УЗД для лізису клітин: руйнування та екстракція клітин
Ультразвуковий лізис клітин - це широко застосовуваний метод підготовки зразків у сучасних біотехнологічних лабораторіях. Його основною метою є руйнування клітинних мембран або цілих клітин з метою вивільнення внутрішньоклітинних компонентів, таких як білки, нуклеїнові кислоти або органели. У повсякденній лабораторній роботі це означає, що ультразвукова обробка є стандартним методом для контрольованого руйнування клітин і ефективного вилучення біомолекул. Ключова перевага ультразвукових апаратів полягає в їх здатності точно модулювати критичні параметри процесу, включаючи інтенсивність ультразвуку, пульсацію і контроль температури. Такий контроль дозволяє дослідникам досягти надійного лізису, мінімізуючи термічне або механічне пошкодження чутливих біомолекул, що призводить до м'якого, але високоефективного процесу екстракції.
Лізис клітин за допомогою сокаторів
Ультразвуковий лізис клітин використовує акустичну кавітацію для руйнування клітинних мембран і вивільнення внутрішньоклітинних молекул. Hielscher Ultrasonics пропонує класичні ультразвукові апарати зондового типу, а також ультразвукові апарати для стерильної обробки декількох зразків: VialTweeter для декількох пробірок і флаконів і 96-лунковий планшетний ультразвуковий апарат UIP400MTP для стандартних мікропланшетів.
Hielscher Ultrasonics постачає потужні безконтактні ультразвукові апарати для підготовки зразків та клінічного аналізу. Багатолунковий пластинчастий сонник UIP400MTP, Твітер VialTweeter, Горн CupHorn і сонатор потоку GDmini2 обробляйте зразки в стерильних умовах.
Ультразвукові гомогенізатори UP100H (100 Вт) та UP400St (400 Вт): Ультразвук для лізису та екстракції клітин.
Ультразвукові гомогенізатори для лізису та екстракції клітин
| Тип ультразвукового пристрою | Фокус програми | Обсяг вибірки | Типовий випадок використання | Переваги | Приклади моделей |
|---|---|---|---|---|---|
| Ультразвукові апарати зондового типу | Ультразвукова обробка одного зразка | 0від 0,1 мл до ~1000 мл | Лізис клітин, екстракція білків, фрагментація ДНК/РНК | Точний контроль енергії; різні сонотроди; оптимальний для малих і середніх зразків | UP100H, UP200St, UP400St |
| VialTweeter / CupHorn | Паралельна обробка декількох запаяних флаконів | 8-10 флаконів (~1-20 мл кожен) | Стандартизований лізис суспензій багатьох клітин | Рівномірна ультразвукова обробка; уникає перехресного забруднення; відтворювані результати | VialTweeter, Кугорн |
| 96-лунковий пластинчастий сонар на 96 лунок | Ультразвукова обробка багатолункових і мікротитрованих планшетів | Формат мікропланшета | Високопродуктивний скринінг, протеоміка, клітинні аналізи | Одночасна, рівномірна ультразвукова обробка в усіх лунках; ідеально підходить для робочих процесів з декількома зразками | UIP400MTP |
| реактори проточних комірок | Безперервна ультразвукова обробка для більших обсягів | >1 л, масштабований | Руйнування клітин у промислових масштабах, виробництво екстрактів | Безперервна обробка; масштабованість; повний контроль процесу (амплітуда, тиск, температура) | UIP1000HDT, UIP2000HDT + проточна кювета |
| Стерильні / непрямі ультразвукові системи | Обробка зразків без забруднення | Залежно від флакону/пробірки/мікропланшета | Чутливі зразки, стерильне середовище, нормативні параметри | Відсутність контакту з зондом; уникнення перенесення; мінімальні зусилля для очищення | VialTweeter, Кугорн, UIP400MTP |
Переваги використання ультразвуку для лізису клітин
У порівнянні з іншими методами лізису та екстракції клітин, ультразвуковий лізис клітин має ряд переваг:
- Швидкість: Ультразвуковий лізис і екстракція клітин – це швидкий метод, який може розірвати клітини за лічені секунди. Це набагато швидше, ніж інші методи, такі як гомогенізація, заморожування-розморожування або фрезерування бісеру.
- Ефективність: Ультразвуковий лізис і екстракція клітин може використовуватися для обробки маленьких, великих або декількох зразків одночасно, що робить його більш ефективним, ніж інші методи, які вимагають індивідуальної обробки невеликих зразків.
- Не містить хімікатів: Ультразвуковий лізис і екстракція клітин є неінвазивним методом, який не вимагає використання агресивних хімічних речовин або ферментів. Це робить його ідеальним для застосувань, де потрібно підтримувати цілісність вмісту клітини. Можна уникнути небажаного забруднення зразків.
- Висока врожайність: Ультразвуковий лізис і екстракція клітин може витягти великий вихід клітинного вмісту, включаючи ДНК, РНК і білки. Це пов'язано з тим, що високочастотні звукові хвилі розривають клітинні стінки і вивільняють вміст в навколишній розчин.
- Контроль температури: Складні ультразвукові апарати дозволяють точно контролювати температуру зразка. Цифрові ультразвуки Hielscher оснащені роз'ємним датчиком температури та програмним забезпеченням для моніторингу температури.
- Відтворювані: Протоколи для лізису ультразвукових клітин можуть бути легко відтворені і навіть зіставлені з різними більшими або меншими обсягами зразків шляхом простого лінійного масштабування.
- Універсальний: Ультразвуковий лізис і екстракція клітин може бути використана для вилучення широкого спектру типів клітин, включаючи бактерії, дріжджі, гриби, клітини рослин і ссавців. Його також можна використовувати для вилучення різних типів молекул, включаючи білки, ДНК, РНК і ліпіди.
- Одночасна підготовка численних зразків: Hielscher Ultrasonics пропонує кілька рішень для комфортної обробки численних зразків в абсолютно однакових умовах процесу. Це робить етап підготовки зразків лізису та екстракції високоефективним та економічним за часом.
- Простий у використанні: Ультразвукове обладнання для лізису та екстракції клітин просте у використанні та вимагає мінімальної підготовки. Обладнання також є економічним, оскільки є єдиною інвестицією без необхідності повторного викупу відходів. Це робить його привабливим для широкого кола дослідників і лабораторій.
Загалом, ультразвуковий лізис і екстракція клітин є швидким, ефективним, точно контрольованим і універсальним методом вилучення клітинного вмісту. Його переваги перед альтернативними методами роблять його привабливим вибором для широкого спектру досліджень і промислових застосувань.
Принцип роботи лізису ультразвукових клітин
Ультразвуковий лізис і екстракція клітин використовує високочастотні звукові хвилі для руйнування клітин і вилучення їх вмісту. Звукові хвилі створюють зміни тиску в навколишній рідині, викликаючи утворення невеликих бульбашок і їх руйнування в процесі, відомому як кавітація. Ці бульбашки генерують локалізовані високоінтенсивні механічні сили, які можуть розірвати клітини та вивільнити їх вміст у навколишній розчин.
Лізис клітин за допомогою ультразвукового апарату зазвичай включає наступні етапи:
- Зразок поміщають в пробірку або контейнер з рідким буфером.
- У зразок вводиться ультразвуковий зонд, і на нього подаються високочастотні звукові хвилі з частотою приблизно 20-30 кГц.
- Ультразвукові хвилі викликають коливання і кавітацію в навколишній рідині, генеруючи локалізовані сили, які розривають клітини і вивільняють їх вміст.
- Зразок центрифугують або фільтрують, щоб видалити будь-які клітинні залишки, а вилучений вміст збирають для подальшого аналізу.
Недоліки поширених методів лізису
Під час роботи в лабораторіях ви, можливо, вже стикалися з труднощами лізису клітин за допомогою традиційних механічних або хімічних протоколів лізису.
- Механічний лізис: Механічні методи лізису, такі як шліфування розчином і товкачем або гомогенізація за допомогою френч-преса, бісерного млина або системи ротор-статор, часто не мають можливостей контролю та регулювання упору. Це означає, що використання фрезерування та шліфування може швидко генерувати тепло та зсувні сили, які можуть пошкодити зразок і денатурувати білки. Вони також можуть зайняти багато часу і вимагати великої кількості вихідного матеріалу.
- Хімічний лізис: Хімічні методи лізису, такі як лізис на основі миючого засобу, можуть пошкодити зразок, порушуючи ліпідний бішар і денатуруючи білки. Вони також можуть вимагати кількох етапів і можуть залишати залишкові забруднювачі, які заважають подальшим застосуванням. Пошук оптимального дозування миючого засобу є додатковим викликом.
- Цикли заморожування-розморожування: Цикли заморожування-розморожування можуть призвести до розриву клітинних мембран, але повторювані цикли також можуть спричинити денатурацію та деградацію білка. Цей метод також може вимагати кількох циклів, що може зайняти багато часу та часто призводить до зниження врожайності.
- Ферментативний лізис: Методи ферментативного лізису можуть бути специфічними для певних типів клітин і вимагати кількох етапів, що робить їх трудомісткими. Вони також утворюють відходи і вимагають ретельної оптимізації, щоб уникнути деградації зразка. Набори для ферментативного лізису часто дорогі. Якщо ваша поточна процедура ферментативного лізису не дає достатніх результатів, ультразвук як синергетичний метод може бути застосований для посилення руйнування клітин.
На відміну від звичайних механічних і хімічних методів лізису клітин, ультразвукова діагностика є дуже ефективним і надійним інструментом для розпаду клітин, що дозволяє повністю контролювати параметри ультразвукового випромінювання. Це забезпечує високу селективність до випуску матеріалів і чистоту продукту. [пор. Баласундарам та ін., 2009]
Він підходить для всіх типів клітин і легко застосовується в малих і великих масштабах – завжди в контрольованих умовах. Ультразвукові апарати прості в догляді. Ультразвуковий гомогенізатор завжди має функцію чистоти на місці (CIP) і стерилізації на місці (SIP). Сонотрод складається з масивного титанового ріжка, який можна протирати або промивати у воді або розчиннику (в залежності від робочого середовища). Догляд за ультразвуковими апаратами обумовлений їх міцністю, практично нехтуючи.
Ультразвуковий лізис і руйнування клітин
Як правило, лізис зразків у лабораторії займає від 15 секунд до 2 хвилин. Оскільки інтенсивність ультразвуку дуже легко регулювати за допомогою амплітуди, встановлення часу ультразвуку, а також шляхом вибору відповідного обладнання, можна дуже м'яко або дуже різко порушити клітинні мембрани, залежно від клітинної структури та мети лізису (наприклад, екстракція ДНК вимагає м'якшої ультразвукової діагностики, повна екстракція білка бактерій вимагає більш інтенсивного ультразвукового лікування). Температура під час процесу може контролюватися вбудованим датчиком температури і легко контролюватися охолодженням (крижана ванна або проточні камери з охолоджувальними сорочками) або за допомогою ультразвукового апарату в імпульсному режимі. Під час ультразвукового апарату в імпульсному режимі короткі цикли ультразвукового вибуху тривалістю 1-15 секунд дозволяють розсіювати тепло та охолоджувати протягом більш тривалих періодичних періодів.
Всі процеси, керовані ультразвуком, повністю відтворюються і лінійно масштабуються.
Твітер VialTweeter – ультразвуковий гомогенізатор для одночасного, рівномірного та швидкого стерильного приготування численних зразків.
- Приготування клітинної суспензії: Клітинні гранули повинні бути повністю зважені в буферному розчині шляхом гомогенізації (виберіть свій буферний розчин, сумісний з наступним аналізом, наприклад, методом специфічної хроматографії). Додайте лізоцими та/або інші добавки, якщо це необхідно (вони також повинні бути сумісні із засобами розділення/очищення). Обережно перемішати/гомогенізувати розчин під легким ультразвуком до досягнення повної суспензії.
Дізнайтеся більше про синергію лізоциму в поєднанні з ультразвуковою обробкою! - Ультразвуковий лізис: помістіть зразок у крижану ванну. Для руйнування клітин проводьте ультразвукове дослідження суспензії серіями 60-90 секунд (використовуючи імпульсний режим вашого ультразвукового апарату).
- Розділення: Центрифугуйте лізат (наприклад, 10 хв. при 10 000 x g; при 4 °C). Обережно відокремте супернатант від клітинної гранули. Супернатантом є загальний лізат клітин. Після фільтрації супернатанту ви отримуєте освітлену рідину білка розчинної клітини.
Найбільш поширеними застосуваннями ультразвукових апаратів в біології та біотехнології є:
- Приготування клітинного екстракту
- Руйнування дріжджів, бактерій, рослинних клітин, м'якої або твердої клітинної тканини, нуклеїнового матеріалу
- екстракція білка
- Отримання і виділення ферментів
- Вироблення антигенів
- Екстракція ДНК та/або прицільна фрагментація
- Підготовка ліпосом
Руйнування клітин за допомогою ультразвукового апарату зондового типу є ефективним методом підготовки зразків.
Різноманіття застосувань ультразвуку розгалужується в секторах біотехнології, біоінженерії, мікробіології, молекулярної біології, біохімії, імунології, бактеріології, вірусології, протеоміки, генетики, фізіології, клітинної біології, гематології та ботаніки.
Лізис: руйнування клітинних структур
Клітини захищені напівпроникною плазматичною мембраною, яка складається з фосфо-ліпідного бішару (також білково-ліпідного бішару; утворений гідрофобними ліпідами та гідрофільними молекулами фосфору з вбудованими білковими молекулами) і створює бар'єр між внутрішніми частинами клітини (цитоплазмою) та позаклітинним середовищем. Рослинні клітини і клітини прокаріотів оточені клітинною стінкою. Через багатошарову товсту клітинну стінку целюлози рослинні клітини важче піддаються лізу, ніж клітини тварин. Внутрішня частина клітини, така як органели, ядро, мітохондрії, стабілізується цитоскелетом.
Шляхом лізування клітин він спрямований на вилучення та відділення органел, білків, ДНК, мРНК або інших біомолекул.
Традиційні методи лізису клітин та їх недоліки
Існує кілька методів лізату клітин, які можна розділити на механічні та хімічні методи, які включають використання миючих засобів або розчинників, застосування високого тиску або використання бісерного млина або френч-преса. Найбільш проблематичним недоліком цих методів є складний контроль і регулювання параметрів процесу і тим самим вплив.
У таблиці нижче відображені основні недоліки поширених методів лізису:
Таблиця: Традиційні методи лізису клітин мають серйозні недоліки
Процедура лізису
Лізис – чутливий процес. Під час лізису руйнується захист клітинної мембрани, однак необхідно запобігати інактивації, денатурації та деградації екстрагованих білків нефізіологічним середовищем (відхилення від значення рН). Тому в цілому лізис проводиться в буферному розчині. Більшість труднощів виникають через неконтрольоване руйнування клітин, що призводить до нецілеспрямованого вивільнення всього внутрішньоклітинного матеріалу або/і денатурації цільового продукту.
Часті запитання про ультразвукове дослідження та лізис клітин
- Чи можна лізувати клітини за допомогою УЗД? Так, ультразвук ефективно лізує клітини за допомогою високочастотних ультразвукових хвиль, які викликають кавітацію — явище, коли крихітні бульбашки пари утворюються та сильно руйнуються в клітинній суспензії. Виникаючі механічні сили руйнують клітинні мембрани і полегшують вивільнення внутрішньоклітинних компонентів в рідину.
- Як використовувати ультразвуковий апарат для лізису клітин? Використання ультразвукового апарату для лізису клітин передбачає занурення зонда ультразвуку в клітинну суспензію та регулювання таких параметрів, як амплітуда та тривалість імпульсу. Процес слід ретельно контролювати, щоб оптимізувати руйнування клітин, мінімізуючи при цьому денатурацію білка та інактивацію ферментів.
- Який принцип ультразвукового апарату для лізису клітин? Ультразвук діє за принципом акустичної кавітації. У рідке середовище передається ультразвукова енергія, що викликає швидкі коливання тиску, які призводять до утворення і вибуху мікропухирців. Ці імплозії породжують інтенсивні сили зсуву та локалізовані високі температури, порушуючи клітинні структури та підвищуючи однорідність лізату.
- Скільки часу займає ультразвукове дослідження лізису клітин? Тривалість ультразвуку для лізису клітин може значно відрізнятися залежно від таких факторів, як тип клітини, щільність клітин, потужність ультразвуку та конкретний використовуваний протокол. Типові процедури можуть тривати від кількох секунд до кількох хвилин, часто виконуються циклами, щоб керувати виробленням тепла та забезпечити рівномірне руйнування клітин.
- З якою метою проводиться ультразвукове дослідження при екстракції білка? При екстракції білків ультразвук служить для ефективного розриву клітинних мембран і розчинення білків. Цей метод особливо корисний для вивільнення білків із клітинних компартментів, що робить його важливим для приготування лізатів, з яких білки потрібно очищати або аналізувати.
- Чому для екстракції використовується ультразвукова хвороба? Ультразвук є кращим для екстракції завдяки його швидкій дії та здатності застосовувати цілеспрямовану енергію, розщеплюючи клітинні структури для вивільнення біологічно активних молекул без використання жорстких хімічних обробок, тим самим зберігаючи функціональну цілісність вилучених сполук.
- Чи порушує ультразвукове дослідження білково-білкову взаємодію? Хоча ультразвук може ефективно порушити клітинні мембрани, він також може порушити білково-білкову взаємодію. Рівень порушення залежить від інтенсивності ультразвукового випромінювання та тривалості впливу, що потенційно може призвести до денатурації або дисоціації білкових комплексів, що може вплинути на подальші аналітичні або функціональні дослідження.
- Чи можна використовувати ультразвукову хворобу для лізу кишкової палички? Ультразвукові апарати Hielscher особливо ефективні для лізування бактеріальних клітин, таких як кишкова паличка, які мають міцні клітинні стінки. Цей метод забезпечує фізичний метод зсуву клітинної стінки та мембрани, що робить його кращим методом для приготування бактеріальних лізатів у лабораторіях молекулярної біології та біохімії.
- Які подальші процеси слідують за етапом ультразвукової обробки?
Наступні етапи після ультразвукового лізису зазвичай включають фракціонування лізату, цілеспрямоване виділення органел і подальшу екстракцію або очищення білка.
Оброблений лізат потім відокремлюють і готують для аналітичних або функціональних застосувань, таких як протеоміка високої роздільної здатності, транскриптоміка або дослідження зв'язування рецепторів.
Література/Список літератури
- Balasundaram, B.; Harrison, S.; Bracewell, D. G. (2009): Advances in product release strategies and impact on bioprocess design. Trends in Biotechnology 27/8, 2009. pp. 477-485.
- Vilkhu, K.; Manasseh, R.; Mawson, R.; Ashokkumar, M. (2011): Ultrasonic Recovery and Modification of Food ingredients. In: Feng/ Barbosa-Cánovas/ Weiss (2011): Ultrasound Technologies for Food and Bioprocessing. New York: Springer, 2011. pp. 345-368.
- Nico Böhmer, Andreas Dautel, Thomas Eisele, Lutz Fischer (2012): Recombinant expression, purification and characterisation of the native glutamate racemase from Lactobacillus plantarum NC8. Protein Expr Purif. 2013 Mar;88(1):54-60.
- Brandy Verhalen, Stefan Ernst, Michael Börsch, Stephan Wilkens (2012): Dynamic Ligand-induced Conformational Rearrangements in P-glycoprotein as Probed by Fluorescence Resonance Energy Transfer Spectroscopy. J Biol Chem. 2012 Jan 6;287(2): 1112-27.
- Claudia Lindemann, Nataliya Lupilova, Alexandra Müller, Bettina Warscheid, Helmut E. Meyer, Katja Kuhlmann, Martin Eisenacher, Lars I. Leichert (2013): Redox Proteomics Uncovers Peroxynitrite-Sensitive Proteins that Help Escherichia coli to Overcome Nitrosative Stress. J Biol Chem. 2013 Jul 5; 288(27): 19698–19714.
- Elahe Motevaseli, Mahdieh Shirzad, Seyed Mohammad Akrami, Azam-Sadat Mousavi, Akbar Mirsalehian, Mohammad Hossein Modarressi (2013): Normal and tumour cervical cells respond differently to vaginal lactobacilli, independent of pH and lactate. ed Microbiol. 2013 Jul; 62(Pt 7):1065-1072.