Розпад або лізис клітин є поширеною частиною щоденної підготовки зразків у біотехнологічних лабораторіях. Метою лізису є порушення частин клітинної стінки або повної клітини для вивільнення біологічних молекул. Ультразвукові гомогенізатори широко використовуються для успішного лізису клітин. Основною перевагою складних ультразвукових пристроїв є точний контроль над параметрами процесу, такими як інтенсивність та температура, що дозволяє забезпечити м'яке, але високоефективне порушення та вилучення клітин.

Лізис клітин за допомогою ультразвуку

Лізис і екстракція ультразвукових клітин - це метод, який використовується для розриву відкритих клітин і вилучення вмісту за допомогою високочастотних звукових хвиль, тобто ультразвуку. Ультразвукова обробка - це техніка лізису, яка широко використовується як усталений і надійний метод порушення клітин і екстракції внутрішньоклітинного матеріалу. Ультразвуковий лізис є надійною технікою для приготування лізату, що містить плазміду, аналізи рецепторів, білки, ДНК, РНК тощо. Оскільки інтенсивність ультразвуку можна вирівняти, регулюючи параметри процесу, оптимальна інтенсивність ультразвукової обробки від дуже м'якої до інтенсивної може бути встановлена окремо для кожної речовини та середовища, щоб відповідати конкретним вимогам застосування. Наступними етапами лізису є фракціонування, виділення органел або / а екстракція та очищення білка. Видобутий матеріал (= лізат) повинен бути відокремлений і підлягає подальшим дослідженням або застосуванню, наприклад, для протеомних досліджень.

У порівнянні з іншими методами лізису та екстракції клітин, ультразвуковий лізис клітин має ряд переваг:

1. Швидкість: Ультразвуковий лізис і екстракція клітин - це швидкий метод, який може розбити відкриті клітини за лічені секунди. Це набагато швидше, ніж інші методи, такі як гомогенізація, фріз-розморожування або фрезерування бісером.
2. Ефективність: Ультразвуковий лізис і екстракція клітин можуть бути використані для обробки малих, великих або декількох зразків одночасно, що робить його більш ефективним, ніж інші методи, які вимагають індивідуальної обробки невеликих зразків.
3. Без хімічних речовин: Ультразвуковий лізис та екстракція клітин є неінвазивним методом, який не вимагає використання жорстких хімічних речовин або ферментів. Це робить його ідеальним для додатків, де потрібно підтримувати цілісність вмісту клітини. Небажаного забруднення зразків можна уникнути.
4. Висока врожайність: Ультразвуковий лізис і екстракція клітин можуть витягти високий вихід клітинного вмісту, включаючи ДНК, РНК і білки. Це пояснюється тим, що високочастотні звукові хвилі розривають клітинні стінки і випускають вміст в навколишній розчин.
5. Контроль температури: Складні ультрасонціатори дозволяють проводити точний температурний контроль зразка. Hielscher digital ultrasonic оснащені підключається датчиком температури та програмним забезпеченням для моніторингу температури.
6. Відтворювані: Протоколи ультразвукового лізису клітин можуть бути легко відтворені і навіть підібрані до різних більших або менших обсягів вибірки простим лінійним масштабуванням.
7. Універсальний: Ультразвуковий лізис і екстракція клітин можуть бути використані для вилучення широкого спектру типів клітин, включаючи бактерії, дріжджі, гриби, клітини рослин і ссавців. Він також може бути використаний для вилучення різних типів молекул, включаючи білки, ДНК, РНК і ліпіди.
8. Одночасна підготовка численних зразків: Hielscher Ultrasonics пропонує кілька рішень для комфортної обробки численних зразків при абсолютно однакових умовах процесу. Це робить етап підготовки зразків лізису та екстракції високоефективним та економним часом.
9. Простий у використанні: Ультразвукове обладнання для лізису клітин та екстракції просте у використанні та вимагає мінімальної підготовки. Обладнання також є економічним, оскільки це єдина інвестиція без вимоги до повторного придбання вибуття. Це робить його привабливим для широкого кола дослідників і лабораторій.

Загалом, ультразвуковий лізис та екстракція клітин є швидким, ефективним, точно контрольованим та універсальним методом вилучення клітинного вмісту. Його переваги перед альтернативними методами роблять його привабливим вибором для широкого спектру досліджень і промислових застосувань.

Принцип роботи ультразвукового лізису клітин

Ультразвуковий лізис і екстракція клітин використовує високочастотні звукові хвилі для порушення клітин і вилучення їх вмісту. Звукові хвилі створюють зміни тиску в навколишній рідині, в результаті чого дрібні бульбашки утворюються і руйнуються в процесі, відомому як кавітація. Ці бульбашки генерують локалізовані високоінтенсивні механічні сили, які можуть розірвати відкриті клітини і випустити їх вміст в навколишній розчин.

Лізис клітин за допомогою ультразвукового апарату зазвичай включає в себе наступні етапи:

• Зразок поміщають в пробірку або ємність з рідким буфером.
• У зразок вставляється ультразвуковий зонд, і застосовуються високочастотні звукові хвилі приблизно 20-30 кГц.
• Ультразвукові хвилі викликають коливання і кавітацію в навколишній рідині, генеруючи локалізовані сили, які розривають відкриті клітини і вивільняють їх вміст.
• Зразок центрифугують або фільтрують, щоб видалити будь-яке клітинне сміття, а витягнутий вміст збирають для аналізу нижчестоящих.

Потужні ультразвукові хвилі порушують клітинний матрикс біологічних структур і вивільняють біоактивні сполуки. Посилюється масообмін між рослинним матеріалом і розчинником (наприклад, буфером). (графіка: ©Вілху та ін., 2006)

Недоліки методів лізису звичайного

Під час роботи в лабораторіях ви, можливо, вже відчували клопоти з лізисом клітин за допомогою традиційних протоколів механічного або хімічного лізису.

• Механічний лізис: Методи механічного лізису, такі як подрібнення ступкою і товкачем або гомогенізація за допомогою френч-преса, бісерного млина або роторно-статорної системи, часто не мають варіантів попереднього контролю і регулювання. Це означає, що використання фрезерування та подрібнення може швидко генерувати тепло та сили зсуву, які можуть пошкодити зразок та денатурувати білки. Вони також можуть бути трудомісткими і вимагати великої кількості вихідного матеріалу.
• Хімічний лізис: Хімічні методи лізису, такі як лізис на основі миючих засобів, можуть пошкодити зразок, порушуючи ліпідний бішар і денатуруючи білки. Вони також можуть вимагати декількох кроків і можуть залишати залишкові забруднення, які заважають низхідним додаткам. Пошук оптимального дозування миючого засобу є додатковим завданням.
• Цикли заморожування-відтавання: Цикли заморожування-відтавання можуть призвести до розриву клітинних мембран, але повторні цикли також можуть викликати денатурацію і деградацію білка. Цей метод також може вимагати декількох циклів, що може зайняти багато часу і часто призводить до зниження врожайності.
• Ферментативний лізис: Методи ферментативного лізису можуть бути специфічними для певних типів клітин і вимагати декількох кроків, що робить їх трудомісткими. Вони також генерують відходи і вимагають ретельної оптимізації, щоб уникнути деградації зразка. Ферментативні набори для лізису часто коштують дорого. Якщо ваша поточна процедура ферментативного лізису дає недостатні результати, ультразвукова обробка як синергетичний метод може бути застосована для інтенсифікації порушення клітин.

На відміну від звичайних механічних та хімічних методів лізису клітин, ультразвукова обробка є дуже ефективним та надійним інструментом для розпаду клітин, що дозволяє повністю контролювати параметри ультразвукової обробки. Це забезпечує високу селективність при випуску матеріалів і чистоту продукції. [пор. Баласундарам та ін., 2009]
Він підходить для всіх типів клітин і легко застосовується в малих і великих масштабах – завжди в контрольованих умовах. Ультразвукові апарати легко чистити. Ультразвуковий гомогенізатор завжди має функцію чистого на місці (CIP) та стерилізації на місці (SIP). Сонотрод складається з масивного титанового рогу, який можна протирати або промивати у воді або розчиннику (залежно від робочого середовища). Обслуговування ультразвукових апаратів пов'язано з їх надійністю, майже нехтуваною.

Ультразвуковий лізис і порушення клітин

Як правило, лізис зразків в лабораторії займе від 15 секунд до 2 хвилин. Оскільки інтенсивність ультразвукової обробки дуже легко регулюється за допомогою амплітуди встановлення часу обробки ультразвуком, а також за допомогою вибору відповідного обладнання, можна дуже легко або дуже різко порушити клітинні мембрани, залежно від структури клітин і з метою лізису ( наприклад, екстракція ДНК вимагає більш м'якої обробки ультразвуком, повна екстракція білка бактерій вимагає більш інтенсивного лікування ультразвуком). Температуру під час процесу можна контролювати інтегрованим датчиком температури, і його можна легко контролювати охолодженням (крижана ванна або стільникові камери з охолоджувальними куртками) або ультразвуком в імпульсному режимі. Під час обробки ультразвуком в імпульсному режимі короткі циклі вибуху з ультразвуком досягають 1-15 секунд, що дозволяє розсіювання тепла та охолодження протягом більш тривалих періодів.
Всі ультразвукові процеси повністю відтворюються і лінійно масштабуються.

Ультразвукові гомогенізатори для лізису та екстракції клітин

Різні типи ультразвукових пристроїв дозволяють відповідати меті підготовки зразків і забезпечувати зручність у використанні та комфорт експлуатації. Ультразвукові апарати зондового типу є найпоширенішими пристроями в лабораторії. Вони найбільш підходять для приготування малих і середніх зразків об'ємом від 0,1 мл до 1000мл. Різні розміри потужності та сонотроди дозволяють адаптувати ультразвуковий пристрій до об'єму зразка та посудини для найбільш ефективних та ефективних результатів ультразвукової обробки. Ультразвуковий зондовий пристрій є найкращим вибором, коли потрібно підготувати поодинокі зразки.

Якщо потрібно підготувати більше зразків, наприклад, 8-10 флаконів клітинного розчину, інтенсивна непряма ультразвукова обробка ультразвуковими системами, такими як VialTweeter або ультразвуковий кухорн, є найбільш підходящим методом гомогенізації для ефективного лізису. Кілька флаконів піддаються ультразвуковій обробці одночасно, з однаковою інтенсивністю. Це економить не тільки час, але і забезпечує однакову обробку всіх зразків, що робить результати серед зразків достовірними і порівнянними. Крім того, під час непрямої ультразвукової обробки уникає перехресне забруднення шляхом занурення ультразвукового сонотроду (також відомого як ультразвуковий зонд, ріг, кінчик або палець). Оскільки індивідуально до розміру проби використовуються підібрані флакони, трудомістке очищення і втрата зразка через зціджування судин опускаються. Для рівномірної ультразвукової обробки мультивелл або мікротитрових пластин Hielscher пропонує UIP400MTP.
Для більш високих об'ємів, наприклад, для комерційного виробництва клітинних екстрактів, найбільш придатні є неперервні ультразвукові системи з реактором для потоку. Безперервний і рівний потік обробленого матеріалу забезпечує рівномірну ультразвукову обробку. Всі параметри процесу дезінтеграції ультразвуку можна оптимізувати та пристосувати до вимог застосування та конкретного матеріалу клітини.
 
 
Приклад процедури для ультразвукового лізингу бактеріальних клітин:

• Підготовка клітинної суспензії: гранули для клітин повинні бути повністю суспендовані в буферному розчині шляхом гомогенізації (вибирайте ваш буферний розчин, сумісний з наступним аналізом, наприклад, методом специфічної хроматографії). При необхідності додайте лізозими та / або інші добавки (вони також повинні бути сумісними з засобами розділення / очищення). Обережно перемішайте / гомогенізуйте розчин м'якою ультразвуком до досягнення повної суспензії.
• Ультразвуковий лізис: помістіть зразок на крижану баню. Для розриву клітин зоскомістируйте суспензію при 60-90 секундових сплесках (використовуючи імпульсний режим ультразвуку).
• Виділення: центрифугувати лізат (наприклад, 10 хв при 10 000 х, при температурі 4 ° С). Очистити супернатант від клітинного гранулята ретельно. Супернатант є загальним лізатом клітин. Після фільтрації супернатанту ви отримуєте розслаблену рідину розчинного клітинного білка.

 
 
Найбільш поширеними застосуваннями ультразвукових пристроїв в біології та біотехнології є:

• Підготовка клітинних екстрактів
• Порушення дріжджів, бактерій, рослинних клітин, м'якої або твердої клітинної тканини, нуклеїнового матеріалу
• Білок екстракції
• Підготовка та ізоляція ферментів
• Виробництво антигенів
• Вилучення ДНК та / або цілеспрямована фрагментація
• Ліпосома підготовка