Mantarlardan Kitin ve Kitosan Üretimi

Ultrasonikasyon, mantarlar gibi fungal kaynaklardan kitin ve kitosanı açığa çıkarmak için son derece verimli bir yöntemdir. Yüksek kaliteli bir biyopolimer elde etmek için kitin ve kitosanın sonraki işleme aşamalarında depolimerize ve deasetile edilmesi gerekir. Ultrasonik destekli depolimerizasyon ve deasetilasyon, yüksek moleküler ağırlığa ve üstün biyoyararlanıma sahip yüksek kaliteli kitosanlar elde edilmesini sağlayan, son derece etkili, basit ve hızlı bir tekniktir.

Ultrasonikasyon Yoluyla Mantarlardan Elde Edilen Kitin ve Kitosan

Lentinus edodes (shiitake), Ganoderma lucidum (Lingzhi veya reishi), Inonotus obliquus (chaga), Agaricus bisporus (kültür mantarı), Hericium erinaceus (aslan yelesi), Cordyceps sinensis (tırtıl mantarı), Grifola frondosa (tavuk mantarı), Trametes versicolor (Coriolus versicolor, Polyporus versicolor, hindi kuyruğu) gibi yenilebilir ve tıbbi mantarlar ile diğer birçok mantar türü, gıda olarak ve biyoaktif bileşiklerin ekstraksiyonu için yaygın biçimde kullanılır. Bu mantarların yanı sıra işleme artıkları da (mantar atıkları) kitosan üretmek için kullanılabilir. Ultrasonikasyon, kitinin mantar hücre duvarı yapısından açığa çıkmasını desteklemenin yanı sıra ultrasonik destekli depolimerizasyon ve deasetilasyon yoluyla kitinin değerli kitosana dönüşümünü de ilerletir.

Kitinin kitosana dönüşümü için depolimerizasyonu ve deasetilasyonu sonikasyon ile desteklenir

Prob tipi bir ultrasonik sistemle uygulanan yoğun ultrasonikasyon, kitinin depolimerizasyonunu ve deasetilasyonunu destekleyerek kitosan oluşumuna yol açmak için kullanılan bir tekniktir. Kitin, kabukluların ve böceklerin dış iskeletlerinde ve bazı mantarların hücre duvarlarında bulunan, doğal olarak oluşan bir polisakkarittir. Kitosan, kitin molekülünden asetil gruplarının uzaklaştırılmasıyla kitinden elde edilir.

Fungal Kitinin Kitosana Dönüştürülmesi İçin Ultrasonik Yöntem

Kitinden kitosan üretmek için yoğun ultrasonikasyon uygulandığında, bir kitin süspansiyonu, genellikle 20 kHz ile 30 kHz aralığındaki yüksek yoğunluklu, düşük frekanslı ultrason dalgalarıyla sonikasyona tabi tutulur. İşlem, sıvı içindeki mikroskobik vakum kabarcıklarının oluşması, büyümesi ve çökmesi anlamına gelen yoğun akustik kavitasyon oluşturur. Kavitasyon, kavitasyon kabarcıklarını çevreleyen sıvıda yerel olarak son derece yüksek kesme kuvvetleri, yüksek sıcaklıklar (birkaç bin santigrat dereceye kadar) ve basınçlar (birkaç yüz atmosfere kadar) oluşturur. Bu aşırı koşullar, kitin polimerinin parçalanmasına ve ardından gerçekleşen deasetilasyona katkıda bulunur.
 

İki mantar türünden elde edilen kitin ve kitosanların SEM görüntüleri: a) L. vellereus kaynaklı kitin; b) P. ribis kaynaklı kitin; c) L.vellereus kaynaklı kitosan; d) P. ribis kaynaklı kitosan.
görsel ve çalışma: © Erdoğan et al., 2017

Kitinin Ultrasonik Depolimerizasyonu

Kitinin depolimerizasyonu, mikroakış ve sıvı jetleri gibi mekanik kuvvetlerin birleşik etkileriyle ve ayrıca kavitasyon sırasında oluşan serbest radikallerin ve diğer reaktif türlerin tetiklediği, ultrasonla başlatılan kimyasal reaksiyonlarla gerçekleşir. Kavitasyon sırasında oluşan yüksek basınç dalgaları, kitin zincirlerinin kesme gerilimine maruz kalmasına neden olarak polimerin daha küçük parçalara ayrılmasıyla sonuçlanır.

Kitinin Ultrasonik Deasetilasyonu

Yoğun ultrasonikasyon, depolimerizasyonun yanı sıra kitinin deasetilasyonunu da destekler. Deasetilasyon, asetil gruplarının kitin molekülünden uzaklaştırılmasını içerir ve kitosan oluşumuna yol açar. Yoğun ultrasonik enerji, özellikle kavitasyon sırasında oluşan yüksek sıcaklıklar ve basınçlar, deasetilasyon reaksiyonunu hızlandırır. Kavitasyonun oluşturduğu reaktif koşullar, kitindeki asetil bağlarının kırılmasına yardımcı olarak asetik asidin açığa çıkmasına ve kitinin kitosana dönüşmesine yol açar.
Genel olarak yoğun ultrasonikasyon, kitin polimerini parçalamak ve kitosana dönüşümü kolaylaştırmak için gerekli mekanik ve kimyasal enerjiyi sağlayarak hem depolimerizasyon hem de deasetilasyon süreçlerini geliştirir. Bu teknik, ilaç, tarım ve biyomedikal mühendislik dahil olmak üzere çeşitli sektörlerde çok sayıda uygulaması bulunan kitosanın kitinden üretimi için hızlı ve verimli bir yöntem sunar.

Yüksek Güçlü Ultrason ile Mantardan Endüstriyel Kitosan Üretimi

Ticari kitin ve kitosan üretimi ağırlıklı olarak deniz ürünleri sektörlerinin atıklarına (yani balıkçılık, kabuklu deniz ürünleri hasadı vb.) dayanır. Farklı hammadde kaynakları, farklı kitin ve kitosan kalitelerine yol açar; balıkçılıktaki mevsimsel değişimler nedeniyle üretim ve kalitede dalgalanmalar meydana gelir. Ayrıca fungal kaynaklardan elde edilen kitosanın, deniz kaynaklı kitosanla karşılaştırıldığında homojen polimer uzunluğu ve daha yüksek çözünürlük gibi üstün özellikler sunduğu bildirilmektedir. (bkz. Ghormade et al., 2017) Tekdüze özelliklere sahip kitosan sağlamak amacıyla, mantar türlerinden kitin ekstraksiyonu istikrarlı bir alternatif üretim yöntemi haline gelmiştir. Ultrasonik ekstraksiyon ve deasetilasyon teknolojisi kullanılarak mantarlardan kitin ve kitosan üretimi kolay ve güvenilir biçimde gerçekleştirilebilir. Yoğun sonikasyon, kitini açığa çıkarmak için hücre yapılarını parçalar ve üstün kitin verimi ile ekstraksiyon verimliliği için sulu çözücülerde kütle transferini destekler. Ardından uygulanan ultrasonik deasetilasyon, kitini değerli kitosana dönüştürür. Hem ultrasonik kitin ekstraksiyonu hem de kitosana dönüştürmek için uygulanan deasetilasyon, her türlü ticari üretim düzeyine doğrusal olarak ölçeklenebilir.

Sonikasyon, fungal kitosan üretimini yoğunlaştırır ve üretimi daha verimli ve ekonomik hale getirir.
(görsel ve çalışma: © Zhu et al., 2019)

Ultrasonik Kitin ve Kitosan Deasetilasyonuna İlişkin Araştırma Sonuçları

Zhu et al. (2018), çalışmalarında ultrasonik deasetilasyonun, daha düşük reaksiyon sıcaklıklarında β-kitini %83–94 deasetilasyon ile kitosana dönüştüren kritik bir atılım olduğunun kanıtlandığı sonucuna varmıştır. Soldaki görsel, ultrasonik olarak deasetile edilmiş kitosanın SEM görüntüsünü göstermektedir (90 W, 15 min, 20 w/v% NaOH, 1:15 (g: mL) (görsel ve çalışma: © Zhu et al., 2018)
Protokollerinde NaOH çözeltisi (20 w/v %), NaOH pullarının deiyonize suda çözülmesiyle hazırlanmıştır. Alkali çözelti daha sonra bir santrifüj tüpünde, 1:20 (g: mL) katı–sıvı oranında GLSP tortusuna (0,5 g) eklenmiştir. Kitosan, 1:1 çözelti hacim oranında NaCl (40 mL, 0,2 M) ve asetik aside (0,1 M) eklenmiştir. Süspansiyon daha sonra prob tipi bir sonikatör (250W, 20kHz) kullanılarak 25°C gibi ılımlı bir sıcaklıkta 60 min boyunca ultrasona tabi tutulmuştur. (bkz. Zhu et al., 2018)
 
Pandit et al. (2021), kitosan çözeltilerinin bozunma hızının, polimeri çözündürmek için kullanılan asit konsantrasyonlarından nadiren etkilendiğini ve büyük ölçüde sıcaklığa, ultrason dalgalarının yoğunluğuna ve polimeri çözmek için kullanılan ortamların iyonik kuvvetine bağlı olduğunu bulmuştur. (bkz. Pandit et al., 2021)
 
Başka bir çalışmada Zhu et al. (2019), fungal hammadde olarak Ganoderma lucidum spor tozlarını kullanmış ve ultrasonik destekli deasetilasyonu ve sonikasyon süresi, katı–sıvı oranı, NaOH konsantrasyonu ve ışınlama gücü gibi işleme parametrelerinin kitosanın deasetilasyon derecesi (DD) üzerindeki etkilerini araştırmıştır. En yüksek DD değeri şu ultrasonik parametrelerde elde edilmiştir: 80W güçte 20 min sonikasyon, %10 (g:ml) NaOH, 1:25 (g:ml). Ultrasonik olarak elde edilen kitosanın yüzey morfolojisi, kimyasal grupları, termal kararlılığı ve kristalliliği SEM, FTIR, TG ve XRD kullanılarak incelenmiştir. Araştırma ekibi, ultrasonik olarak üretilen kitosanın deasetilasyon derecesinde (DD), dinamik viskozitesinde ([η]) ve moleküler ağırlığında (Mv¯) belirgin bir artış bildirmektedir. Sonuçlar, mantarların ultrasonik deasetilasyonu tekniğinin, biyomedikal uygulamalara uygun kitosan için son derece etkili bir üretim yöntemi olduğunu vurgulamıştır. (bkz. Zhu et al., 2019)

Ultrasonik Depolimerizasyon ve Deasetilasyon ile Üstün Kitosan Kalitesi

Ultrasonla yürütülen kitin / kitosan ekstraksiyonu ve depolimerizasyon süreçleri hassas biçimde kontrol edilebilir ve ultrasonik işlem parametreleri, hammaddelere ve hedeflenen son ürün kalitesine (örneğin moleküler ağırlık, deasetilasyon derecesi) göre ayarlanabilir. Bu, ultrason işleminin dış etkenlere uyarlanmasına ve üstün sonuçlar ile verimlilik için optimum parametrelerin belirlenmesine olanak tanır.
Ultrasonik olarak deasetile edilmiş kitosan, mükemmel biyoyararlanım ve biyouyumluluk gösterir. Ultrasonik olarak hazırlanan kitosan biyopolimerleri, biyomedikal özellikler bakımından termal olarak elde edilen kitosanla karşılaştırıldığında, ultrasonik olarak üretilen kitosan belirgin biçimde iyileşmiş fibroblast (L929 hücresi) canlılığı ve hem Escherichia coli (E. coli) hem de Staphylococcus aureus (S. aureus) için artmış antibakteriyel aktivite sergiler.
(bkz. Zhu et al., 2018)
 

a) gladius, b) ultrasonla işlenmiş gladius, c) β-kitin, d) ultrasonla işlenmiş β-kitin ve e) kitosanın 100× büyütmedeki taramalı elektron mikroskobu (SEM) görüntüleri (kaynak: Preto et al. 2017)

Kitin ve Kitosan İşleme İçin Yüksek Performanslı Ultrasonik Ekipman

Kitinin parçalanması ve kitosana dönüştürülmek üzere deasetilasyonu; yüksek genlikler sağlayabilen, işlem parametreleri üzerinde hassas kontrol sunan ve ağır yük altında ve zorlu ortamlarda 24/7 çalıştırılabilen güçlü ve güvenilir ultrasonik ekipman gerektirir. Hielscher Ultrasonics ürün yelpazesi bu gereklilikleri güvenilir biçimde karşılar. Olağanüstü ultrason performansının yanı sıra Hielscher sonikatörleri yüksek enerji verimliliklerine sahiptir; bu, özellikle ticari büyük ölçekli üretimde kullanıldıklarında önemli bir ekonomik avantajdır.
Hielscher sonikatörleri, işlem ihtiyaçlarınıza optimum biçimde uyum sağlamak için sonotrotlar, güçlendiriciler, reaktörler veya akış hücreleri gibi aksesuarlarla donatılabilen yüksek performanslı sistemlerdir.
 Dijital renkli ekran, sonikasyon işlemlerini önceden ayarlama seçeneği, entegre bir SD karta otomatik veri kaydı, tarayıcı üzerinden uzaktan kontrol ve daha birçok özellik ile Hielscher sonikatörleri en yüksek düzeyde işlem kontrolü ve kullanım kolaylığı sağlar. Sağlamlık ve yüksek yük taşıma kapasitesiyle birleşen Hielscher ultrasonik sistemleri, üretimde güvenilir iş gücünüzdür. 
Kitinin parçalanması ve deasetilasyonu, hedeflenen dönüşümü ve yüksek kaliteli bir nihai kitosan ürününü elde etmek için güçlü ultrason gerektirir. Özellikle kitin pullarının parçalanması ve depolimerizasyon / deasetilasyon adımları için yüksek genlikler ve artırılmış basınçlar kritik öneme sahiptir. Hielscher Ultrasonics endüstriyel ultrasonik işlemcileri, çok yüksek genlikleri kolaylıkla sağlar. 200µm’ye kadar genliklerde 24/7 kesintisiz çalışma mümkündür. Daha da yüksek genlikler için özel olarak uyarlanmış ultrasonik sonotrotlar mevcuttur. Hielscher ultrasonik sistemlerinin güç kapasitesi, güvenli ve kullanıcı dostu bir süreçte verimli ve hızlı depolimerizasyon ve deasetilasyona olanak tanır.
 

Ultrasonikasyon ile İyileştirilen Sinerjik Kitin İşleme

Geleneksel kimyasal ve enzimatik kitin deasetilasyonunun dezavantajlarının (yani düşük verimlilik, yüksek enerji maliyeti, uzun işleme süresi, toksik çözücüler) üstesinden gelmek için yüksek yoğunluklu ultrason, kitin ve kitosan işlemesine entegre edilmiştir. Yüksek yoğunluklu sonikasyon ve bunun sonucunda oluşan akustik kavitasyon etkileri, polimer zincirlerinin hızla bölünmesine yol açar ve polidispersiteyi azaltarak kitosan sentezini destekler. Ayrıca ultrasonik kesme kuvvetleri, çözeltideki kütle transferini yoğunlaştırarak kimyasal, hidrolitik veya enzimatik reaksiyonları geliştirir. Ultrasonik kitin işleme, kimyasal yöntemler, hidroliz veya enzimatik prosedürler gibi mevcut kitin işleme teknikleriyle birleştirilebilir.

Ultrasonik Destekli Kimyasal Deasetilasyon ve Depolimerizasyon

Kitin, reaktif olmayan ve çözünmeyen bir biyopolimer olduğundan, çözünür ve biyoerişilebilir kitosan elde etmek için demineralizasyon, deproteinizasyon ve depolimerizasyon / deasetilasyon işlem adımlarından geçirilmelidir. Bu işlem adımları, HCl gibi kuvvetli asitlerle ve NaOH ve KOH gibi kuvvetli bazlarla yapılan uygulamaları içerir. Bu geleneksel işlem adımları verimsiz ve yavaş olduğundan ve yüksek miktarda enerji gerektirdiğinden, sonikasyonla işlem yoğunlaştırma kitosan üretimini önemli ölçüde iyileştirir. Yüksek güçlü ultrason uygulaması, kitosan verimini ve kalitesini artırır, işlemi günlerden birkaç saate indirir, daha ılımlı çözücülere olanak tanır ve tüm süreci enerji açısından daha verimli hale getirir.

Kitinin Ultrason ile İyileştirilmiş Deproteinizasyonu

Vallejo-Dominguez et al. (2021), kitin deproteinizasyonuna ilişkin araştırmalarında şu bulguya ulaşmıştır: “Biyopolimer üretimi için ultrason uygulaması, kitinin protein içeriğini ve parçacık boyutunu azaltmıştır. Ultrason desteğiyle yüksek deasetilasyon derecesine ve orta moleküler ağırlığa sahip kitosan üretilmiştir.”

Kitin Depolimerizasyonu İçin Ultrasonik Hidroliz

Kimyasal hidrolizde, kitini deasetile etmek için asitler veya alkaliler kullanılır; ancak alkali deasetilasyon (örneğin sodyum hidroksit NaOH) daha yaygın olarak uygulanır. Asit hidrolizi, kitin ve kitosanı depolimerize etmek için organik asit çözeltilerinin kullanıldığı, geleneksel kimyasal deasetilasyona alternatif bir yöntemdir. Asit hidrolizi yöntemi, çoğunlukla kitin ve kitosanın moleküler ağırlığının homojen olması gerektiğinde kullanılır. Bu geleneksel hidroliz işleminin yavaş olduğu ve yüksek enerji tüketimi ile yüksek maliyet gerektirdiği bilinmektedir. Kuvvetli asitler, yüksek sıcaklıklar ve basınçlar gerektirmesi, hidrolitik kitosan işlemini çok pahalı ve zaman alıcı bir prosedüre dönüştüren etkenlerdir. Kullanılan asitler, nötralizasyon ve tuz giderme gibi sonraki işlemleri gerektirir.
Yüksek güçlü ultrasonun hidroliz işlemine entegre edilmesiyle, kitin ve kitosanın hidrolitik bölünmesi için gereken sıcaklık ve basınç önemli ölçüde düşürülebilir. Ayrıca sonikasyon, daha düşük asit konsantrasyonlarına veya daha ılımlı asitlerin kullanımına olanak tanır. Bu, işlemi daha sürdürülebilir, verimli, uygun maliyetli ve çevre dostu hale getirir.

Ultrasonik Destekli Kimyasal Deasetilasyon

Kitin ve kitosanın kimyasal parçalanması ve deasetilasyonu, ağırlıklı olarak kitin veya kitosanın mineral asitler (örneğin hidroklorik asit HCl), sodyum nitrit (NaNO₂) veya hidrojen peroksit (H₂O₂) ile işlenmesiyle gerçekleştirilir. Ultrason, deasetilasyon hızını artırarak hedeflenen deasetilasyon derecesine ulaşmak için gereken reaksiyon süresini kısaltır. Bu, sonikasyonun gerekli 12–24 saatlik işleme süresini birkaç saate indirdiği anlamına gelir. Ayrıca sonikasyon, önemli ölçüde daha düşük kimyasal konsantrasyonlarına olanak tanır; örneğin sonikasyon kullanıldığında %40 (w/w) sodyum hidroksit yeterliyken, ultrason kullanılmadığında %65 (w/w) gerekir.

Ultrasonik–Enzimatik Deasetilasyon

Enzimatik deasetilasyon, ılımlı ve çevreye zararsız bir işleme biçimi olsa da verimliliği ve maliyetleri ekonomik değildir. Enzimlerin son üründen sonraki aşamalarda izolasyonu ve saflaştırılması karmaşık, yoğun emek gerektiren ve pahalı işlemler olduğundan, enzimatik kitin deasetilasyonu ticari üretimde uygulanmaz, yalnızca bilimsel araştırma laboratuvarlarında kullanılır.
Enzimatik deasetilasyondan önce uygulanan ultrasonik ön işlem, kitin moleküllerini parçalayarak yüzey alanını genişletir ve enzimlerin erişebileceği daha fazla yüzey oluşturur. Yüksek performanslı sonikasyon, enzimatik deasetilasyonu iyileştirmeye yardımcı olur ve işlemi daha ekonomik hale getirir.