Hielscher ультразвукова технологія

Ультразвуком лізису: клітинне порушення & Видобуток

Розкладання або лізис клітин є звичайною частиною щоденної підготовки зразків в біотехнологічних лабораторіях. Мета лізису полягає в тому, щоб зруйнувати частини клітинної стінки або повну клітину для вивільнення біологічних молекул. Так званий лізат може складатися, наприклад, з плазміди, рецепторних аналізів, білків, ДНК, РНК тощо. Наступні етапи лізису включають фракціонування, видалення органел або / та білок, екстракцію та очищення. Екстракт матеріалу (= лізат) повинен бути відокремлений і підлягає подальшому дослідженню або застосуванню, наприклад, для протеомічних досліджень. Ультразвукові гомогенізатори є загальним інструментом для успішного лізису клітин. Оскільки інтенсивність ультразвуку може бути вирівняна шляхом регулювання параметрів процесу, оптимальну інтенсивність ультразвукової обробки від дуже м'яких до дуже важких може бути встановлена ​​індивідуально для кожної речовини та середовища, щоб відповідати конкретній вимозі застосування.

Структура клітин

Клітини захищені напівпроникною плазматичною мембраною, яка складається з фосфоліпідного бішару (також білкового білково-ліпідного шару, утвореного гідрофобними ліпідом і молекулами гідрофільного фосфору з вбудованими білковими молекулами) і створює бар'єр між клітинними інтер'єрами (цитоплазмою) і позаклітинне середовище. Клітини рослини та прокаріотичні клітини оточені клітинною стінкою. Завдяки товстій клітинній стінці целюлози, що складається з декількох шарів, клітини рослин важче лізувати, ніж клітини тварин. Внутрішні клітини, такі як органели, ядра, мітохондрію, стабілізуються цитоскелетом.
Лізису клітин він спрямований на вилучення та розділення органел, білків, ДНК, мРНК та інших біомолекул.

Ультразвуком зазвичай використовується для зразка підготовки клітинної матерії.

Малюнок 1: Ультразвукова екстракція з клітин: мікроскопічне поперечне сечение (TS) верхівкового стебла м'яти (Mentha piperita) показує механізм дії під час ультразвукового витягання з клітин (збільшення 2000x) [ресурс: Vilkhu et al. 2011 р.]

Методи

Існує декілька способів лізати клітини, які можна розділити на механічні та хімічні методи, які включають використання миючих засобів або розчинників, застосування високого тиску або використання бридової млини або французької преси. Найбільш проблематичним недоліком цих методів є складне управління та налагодження параметрів процесу і тим самим впливу.
Основні недоліки загальних методів лізису:

Різні методи лізису

Таблиця: звичайні методи лізису клітин мають великі недоліки

Навпаки, ультразвукова обробка - це дуже ефективний і надійний інструмент для розкладання клітин, що дозволяє повністю контролювати параметри ультразвукової діагностики. Це забезпечує високу селективність щодо випуску матеріалів та чистоти продукту. [Balasundaram et al. 2009] Підходить для всіх типів клітин і легко застосовується у невеликих і великих масштабах. Ультразвукові апарати легко чистити. Ультразвуковий гомогенізатор завжди має функцію очищення на місці (CIP) та функцію стерилізації на місці (SIP). Сонотрода складається з масивного титанового ріжка, яку можна протерти або промити водою або розчинником (залежно від робочого середовища). Технічне обслуговування ультразвукових пристроїв пояснюється їхньою надійністю майже непридатною для зберігання.

лізис

Лізис є чутливим процесом. Під час лізису захист клітинної мембрани знищується, однак необхідно запобігти інактивації, денатурації та деградації екстрагованих білків нефізіологічним середовищем (відхилення від значення рН). Тому в цілому лізис здійснюється в буферному розчині. Більшість труднощів виникають внаслідок неконтрольованого порушення клітин, що призводить до нецільового вивільнення всього внутрішньоклітинного матеріалу та / або денатурації цільового продукту.

Лізис ультразвукових клітин може використовуватися для підготовки зразків у лабораторії та для виробництва великих об'ємів. Натисніть, щоб збільшити!

Малюнок 1: потужний ультразвуковий гомогенізатор потужністю 200 Вт UP200Ht з цифровим керуванням та автоматичним записом даних для надійного і відтворюваного лізису клітин.

Ультразвуковий лізис

Як правило, лізис зразків в лабораторії займе від 15 секунд до 2 хвилин. Оскільки інтенсивність ультразвукової обробки дуже легко регулюється за допомогою амплітуди встановлення часу обробки ультразвуком, а також за допомогою вибору відповідного обладнання, можна дуже легко або дуже різко порушити клітинні мембрани, залежно від структури клітин і з метою лізису ( наприклад, екстракція ДНК вимагає більш м'якої обробки ультразвуком, повна екстракція білка бактерій вимагає більш інтенсивного лікування ультразвуком). Температуру під час процесу можна контролювати інтегрованим датчиком температури, і його можна легко контролювати охолодженням (крижана ванна або стільникові камери з охолоджувальними куртками) або ультразвуком в імпульсному режимі. Під час обробки ультразвуком в імпульсному режимі короткі циклі вибуху з ультразвуком досягають 1-15 секунд, що дозволяє розсіювання тепла та охолодження протягом більш тривалих періодів.
Всі ультразвукові процеси повністю відтворюються і лінійно масштабуються.

Ультразвуковий гомогенізатор VialTweeter для одночасної підготовки зразків до 10 пробірки. (Натисніть, щоб збільшити!)

Ультразвуковий пристрій VialTweeter дозволяє одночасно проводити пробну підготовку до 10 ампулів у тих же умовах процесу.

Ультразвукові гомогенізатори

Різні типи Ультразвукові прилади дозволяють відповідати цілі підготовки зразка і забезпечити зручність та комфорт роботи. Ультразвукові датчики - найпоширеніші прилади в лабораторії. Вони найбільш підходять для приготування малих і середніх розмірів зразків обсягом 0,1мл до 1000мл. Різні розміри потужності та сонотроди дозволяють адаптувати ультразвуковий пристрій до об'єму зразка та посудину для найбільш ефективних та ефективних результатів звучання. Ультразвуковий зондовий пристрій є найкращим вибором при підготовці одиничних зразків.

Якщо необхідно підготувати додаткові зразки, наприклад, 8 флаконів клітинного розчину, такі пристрої, як VialTweeter або ультразвуковий чахорн, є найбільш підходящим гомогенізатором для лізису. Кілька флаконів обробляють ультразвуком одночасно, з однаковою інтенсивністю. Це заощаджує не тільки час, але й забезпечує однакове ставлення до всіх зразків, що робить результати серед зразків надійними і порівнянними. Крім того, уникати перехресного забруднення шляхом занурення ультразвукового сонотрода (також відомий як ультразвуковий зонд, ріг, наконечник або палець). Оскільки використовуються флакони, витрата часу на очищення та втрати вибірки внаслідок відгону судин відсутні.
Для більш високих об'ємів, наприклад, для комерційного виробництва клітинних екстрактів, найбільш придатні є неперервні ультразвукові системи з реактором для потоку. Безперервний і рівний потік обробленого матеріалу забезпечує рівномірну ультразвукову обробку. Всі параметри процесу дезінтеграції ультразвуку можна оптимізувати та пристосувати до вимог застосування та конкретного матеріалу клітини.

Приклад процедури для ультразвукового лізингу бактеріальних клітин:

  • Підготовка клітинної суспензії: гранули для клітин повинні бути повністю суспендовані в буферному розчині шляхом гомогенізації (вибирайте ваш буферний розчин, сумісний з наступним аналізом, наприклад, методом специфічної хроматографії). При необхідності додайте лізозими та / або інші добавки (вони також повинні бути сумісними з засобами розділення / очищення). Обережно перемішайте / гомогенізуйте розчин м'якою ультразвуком до досягнення повної суспензії.
  • Ультразвуковий лізис: помістіть зразок на крижану баню. Для розриву клітин зоскомістируйте суспензію при 60-90 секундових сплесках (використовуючи імпульсний режим ультразвуку).
  • Виділення: центрифугувати лізат (наприклад, 10 хв при 10 000 х, при температурі 4 ° С). Очистити супернатант від клітинного гранулята ретельно. Супернатант є загальним лізатом клітин. Після фільтрації супернатанту ви отримуєте розслаблену рідину розчинного клітинного білка.

Найбільш поширеними застосуваннями ультразвукових пристроїв в біології та біотехнології є:

  • Підготовка клітинних екстрактів
  • Розрив дріжджів, бактерій, рослинних клітин, м'яких & тканини твердої клітини, нуклеїнові речовини
  • Білок екстракції
  • Підготовка та ізоляція ферментів
  • Виробництво антигенів
  • Вилучення ДНК та / або цілеспрямована фрагментація
  • Ліпосома підготовка
Високоефективні ультразвукові гомогенізатори, такі як UIP1000hd, використовуються для розриву та вилучення клітин у режимі партії або безперервного потоку. (Натисніть, щоб збільшити!)

Ультразвукові стаціонарні системи, такі як UIP1000hd (1кВт) може обробляти більші обсяги біологічного матеріалу.

Різноманітні застосування ультразвукових гілок у секторах біотехнології, біоінженерії, мікробіології, молекулярної біології, біохімії, імунології, бактеріології, вірусології, протеоміки, генетики, фізіології, клітинної біології, гематології та ботаніки.

Для оцінки та оптимізації додатків клієнтів Hielscher Ultrasonics пропонує повністю обладнані Лабораторія ультразвукового процесу. Будь ласка, зв'яжіться з нами для отримання додаткової інформації!

Література / Довідники

  • Баласундарам, Б .; Харрісон, S .; Брацвелл, Д.Д. (2009): досягнення стратегій випуску продукту та вплив на дизайн біопроцесу. Тенденції в біотехнології, 27/8, 2009. С. 477-485.
  • Вільхух, К .; Манасія, Р .; Моусон, Р .; Ашоккумар М. (2011): Ультразвукове відновлення та модифікація харчових інгредієнтів. В: Feng / Barbosa-Cánovas / Weiss (2011): Ультразвукові технології для харчових продуктів та біопереробки. Нью-Йорк: Springer, 2011. стор. 345-368.

Зв'яжіться з нами / Запитуйте додаткову інформацію

Розкажіть нам про ваших вимогах до обробки. Ми будемо рекомендувати найбільш підходящі налаштування та параметри обробки для вашого проекту.





Будь ласка, зверніть увагу на наші Політика конфіденційності.