Ультразвукова обробка для лізису клітин: руйнування клітин та екстракція
Ультразвуковий лізис клітин – це широко застосовуваний метод підготовки зразків у сучасних біотехнологічних лабораторіях. Його основна мета – руйнування клітинних мембран або цілих клітин для вивільнення внутрішньоклітинних компонентів, таких як білки, нуклеїнові кислоти або органели. У повсякденній лабораторній роботі це означає, що ультразвукова обробка є стандартним методом контрольованого руйнування клітин та ефективної екстракції біомолекул. Ключова перевага ультразвукових гомогенізаторів полягає в їхній здатності точно регулювати критично важливі параметри процесу, зокрема інтенсивність ультразвуку, імпульсний режим і контроль температури. Такий контроль дає дослідникам змогу досягати надійного лізису, мінімізуючи термічне або механічне пошкодження чутливих біомолекул, що забезпечує щадний і водночас високоефективний процес екстракції.
Лізис клітин за допомогою ультразвукових гомогенізаторів
Ультразвуковий лізис клітин використовує акустичну кавітацію для руйнування клітинних мембран і вивільнення внутрішньоклітинних молекул. Hielscher Ultrasonics пропонує класичний ультразвуковий гомогенізатор зондового типу, а також ультразвукові гомогенізатори для стерильної обробки кількох зразків: VialTweeter для кількох пробірок і флаконів та ультразвуковий гомогенізатор UIP400MTP для 96-лункових планшетів, призначений для стандартних мікропланшетів.
Hielscher Ultrasonics постачає потужні безконтактні ультразвукові гомогенізатори для підготовки зразків і клінічного аналізу. Ультразвуковий гомогенізатор UIP400MTP для багатолункових планшетів, VialTweeter, CupHorn і проточний ультразвуковий гомогенізатор GDmini2 обробляють зразки в стерильних умовах.
Ультразвукові гомогенізатори UP100H (100 ват) і UP400St (400 ват): ультразвукова обробка для лізису клітин та екстракції.
Ультразвукові гомогенізатори для лізису клітин та екстракції
| Тип ультразвукового пристрою | Основне застосування | Об’єм зразка | Типовий варіант використання | Переваги | Приклади моделей |
|---|---|---|---|---|---|
| Ультразвукові гомогенізатори зондового типу | Ультразвукова обробка окремого зразка | Від 0,1 mL до ~1000 mL | Лізис клітин, екстракція білків, фрагментація ДНК/РНК | Точний контроль енергії; різноманітні сонотроди; оптимальні для зразків малого та середнього об’єму | UP100H, UP200St, UP400St |
| VialTweeter / CupHorn | Паралельна обробка кількох герметично закритих флаконів | 8–10 флаконів (~1–20 mL кожен) | Стандартизований лізис кількох клітинних суспензій | Рівномірна ультразвукова обробка; запобігання перехресному забрудненню; відтворювані результати | VialTweeter, CupHorn |
| Ультразвуковий гомогенізатор для 96-лункових планшетів | Ультразвукова обробка багатолункових і мікротитраційних планшетів | Формат мікропланшета | Високопродуктивний скринінг, протеоміка, клітинні аналізи | Одночасна рівномірна ультразвукова обробка в усіх лунках; ідеально підходить для робочих процесів з багатьма зразками | UIP400MTP |
| Реактори з проточними комірками | Безперервна ультразвукова обробка більших об’ємів | >1 L, з можливістю масштабування | Руйнування клітин у промислових масштабах, виробництво екстрактів | Безперервна обробка; можливість масштабування; повний контроль процесу (амплітуда, тиск, температура) | UIP1000hdT, UIP2000hdT + проточна комірка |
| Системи стерильної / непрямої ультразвукової обробки | Обробка зразків без забруднення | Залежить від флакона/пробірки/мікропланшета | Чутливі зразки, стерильні середовища, умови з нормативними вимогами | Відсутність контакту із зондом; запобігання перенесенню залишків між зразками; мінімальні зусилля на очищення | VialTweeter, CupHorn, UIP400MTP |
Переваги використання ультразвукової обробки для лізису клітин
Порівняно з іншими методами лізису клітин та екстракції ультразвуковий лізис клітин має кілька переваг:
- Швидкість: Ультразвуковий лізис клітин та екстракція – це швидкий метод, який дає змогу руйнувати клітини за лічені секунди. Це набагато швидше за інші методи, такі як гомогенізація, заморожування та розморожування або подрібнення в бісерному млині.
- Ефективність: Ультразвуковий лізис клітин та екстракцію можна застосовувати для обробки малих, великих або кількох зразків одночасно, що робить цей метод ефективнішим за інші методи, які потребують індивідуальної обробки малих зразків.
- Без хімічних реагентів: Ультразвуковий лізис клітин та екстракція – це неінвазивний метод, який не потребує використання агресивних хімічних реагентів або ферментів. Це робить його ідеальним для застосувань, у яких необхідно зберегти цілісність клітинного вмісту. Небажаного забруднення зразків можна уникнути.
- Високий вихід: Ультразвуковий лізис клітин та екстракція дають змогу отримувати клітинний вміст із високим виходом, зокрема ДНК, РНК та білки. Це пояснюється тим, що високочастотні звукові хвилі руйнують клітинні стінки та вивільняють вміст у навколишній розчин.
- Контроль температури: Удосконалені ультразвукові апарати дають змогу точно контролювати температуру зразка. Цифрові ультразвукові апарати Hielscher оснащені під’єднуваним датчиком температури та програмним забезпеченням для моніторингу температури.
- Відтворюваність: Протоколи ультразвукового лізису клітин можна легко відтворювати й навіть адаптувати до різних більших або менших об’ємів зразків шляхом простого лінійного збільшення масштабу.
- Універсальність: Ультразвуковий лізис клітин та екстракцію можна застосовувати для екстракції з широкого спектра типів клітин, зокрема бактерій, дріжджів, грибів, рослинних клітин і клітин ссавців. Цей метод також можна використовувати для екстракції різних типів молекул, зокрема білків, ДНК, РНК і ліпідів.
- Одночасна підготовка численних зразків: Hielscher Ultrasonics пропонує кілька рішень для зручної обробки численних зразків за абсолютно однакових умов процесу. Це робить етап підготовки зразків шляхом лізису та екстракції високоефективним і дає змогу заощаджувати час.
- Простота використання: Обладнання для ультразвукового лізису клітин та екстракції просте у використанні й потребує мінімального навчання. Воно також економічне, оскільки потребує одноразових інвестицій без необхідності повторно купувати одноразові витратні матеріали. Це робить його привабливим для широкого кола дослідників і лабораторій.
Загалом ультразвуковий лізис клітин та екстракція є швидким, ефективним, точно керованим і універсальним методом вилучення клітинного вмісту. Його переваги перед альтернативними методами роблять його привабливим вибором для широкого спектра дослідницьких і промислових застосувань.
Принцип дії ультразвукового лізису клітин
Ультразвуковий лізис клітин та екстракція ґрунтуються на використанні високочастотних звукових хвиль для руйнування клітин і вилучення їхнього вмісту. Звукові хвилі спричиняють зміни тиску в навколишній рідині, унаслідок чого утворюються та схлопуються дрібні бульбашки в процесі, відомому як кавітація. Ці бульбашки створюють локальні механічні сили дуже високої інтенсивності, які можуть руйнувати клітини й вивільняти їхній вміст у навколишній розчин.
Лізис клітин за допомогою ультразвукового апарата зазвичай передбачає такі етапи:
- Зразок поміщають у пробірку або ємність із рідким буфером.
- У зразок вводять ультразвуковий зонд і застосовують високочастотні звукові хвилі з частотою приблизно 20–30 kHz.
- Ультразвукові хвилі спричиняють коливання та кавітацію в навколишній рідині, створюючи локальні сили, які руйнують клітини й вивільняють їхній вміст.
- Зразок центрифугують або фільтрують для видалення будь-яких клітинних уламків, а вилучений вміст збирають для подальшого аналізу.
Недоліки поширених методів лізису
Під час роботи в лабораторіях ви, можливо, вже стикалися з труднощами лізису клітин за традиційними протоколами механічного або хімічного лізису.
- Механічний лізис: Методам механічного лізису, як-от розтиранню в ступці товкачиком або гомогенізації за допомогою преса Френча, кулькового млина чи роторно-статорної системи, часто бракує можливостей точного контролю та регулювання. Це означає, що подрібнення й розтирання можуть швидко призводити до виділення тепла та виникнення зсувних сил, здатних пошкодити зразок і денатурувати білки. Ці методи також можуть потребувати багато часу та великих кількостей вихідного матеріалу.
- Хімічний лізис: Методи хімічного лізису, як-от лізис із застосуванням детергентів, можуть пошкоджувати зразок, руйнуючи ліпідний бішар і денатуруючи білки. Вони також можуть потребувати кількох етапів і залишати залишкові забруднювачі, які перешкоджають подальшому використанню. Визначення оптимального дозування детергенту є додатковою складністю.
- Цикли заморожування та розморожування: Цикли заморожування та розморожування можуть спричиняти розрив клітинних мембран, проте повторні цикли також можуть призводити до денатурації та деградації білків. Цей метод також може потребувати кількох циклів, що може забирати багато часу й часто призводить до нижчого виходу.
- Ферментативний лізис: Методи ферментативного лізису можуть бути специфічними для певних типів клітин і потребувати кількох етапів, що робить їх тривалими. Вони також утворюють відходи та потребують ретельної оптимізації, щоб уникнути деградації зразка. Набори для ферментативного лізису часто дорогі. Якщо ваша поточна процедура ферментативного лізису дає недостатні результати, для посилення руйнування клітин можна застосувати ультразвукову обробку як синергічний метод.
На відміну від традиційних механічних і хімічних методів лізису клітин, ультразвукова обробка є дуже ефективним і надійним засобом руйнування клітин, який дає змогу повністю контролювати параметри ультразвукової обробки. Це забезпечує високу селективність вивільнення речовин і чистоту продукту. [cf. Balasundaram et al., 2009]
Вона підходить для всіх типів клітин і легко застосовується в малих і великих масштабах – завжди за контрольованих умов. Ультразвукові пристрої легко очищувати. Ультразвуковий гомогенізатор завжди має функції очищення на місці (CIP) і стерилізації на місці (SIP). Сонотрод являє собою суцільний титановий хвилевід, який можна протирати або промивати водою чи розчинником (залежно від робочого середовища). Завдяки своїй міцності ультразвукові пристрої майже не потребують технічного обслуговування.
Ультразвуковий лізис і руйнування клітин
Зазвичай лізис зразків у лабораторії триває від 15 секунд до 2 хвилин. Оскільки інтенсивність ультразвукової обробки дуже легко регулювати шляхом налаштування амплітуди й часу ультразвукової обробки, а також вибору відповідного обладнання, клітинні мембрани можна руйнувати дуже м’яко або дуже різко залежно від структури клітин і мети лізису (наприклад, екстракція ДНК потребує м’якшої ультразвукової обробки, а повна екстракція білків із бактерій – інтенсивнішої ультразвукової обробки). Температуру під час процесу можна відстежувати за допомогою вбудованого датчика температури й легко регулювати охолодженням (крижана баня або проточні комірки з охолоджувальними сорочками) чи ультразвуковою обробкою в імпульсному режимі. Під час ультразвукової обробки в імпульсному режимі короткі цикли ультразвукових імпульсів тривалістю 1–15 секунд забезпечують відведення тепла й охолодження протягом триваліших проміжків між ними.
Усі процеси, що здійснюються за допомогою ультразвуку, повністю відтворювані та лінійно масштабовані.
VialTweeter є ультразвуковим гомогенізатором для одночасної, рівномірної та швидкої стерильної підготовки численних зразків.
- Приготування клітинної суспензії: Клітинні осади необхідно повністю суспендувати в буферному розчині шляхом гомогенізації (виберіть буферний розчин, сумісний із подальшим аналізом, наприклад із конкретним методом хроматографії). За потреби додайте лізоцими та/або інші добавки (вони також мають бути сумісними із засобами розділення/очищення). Обережно перемішуйте/гомогенізуйте розчин за м’якої ультразвукової обробки до повного суспендування.
Дізнайтеся більше про синергічні ефекти поєднання лізоцимів з ультразвуковою обробкою! - Ультразвуковий лізис: Помістіть зразок у крижану баню. Для руйнування клітин обробляйте суспензію ультразвуком серіями тривалістю 60–90 секунд (використовуючи імпульсний режим вашого ультразвукового пристрою).
- Розділення: Центрифугуйте лізат (наприклад, 10 min. за 10 000 x g; за 4degC). Обережно відокремте супернатант від клітинного осаду. Супернатант є загальним клітинним лізатом. Після фільтрації супернатанту ви отримаєте освітлену рідину з розчинним клітинним білком.
Найпоширеніші застосування ультразвукових пристроїв у біології та біотехнології:
- Приготування клітинних екстрактів
- Руйнування дріжджів, бактерій, рослинних клітин, м’яких або твердих клітинних тканин, нуклеїнового матеріалу
- Екстракція білків
- Приготування та виділення ферментів
- Виробництво антигенів
- Екстракція ДНК та/або цільова фрагментація
- Приготування ліпосом
Руйнування клітин за допомогою ультразвукового пристрою зондового типу є ефективним методом підготовки зразків.
Численні застосування ультразвуку охоплюють біотехнологію, біоінженерію, мікробіологію, молекулярну біологію, біохімію, імунологію, бактеріологію, вірусологію, протеоміку, генетику, фізіологію, клітинну біологію, гематологію та ботаніку.
Лізис: руйнування клітинних структур
Клітини захищені напівпроникною плазматичною мембраною, яка складається з фосфоліпідного бішару (також білково-ліпідного бішару; утвореного гідрофобними ліпідами та гідрофільними молекулами фосфору з вбудованими білковими молекулами) і створює бар’єр між внутрішнім середовищем клітини (цитоплазмою) та позаклітинним середовищем. Рослинні та прокаріотичні клітини оточені клітинною стінкою. Через товсту багатошарову клітинну стінку з целюлози рослинні клітини важче піддаються лізису, ніж тваринні. Внутрішні структури клітини, як-от органели, ядро та мітохондрія, стабілізуються цитоскелетом.
Лізис клітин проводять із метою екстракції та відокремлення органел, білків, ДНК, мРНК або інших біомолекул.
Традиційні методи лізису клітин та їхні недоліки
Існує кілька методів лізису клітин, які можна поділити на механічні та хімічні; вони включають використання детергентів або розчинників, застосування високого тиску, бісерного млина або преса Френча. Найбільш проблемним недоліком цих методів є складність контролю та регулювання параметрів процесу, а отже, й відповідного впливу.
У таблиці нижче наведено основні недоліки поширених методів лізису:
Таблиця: традиційні методи лізису клітин мають суттєві недоліки
Процедура лізису
Лізис – це процес, що потребує обережності. Під час лізису руйнується захисний бар’єр клітинної мембрани, проте необхідно запобігати інактивації, денатурації та деградації екстрагованих білків унаслідок впливу нефізіологічного середовища (відхилення від значення pH). Тому лізис зазвичай проводять у буферному розчині. Більшість труднощів виникає через неконтрольоване руйнування клітин, що призводить до нецільового вивільнення всього внутрішньоклітинного матеріалу та/або денатурації цільового продукту.
Поширені запитання про ультразвукову обробку та лізис клітин
- Чи можна здійснювати лізис клітин за допомогою ультразвукової обробки? Так, ультразвукова обробка ефективно забезпечує лізис клітин за допомогою високочастотних ультразвукових хвиль, які спричиняють кавітацію – явище, за якого в клітинній суспензії утворюються та різко схлопуються крихітні бульбашки пари. Механічні сили, що виникають унаслідок цього, руйнують клітинні мембрани та сприяють вивільненню внутрішньоклітинних компонентів у рідину.
- Як використовувати ультразвуковий гомогенізатор для лізису клітин? Використання ультразвукового гомогенізатора для лізису клітин передбачає занурення його зонда в клітинну суспензію та налаштування таких параметрів, як амплітуда й тривалість імпульсів. Процес слід ретельно контролювати, щоб оптимізувати руйнування клітин і водночас мінімізувати денатурацію білків та інактивацію ферментів.
- На якому принципі ґрунтується ультразвукова обробка для лізису клітин? Ультразвукова обробка ґрунтується на принципі акустичної кавітації. Ультразвукова енергія передається в рідке середовище, спричиняючи швидкі коливання тиску, які призводять до утворення та імплозійного схлопування мікробульбашок. Ці схлопування створюють інтенсивні зсувні сили та локальні високі температури, руйнуючи клітинні структури й підвищуючи однорідність лізату.
- Скільки триває ультразвукова обробка для лізису клітин? Тривалість ультразвукової обробки для лізису клітин може істотно відрізнятися залежно від таких чинників, як тип клітин, щільність клітинної суспензії, потужність ультразвукового гомогенізатора та конкретний протокол. Типові процедури можуть тривати від кількох секунд до кількох хвилин; їх часто проводять циклічно, щоб контролювати виділення тепла та забезпечувати рівномірне руйнування клітин.
- Яка мета ультразвукової обробки під час екстракції білків? Під час екстракції білків ультразвукова обробка забезпечує ефективне руйнування клітинних мембран і солюбілізацію білків. Цей метод особливо корисний для вивільнення білків із внутрішньоклітинних компартментів, що робить його необхідним для підготовки лізатів, із яких білки надалі очищуватимуть або аналізуватимуть.
- Чому ультразвукову обробку використовують для екстракції? Ультразвуковій обробці надають перевагу для екстракції завдяки її швидкій дії та здатності цілеспрямовано передавати енергію, руйнуючи клітинні структури для вивільнення біоактивних молекул без застосування агресивної хімічної обробки й тим самим зберігаючи функціональну цілісність екстрагованих сполук.
- Чи порушує ультразвукова обробка білок-білкові взаємодії? Хоча ультразвукова обробка може ефективно руйнувати клітинні мембрани, вона також може порушувати білок-білкові взаємодії. Ступінь порушення залежить від інтенсивності ультразвукової обробки та тривалості впливу, що потенційно може призводити до денатурації або дисоціації білкових комплексів і впливати на подальші аналітичні або функціональні дослідження.
- Чи можна застосовувати ультразвукову обробку для лізису E. coli? Ультразвукові апарати Hielscher особливо ефективні для лізису бактеріальних клітин, зокрема E. coli, які мають міцні клітинні стінки. Ця технологія забезпечує фізичне руйнування клітинної стінки та мембрани під дією зсувних сил, що робить її одним із пріоритетних методів приготування бактеріальних лізатів у лабораторіях молекулярної біології та біохімії.
- Які процеси відбуваються після етапу ультразвукової обробки?
Подальші етапи після ультразвукового лізису зазвичай включають фракціонування лізату, цілеспрямоване виділення органел і подальшу екстракцію або очищення білків.
Потім оброблений лізат розділяють і готують для аналітичних або функціональних застосувань, як-от протеоміка високої роздільної здатності, транскриптоміка або дослідження зв’язування з рецепторами.
Література/Джерела
- Balasundaram, B.; Harrison, S.; Bracewell, D. G. (2009): Advances in product release strategies and impact on bioprocess design. Trends in Biotechnology 27/8, 2009. pp. 477-485.
- Vilkhu, K.; Manasseh, R.; Mawson, R.; Ashokkumar, M. (2011): Ultrasonic Recovery and Modification of Food ingredients. In: Feng/ Barbosa-Cánovas/ Weiss (2011): Ultrasound Technologies for Food and Bioprocessing. New York: Springer, 2011. pp. 345-368.
- Nico Böhmer, Andreas Dautel, Thomas Eisele, Lutz Fischer (2012): Recombinant expression, purification and characterisation of the native glutamate racemase from Lactobacillus plantarum NC8. Protein Expr Purif. 2013 Mar;88(1):54-60.
- Brandy Verhalen, Stefan Ernst, Michael Börsch, Stephan Wilkens (2012): Dynamic Ligand-induced Conformational Rearrangements in P-glycoprotein as Probed by Fluorescence Resonance Energy Transfer Spectroscopy. J Biol Chem. 2012 Jan 6;287(2): 1112-27.
- Claudia Lindemann, Nataliya Lupilova, Alexandra Müller, Bettina Warscheid, Helmut E. Meyer, Katja Kuhlmann, Martin Eisenacher, Lars I. Leichert (2013): Redox Proteomics Uncovers Peroxynitrite-Sensitive Proteins that Help Escherichia coli to Overcome Nitrosative Stress. J Biol Chem. 2013 Jul 5; 288(27): 19698–19714.
- Elahe Motevaseli, Mahdieh Shirzad, Seyed Mohammad Akrami, Azam-Sadat Mousavi, Akbar Mirsalehian, Mohammad Hossein Modarressi (2013): Normal and tumour cervical cells respond differently to vaginal lactobacilli, independent of pH and lactate. ed Microbiol. 2013 Jul; 62(Pt 7):1065-1072.