des protéines, de l'ADN, de l'ARN etc. Les étapes suivantes de la lyse sont le fractionnement, l'isolement des organelles et / ou l'extraction et la purification des protéines. Le matériau extrait (= lysat) doit être séparé et fait l'objet d'investigations ou d'applications supplémentaires, par exemple pour la recherche protéomique. Les homogénéisateurs à ultrasons sont un outil commun pour une lyse cellulaire réussie. Comme l'intensité ultrasonique peut être nivelée en ajustant les paramètres du procédé, l'intensité de sonication optimale de très doux à très dur peut être réglée individuellement pour chaque substance et milieu pour répondre à l'exigence d'application spécifique.

Structure cellulaire

Les cellules sont protégées par une membrane de plasma semi-perméable qui consiste en un phospho-lipidique bicouche (bicouche également des protéines-lipides, formé par les lipides hydrophobes et des molécules de phosphore hydrophiles avec des molécules de protéines intégrés) et crée une barrière entre l'intérieur de la cellule (cytoplasme) et l'environnement extracellulaire. Les cellules végétales et les cellules procaryotes sont entourées d'une paroi cellulaire. En raison de multiples couches de la paroi cellulaire épaisse de cellulose, les cellules végétales sont plus difficiles à lyser que les cellules animales. L'intérieur de la cellule, telles que des organelles, le noyau, la mitochondrie, est stabilisé par le cytosquelette.
En lysant les cellules, il est destiné à l'extraction et la séparation de la organelles, les protéines, l'ADN, l'ARNm ou d'autres biomolécules.

Ultrasonicators sont un outil couramment utilisé pour la préparation de l'échantillon de la matière cellulaire.

Fig. 1: extraction à partir de cellules par ultrasons: la section transversale microscopique (TS) de la tige apicale de menthe (Mentha piperita) représente le mécanisme d'action lors de l'extraction à partir de cellules par ultrasons (grossissement de 2000x) [ressource: Vilkhu et al. 2011]

méthodes

Il existe plusieurs méthodes pour lysat des cellules, qui peuvent être divisés en procédés mécaniques et chimiques, qui comprennent l'utilisation de détergents ou de solvants, l'application de la haute pression, ou l'utilisation d'un broyeur à billes ou d'une presse française. L'inconvénient le plus problématique de ces procédés est le contrôle et l'adaptation difficile des paramètres du procédé et, par conséquent l'impact.
Les principaux inconvénients des méthodes de lyse communes:

Différentes techniques de lyse

Tableau: Les méthodes classiques de lyse cellulaire présentent des inconvénients majeurs

Au contraire, sonication est un outil très efficace et fiable pour la désintégration cellulaire qui permet un contrôle complet sur les paramètres de sonication. Ceci assure une sélectivité élevée sur la libération et la pureté du produit matériel. [Balasundaram et al. 2009] Il convient à tous les types de cellules et facilement applicables dans les petites et à grande échelle. Ultrasonicators sont faciles à nettoyer. Un homogénéisateur à ultrasons comporte toujours la fonction de nettoyage en place (CIP) et stérilisez en place (SIP). La sonotrode consiste en une corne de titane massif qui peut être effacé ou rincé dans de l'eau ou du solvant (en fonction du fluide de travail). Le maintien de ultrasonicators est due à leur robustesse presque négligeable.

lyse

La lyse est un processus délicat. Lors de la lyse de la protection de la membrane cellulaire est détruite, mais l'inactivation, la dénaturation et de la dégradation des protéines extraites par un environnement non physiologique (écart de la valeur du pH) doit être évitée. Par conséquent, en général la lyse est effectuée dans une solution tampon. La plupart des difficultés proviennent de la perturbation cellulaire incontrôlée qui entraîne une libération non ciblée de tout le matériel intracellulaire et / ou la dénaturation du produit cible.

lyse cellulaire par ultrasons peut être utilisé pour la préparation des échantillons en laboratoire et pour la production de gros volumes. Cliquez pour agrandir!

Fig. 1: 200 watts puissant homogénéisateur à ultrasons UP200Ht avec commande numérique et l'enregistrement automatique des données pour la lyse cellulaire fiable et reproductible.

ultrasons lyse

Généralement, la lyse des échantillons en laboratoire prendra entre 15 secondes et 2 minutes. Comme l'intensité de la sonication est très facile à régler en réglant l'amplitude du temps de sonication et en choisissant le bon équipement, il est possible de perturber très doucement ou très brusquement les membranes cellulaires en fonction de la structure cellulaire et du but de la lyse ( par exemple, l'extraction de l'ADN nécessite une sonication plus douce, l'extraction complète des protéines de bactéries nécessite un traitement par ultrasons plus intense). La température pendant le processus peut être surveillée par un capteur de température intégré et peut être facilement contrôlée par refroidissement (bain de glace ou cellules de circulation avec des chemises de refroidissement) ou par sonication en mode pulsé. Au cours de la sonication en mode impulsionnel, des cycles d'éclatement courts de sonication d'une durée de 1 à 15 secondes permettent la dissipation de la chaleur et le refroidissement pendant les périodes intermittentes plus longues.
Tous les processus pilotés par ultrasons sont totalement reproductible et linéaire évolutive.

homogénéisateur à ultrasons VialTweeter pour la préparation de l'échantillon simultanément jusqu'à 10 tubes à essai. (Cliquez pour agrandir!)

Le dispositif à ultrasons VialTweeter permet la préparation de l'échantillon simultanément jusqu'à 10 flacons dans les mêmes conditions de traitement.

Homogénéiseur à ultrasons

Divers types de dispositif à ultrasons permettre correspondant à l'objectif de préparation d'échantillons et d'assurer la convivialité et le confort de fonctionnement. ultrasonicators de type sonde sont des dispositifs les plus courants dans le laboratoire. Ils sont les plus appropriés pour la préparation d'échantillons de petite et moyenne taille avec des volumes de 0,1 ml jusqu'à 1000 ml. Différentes tailles de puissance et sonotrodes permettent d'adapter le volume au appareil à ultrasons de l'échantillon et le récipient pour les résultats de sonication plus efficaces. Le dispositif de sonde à ultrasons est le meilleur choix lorsque les échantillons individuels doivent être préparés.

Si plus d'échantillons doivent être préparés, par exemple 8 flacons de solution cellulaire, des dispositifs tels que le VialTweeter ou un cuphorn à ultrasons sont l'homogénéisateur le plus approprié pour la lyse. Plusieurs flacons sont soniqués en même temps, à la même intensité. Cela économise non seulement du temps, mais garantit également le même traitement de tous les échantillons, ce qui rend les résultats parmi les échantillons fiables et comparables. En outre, une contamination croisée par immersion de la sonotrode ultrasonique (également connue sous le nom de sonde à ultrasons, corne, pointe ou doigt) est évitée. Puisque les flacons sont utilisés, le nettoyage et la perte d'échantillon qui prennent du temps en raison de la décantation des vaisseaux sont omis.
Pour des volumes plus élevés, par exemple pour la production commerciale d'extraits cellulaires, des systèmes à ultrasons en continu avec un réacteur à cuve à circulation sont les plus appropriés. Le flux continu et uniforme de la matière traitée assure une sonication même. Tous les paramètres du processus de désintégration par ultrasons peuvent être optimisés et adaptés aux besoins de l'application et le matériau cellulaire spécifique.

exemple de procédure lytique par ultrasons des cellules bactériennes:

  1. Préparation de la suspension de cellules: des pastilles cellulaires doivent être complètement mises en suspension dans une solution tampon en homogénéisant (choisir une solution tampon compatible avec l'analyse ci-après, par exemple la méthode de chromatographie en particulier). Ajouter lysozyme et / ou d'autres additifs, en cas de besoin (ils doivent aussi être compatibles avec des moyens de séparation / purification). Mélanger / homogénéiser la solution doucement sous sonication douce jusqu'à ce que la suspension complète est obtenue.
  2. lyse par ultrasons: Placer l'échantillon dans un bain de glace. Pour la rupture des cellules, sonication la suspension à 60-90 secondes rafales (en utilisant le mode d'impulsion de votre appareil à ultrasons).
  3. (. Par exemple 10 min à 10 000 x g, à 4degC): Séparation Centrifuger le lysat. Séparer le surnageant du culot cellulaire soigneusement. Le surnageant est le lysat cellulaire total. Après filtration du surnageant, on obtient un fluide clarifié de la protéine cellulaire soluble.



Les applications les plus courantes pour ultrasonicators en biologie et la biotechnologie sont:

  • préparation d'extrait cellulaire
  • Perturbation des levures, des bactéries, des cellules végétales, doux & tissu cellulaire dur, matériel nucléique
  • L'extraction des protéines
  • Préparation et isolement d'enzymes
  • La production d'antigènes
  • l'extraction d'ADN et / ou fragmentation ciblée
  • Préparation liposomique
homogénéisateurs à haute ultrasons de puissance, comme le UIP1000hd sont utilisés pour la rupture des cellules et l'extraction en discontinu ou en mode continu si l'écoulement. (Cliquez pour agrandir!)

systèmes à ultrasons benchtop tels que la UIP1000hd (1kW) peut traiter de plus grands volumes de matière biologique.

Les applications multiples de branches ultrasonores dans les secteurs de la biotechnologie, la bio-ingénierie, de la microbiologie, de la biologie moléculaire, la biochimie, l'immunologie, la bactériologie, la virologie, la protéomique, la génétique, la physiologie, de la biologie cellulaire, hématologie, et la botanique.

Pour l'évaluation et l'optimisation des applications des clients, Hielscher Ultrasonics propose un hébergement entièrement équipé laboratoire de traitement par ultrasons. S'il vous plait, contactez nous pour plus d'informations!

Littérature / Références

  • Balasundaram, B .; Harrison, S .; Bracewell, D. G. (2009): Les progrès dans les stratégies de sortie des produits et de l'impact sur la conception des bioprocédés. Tendances en matière de biotechnologie 27/8, 2009. pp. 477-485.
  • Vilkhu, K .; Manassé, R .; Mawson, R .; Ashokkumar, M. (2011): récupération par ultrasons et modification des ingrédients alimentaires. Dans: Feng / Barbosa-Canovas / Weiss (2011): ultrasons Technologies pour l'alimentation et bioprocédés. New York: Springer, 2011. pp 345-368..

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