การสั่นด้วยคลื่นเสียงในไมโครเพลทในงานโพรตีโอมิกส์แบบช็อตกัน – บันทึกการใช้งาน
การวิเคราะห์โปรตีโอมิกส์ด้วยวิธี Shotgun ขึ้นอยู่กับการเตรียมตัวอย่างที่มีประสิทธิภาพและสามารถทำซ้ำได้ เพื่อเปลี่ยนวัสดุชีวภาพที่ซับซ้อนให้กลายเป็นเปปไทด์ที่พร้อมสำหรับการวิเคราะห์ด้วย LC-MS/MS เครื่องโซนิเคเตอร์ไมโครเพลท UIP400MTP สนับสนุนกระบวนการนี้โดยช่วยให้สามารถทำการโซนิเคชันแบบมาตรฐานและขนานกันของตัวอย่างปริมาณน้อย ช่วยห้องปฏิบัติการปรับปรุงประสิทธิภาพในการทำลายโครงสร้าง การสกัด และการคืนสภาพของตัวอย่างในกระบวนการทำงานที่ใช้ไมโครเพลท บันทึกการใช้งานนี้อธิบายวิธีการรวม UIP400MTP เข้ากับการเตรียมตัวอย่างโปรตีโอมิก โดยใช้กระบวนการทำงานของถุงน้ำนอกเซลล์ที่เผยแพร่จากการศึกษา PLA2G12A/Th17 เป็นตัวอย่างที่ผ่านการทดสอบในห้องปฏิบัติการ
การใช้คลื่นเสียงในไมโครเพลทเพื่อความแม่นยำในการวิเคราะห์โปรตีโอมิกส์แบบช็อตกัน
สำหรับนักวิจัยด้านโปรตีโอมิกส์ การเตรียมตัวอย่างที่สามารถทำซ้ำได้เป็นสิ่งสำคัญอย่างยิ่งสำหรับข้อมูล LC-MS/MS ที่มีคุณภาพสูง เครื่องโซนิเคเตอร์ไมโครเพลท UIP400MTP รองรับการทำโซนิเคชันแบบมาตรฐานและขนานในกระบวนการทำงานที่ใช้จานและปริมาณน้อย/ปริมาณมากในปริมาณสูง
มันมีประโยชน์เป็นพิเศษสำหรับห้องปฏิบัติการที่ทำงานกับ:
- ชุดตัวอย่างขนาดใหญ่ที่ต้องการการประมวลผลที่สม่ำเสมอในหลายบ่อ
- วัสดุที่มีข้อมูลจำกัด ซึ่งต้องลดการสูญเสียตัวอย่างและความแปรปรวนให้น้อยที่สุด
- ตัวอย่างที่มีไขมันสูง เช่น อนุภาคเซลล์นอกเซลล์
- การเตรียมทางชีวภาพที่ซับซ้อนซึ่งต้องการการรบกวน การสกัด หรือการทำให้กลับเข้าสู่สภาพละลายได้อย่างมีประสิทธิภาพ
- การเปรียบเทียบโปรตีโอมิกส์แบบช็อตกัน ซึ่งความสม่ำเสมอในการทำซ้ำและสภาวะต่าง ๆ เป็นสิ่งสำคัญ
โดยการผสานการสั่นด้วยไมโครเพลตก่อนการย่อย นักวิจัยสามารถปรับปรุงความพร้อมของตัวอย่างสำหรับ:
- การสกัดโปรตีนและการคืนสภาพละลาย
- การย่อยด้วยทริปซิน/ไล-ซี
- การเก็บข้อมูลด้วย Nano-LC/MS/MS
- การวิเคราะห์โปรตีโอมิกส์เชิงปริมาณในขั้นตอนปลายน้ำ
เรียนรู้วิธีการใช้ไมโครเพลทโซนิเคชันช่วยลดความแปรปรวนจากการทำงานด้วยมือ ปรับปรุงการแตกตัวของตัวอย่าง และเตรียมตัวอย่างชีวภาพที่ซับซ้อนสำหรับการวิเคราะห์ LC-MS/MS ที่เชื่อถือได้
การสั่นด้วยคลื่นเสียงในไมโครเพลทสามารถให้ประโยชน์แก่:
- ศูนย์บริการหลักด้านโพรติโอมิกส์
- ห้องปฏิบัติการวิจัยยานยนต์ไฟฟ้า
- ห้องปฏิบัติการภูมิคุ้มกันวิทยาและชีววิทยาเซลล์
- กลุ่มวิจัยเชิงแปล
- ทีมวิทยาศาสตร์ชีวภาพที่กำลังขยายจากขั้นตอนการเตรียมตัวอย่างเดี่ยวไปสู่กระบวนการทำงานที่มีประสิทธิภาพสูงขึ้น
The UIP400MTP is not an ultrasonic bath. It'a a high intensity cup horn for focused sonication. This powerful non-contact sonicator delivers a uniform sonication across all wells of your standard well-plate. You have precise control over amplitude, power, and pulsing. A built-in timer and temperature probe ensures consistent results. The UIP400MTP plate sonicator cools samples with water bath (external chiller optional).
The UIP400MTP is not an ultrasonic bath. It'a a high intensity cup horn for focused sonication. This powerful non-contact sonicator delivers a uniform sonication across all wells of your standard well-plate. You have precise control over amplitude, power, and pulsing. A built-in timer and temperature probe ensures consistent results. The UIP400MTP plate sonicator cools samples with water bath (external chiller optional).
การเตรียมตัวอย่างแบบผ่านปริมาณสูงเพื่อการวิเคราะห์โปรตีโอมของถุงน้ำนอกเซลล์
อะไรคือการวิเคราะห์โปรตีโอมิกส์แบบช็อตกัน?
การวิเคราะห์โปรตีโอมิกส์แบบช็อตกันได้กลายเป็นกลยุทธ์การวิเคราะห์หลักในการอธิบายลักษณะของตัวอย่างทางชีวภาพที่ซับซ้อน ตั้งแต่สารละลายเซลล์ทั้งเซลล์ สารสกัดจากเนื้อเยื่อ ไปจนถึงออร์แกเนลล์ที่บริสุทธิ์ วีซิเคิลนอกเซลล์ และตัวอย่างทางคลินิกที่มีปริมาณน้อย จุดแข็งหลักของมันอยู่ที่การผสานระหว่างการย่อยโปรตีน, การแยกสารด้วยโครมาโทกราฟีของเหลวความละเอียดสูงร่วมกับแมสสเปกโตรเมตรีแบบคู่ขนาน, และการคำนวณเชิงคำนวณจากเปปไทด์ไปสู่โปรตีน อย่างไรก็ตาม คุณภาพของชุดข้อมูลโปรตีโอมสุดท้ายถูกกำหนดไว้ล่วงหน้านานก่อนที่ตัวอย่างจะถึงเครื่องแมสสเปกโตรมิเตอร์ การทำให้ตัวอย่างแตกตัวอย่างมีประสิทธิภาพ การละลายโปรตีน การกำจัดสารรบกวน การย่อยด้วยเอนไซม์ที่สามารถทำซ้ำได้ และการกู้คืนเปปไทด์ที่มั่นคง ล้วนเป็นปัจจัยสำคัญที่ชี้ขาดความครอบคลุมเชิงลึกและความน่าเชื่อถือเชิงปริมาณ
สำหรับนักวิจัยด้านโปรตีโอมิกส์และห้องปฏิบัติการวิทยาศาสตร์ชีวภาพที่ทำงานกับตัวอย่างที่มีจำกัดหรือมีค่าสูง การเตรียมตัวอย่างมักเป็นข้อจำกัดที่สำคัญ
UIP400MTP นี้ช่วยให้มั่นใจได้ถึงการเตรียมตัวอย่างที่เชื่อถือได้และการผสานรวมกับเวิร์กโฟลว์ในห้องปฏิบัติการที่มีอยู่ได้ง่าย
ความท้าทายของถุงเล็กนอกเซลล์ในโปรตีโอมิกส์
ตัวอย่างเช่น อนุภาคเซลล์นอกเซลล์ (Extracellular vesicles หรือ EVs) เป็นตัวอย่างที่ต้องการการจัดการเป็นพิเศษ พวกมันเป็นอนุภาคขนาดเล็กที่มีขนาดนาโนเมตร มีเยื่อหุ้มเซลล์ ประกอบด้วยไขมันเป็นส่วนใหญ่ และมีปริมาณโปรตีนที่สกัดได้ค่อนข้างน้อย นอกจากนี้ยังมีศักยภาพสูงในการนำไขมัน, เกลือ, สารทำความสะอาด, โปรตีนจากซีรัม, และส่วนประกอบของเมทริกซ์อื่น ๆ ติดตัวไปด้วย คุณสมบัติเหล่านี้อาจรบกวนประสิทธิภาพการย่อยอาหาร ประสิทธิภาพการแยกด้วยโครมาโทกราฟี ความเสถียรของอิเล็กโทรสเปรย์ และการระบุเพปไทด์ ดังนั้น ขั้นตอนการเตรียมสำหรับการวิเคราะห์โปรตีนใน EV จึงต้องมีความแข็งแกร่งเพียงพอที่จะทำลายโครงสร้างของถุงและทำให้โปรตีนละลายได้ ในขณะที่ยังคงเข้ากันได้กับการย่อยด้วยเอนไซม์และการวิเคราะห์ LC-MS/MS ในขั้นตอนต่อไป
ในบริบทนี้ การใช้คลื่นเสียงความถี่สูงที่เข้ากันได้กับไมโครเพลทเป็นวิธีการที่ใช้งานได้จริงสำหรับการประมวลผลตัวอย่างแบบขนานที่สามารถทำซ้ำได้ เครื่องโซนิเคเตอร์ไมโครเพลท Hielscher รุ่น UIP400MTP (400 วัตต์) และ UIP550MTP (550 วัตต์) ได้รับการออกแบบมาสำหรับการโซนิเคชันตัวอย่างในเพลทหลายหลุมและภาชนะขนาดเล็ก รองรับการทำงานที่มีประสิทธิภาพสูงกว่าเครื่องโซนิเคเตอร์แบบหัวเดียวทั่วไป สำหรับห้องปฏิบัติการโปรตีโอมิกส์ รูปแบบนี้มีความน่าสนใจเนื่องจากสามารถลดความแปรปรวนจากการทำงานด้วยมือ ปรับปรุงการจัดการตัวอย่างหลายตัวอย่างพร้อมกันได้อย่างมีประสิทธิภาพ และผสานเข้ากับกระบวนการเตรียมตัวอย่างที่ใช้แผ่นเพลทได้อย่างเป็นธรรมชาติมากขึ้น
ตัวอย่างกระบวนการทำงาน
กระบวนการวิเคราะห์โปรตีโอมิกส์ของเวสิเคิลนอกเซลล์ล่าสุดในชีววิทยาของเซลล์ Th17 ที่ขับเคลื่อนโดย PLA2G12A เป็นตัวอย่างที่มีประโยชน์และผ่านการทดสอบในห้องปฏิบัติการว่าเครื่องโซนิเคเตอร์ไมโครเพลท UIP400MTP สามารถนำมาใช้ในกระบวนการเตรียมตัวอย่างแบบช็อตกันโปรตีโอมิกส์ได้อย่างไร ในการศึกษาชุดนั้น ตัวอย่าง EV ได้รับการประมวลผลสำหรับการวิเคราะห์โปรตีโอมโดยใช้การบำบัดด้วยเมทานอล การโซนิคด้วย UIP400MTP การปั่นเหวี่ยง การทำให้แห้ง การย่อยด้วยทริปซิน/Lys-C และการวิเคราะห์ด้วย nano-flow LC-high-resolution tandem MS งานวิจัยทางชีววิทยาเดียวกันนี้ได้รับการรายงานครั้งแรกในรูปแบบบทความก่อนตีพิมพ์ (preprint) บน bioRxiv และต่อมาได้รับการตีพิมพ์ในวารสาร Cell Reports โดยในการศึกษานี้ การวิเคราะห์โปรตีโอมิกส์ช่วยอธิบายลักษณะว่า PLA2G12A มีผลต่อโปรตีนในบรรทุกของ EV อย่างไรในบริบทของการตอบสนองของเซลล์ที (T-cell) ที่ก่อโรค
เครื่องโซนิเคเตอร์แบบ 96 หลุม รุ่น UIP400MTP สำหรับการสกัดโปรตีนแบบปริมาณมาก
โซนิเคเตอร์: เครื่องสะท้อนเสียงไมโครเพลท UIP400MTP
อินพุต: เทียบเท่ากับโปรตีน EV 5 ไมโครกรัม
การย่อยอาหาร: ทริปซิน/ไล-ซี
อ่าน: นาโน-LC-MS/MS / โปรตีโอมิกส์แบบ DIA
คำแนะนำทีละขั้นตอน: การเตรียมตัวอย่างตัวอย่าง EV โดยใช้ UIP400MTP สำหรับการวิเคราะห์โปรตีโอมิกส์แบบช็อตกัน
กระบวนการทำงานนี้อธิบายวิธีการเตรียมตัวอย่างแบบช็อตกันโปรตีโอมิกส์ของถุงน้ำนอกเซลล์ (EV) ที่ใช้ทรัพยากรต่ำ โดยใช้เครื่องโซนิเคเตอร์ไมโครเพลท UIP400MTP มันมีพื้นฐานมาจากกระบวนการโปรตีโอมิกส์ของ EV ที่ได้รับการตีพิมพ์ ซึ่งตัวอย่าง EV ได้รับการปรับให้เป็นมาตรฐาน, ทำให้แห้ง, ทำการบำบัดด้วยเมทานอล, ทำให้เกิดการสั่นสะเทือนด้วยคลื่นเสียง, ทำการย่อยด้วยทริปซิน/Lys-C, ทำให้เป็นกรด, และทำการวิเคราะห์โดย nano-LC-MS/MS.
ขั้นตอนนี้มีไว้สำหรับนักวิจัยด้านโปรตีโอมิกส์และห้องปฏิบัติการวิทยาศาสตร์ชีวภาพที่เตรียม EVs หรือตัวอย่างชีวภาพขนาดเล็กที่มีไขมันสูงสำหรับการวิเคราะห์โปรตีโอมิกส์แบบสแกนนิงจากล่างขึ้นบน
ภาพรวมของกระบวนการทำงาน
| เวที | วัตถุประสงค์ | ผลลัพธ์หลัก |
|---|---|---|
| การเตรียมรถยนต์ไฟฟ้า | แยก, ล้าง, และวัดปริมาณตัวอย่าง EV | ค่า EV ที่ปรับให้เป็นมาตรฐานแล้ว |
| ตัวอย่างการอบแห้ง | นำของเหลวออกก่อนการประมวลผลด้วยตัวทำละลาย | วัสดุ EV แห้ง |
| การบำบัดด้วยเมทานอล | สนับสนุนการขัดขวางการแทรกซึมของวัสดุ EV ที่มีไขมันสูง | ตัวอย่างที่เปียกด้วยเมทานอล |
| UIP400MTP โซนิเคชัน | ส่งเสริมการรบกวน การสกัด และการทำให้เป็นเนื้อเดียวกัน | ตัวอย่าง EV ที่ผ่านการประมวลผล |
| การย่อยอาหาร | สร้างเปปไทด์จากโปรตีนของ EV | การย่อยเปปไทด์ด้วยทริปซิน/ไล-ซี |
| การวิเคราะห์ LC-MS/MS | แยก, ตรวจจับ, และวัดปริมาณเปปไทด์ | ชุดข้อมูลโปรตีโอมิกส์ |
| การวิเคราะห์ข้อมูล | ระบุและวัดปริมาณเปปไทด์และโปรตีน | ผลลัพธ์ระดับโปรตีน |
ขั้นตอนตามลำดับ
| ก้าว | คำแนะนำ | พารามิเตอร์ที่สำคัญ |
|---|---|---|
| 1 | เตรียมตัวอย่าง EV ที่ผ่านการทำให้บริสุทธิ์โดยใช้กระบวนการแยกที่กำหนดไว้ของห้องปฏิบัติการ | นำเซลล์ เศษซาก และสิ่งปนเปื้อนหลักออกก่อนการเตรียมสำหรับการวิเคราะห์โปรตีโอมิกส์ |
| 2 | วัดปริมาณโปรตีนใน EV เช่น โดยวิธี BCA | ปรับค่าตัวอย่างทั้งหมดให้เท่ากันตามปริมาณโปรตีนที่เทียบเท่า |
| 3 | ถ่ายโอนโปรตีน EV เทียบเท่า 5 ไมโครกรัม ลงในหลอด PCR ที่สะอาดหรือหลอดปริมาณต่ำที่เข้ากันได้ | ใช้หลอดที่มีปริมาณสารเคลือบต่ำในกรณีที่มีความกังวลเรื่องการสูญเสียตัวอย่าง |
| 4 | ทำให้ตัวอย่าง EV แห้งสนิท | หลีกเลี่ยงการเกิดความร้อนสูงเกินไป; ตรวจสอบให้แน่ใจว่าไม่มีของเหลวปรากฏให้เห็น |
| 5 | เติมเมทานอล 25 µL ลงในตัวอย่าง EV ที่แห้งแต่ละตัวอย่าง | ตรวจสอบให้แน่ใจว่าวัสดุที่แห้งแล้วเปียกชุ่มทั่วถึง |
| 6 | ทำการโซนิเคชันตัวอย่างเป็นเวลา 3 นาที โดยใช้เครื่องโซนิเคเตอร์แบบไมโครเพลท UIP400MTP | ใช้การตั้งค่าการโซนิคและการจัดวางที่เหมือนกันในทุกตัวอย่าง |
| 7 | ปั่นเหวี่ยงตัวอย่างที่ผ่านการอัลตราซาวด์ที่ 19,000 × g เป็นเวลา 20 นาที ที่อุณหภูมิ 4°C | หลีกเลี่ยงการรบกวนเม็ดหรือวัสดุที่ไม่ละลายหลังจากการปั่นเหวี่ยง |
| 8 | นำส่วนใส 20 µL ออกจากด้านบนอย่างระมัดระวัง | ใช้เทคนิคการดูดและปล่อยของปิเปตอย่างสม่ำเสมอในทุกตัวอย่าง |
| 9 | ทำให้ตัวอย่างที่เหลือแห้งสนิท | ดำเนินการสู่การย่อยโดยตรงหรือเก็บรักษาเฉพาะภายใต้เงื่อนไขที่ได้รับการตรวจสอบแล้วเท่านั้น |
| 10 | เติมสารละลายทริปซิน/Lys-C ที่ความเข้มข้น 100 ng/µL ใน 50 mM แอมโมเนียมไบคาร์บอเนต ปริมาตร 4 µL | เตรียมสารละลายเอนไซม์ให้สดใหม่หรือใช้สารละลายที่เก็บไว้อย่างเหมาะสม |
| 11 | ใช้เครื่องโซนิคเป็นเวลาสั้น ๆ เพื่อละลายวัสดุโปรตีนที่แห้งในสารละลายการย่อย | รวบรวมของเหลวทั้งหมดที่ก้นหลอดหลังจากการโซนิค |
| 12 | ย่อยเป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 37°C โดยเขย่าด้วยความเร็ว 300 รอบต่อนาที | ปิดฝาให้แน่นเพื่อป้องกันการระเหย |
| 13 | เติม 1 µL ของ 1.25% TFA เพื่อทำให้สารย่อยเป็นกรด | การทำให้เป็นกรดหยุดการย่อยอาหารและเตรียมเปปไทด์สำหรับการวิเคราะห์ด้วย LC-MS/MS |
| 14 | ถ่ายโอนสารสกัดไปยังหลอดหรือแผ่นที่เข้ากันได้กับ LC-MS | หลีกเลี่ยงการถ่ายโอนเศษที่ไม่ละลาย |
| 15 | วิเคราะห์โดยใช้เทคนิคนาโน-LC-MS/MS | ใช้ปริมาณการฉีด, ความชันของ LC และตั้งค่าการเก็บข้อมูล MS ให้คงที่ |
| 16 | ประมวลผลข้อมูลดิบโดยใช้ซอฟต์แวร์ DIA, DDA หรือโปรตีโอมิกส์แบบกำหนดเป้าหมายตามความเหมาะสม | ใช้ฐานข้อมูลที่เหมาะสม ความจำเพาะของเอนไซม์ การตั้งค่าการดัดแปลง และเกณฑ์ FDR |
เครื่อง sonicator แผ่นมัลติเวล UIP400MTP
ทำไมต้องใช้ไมโครเพลทโซนิเคชัน?
UIP400MTP ช่วยให้สามารถทำการโซนิคแบบขนานมาตรฐานได้กับตัวอย่างปริมาณน้อย. สิ่งนี้มีประโยชน์เมื่อความซ้ำได้, ปริมาณตัวอย่างน้อย, และปริมาณการทดสอบหลายตัวอย่างมีความสำคัญ.
ใช้ไมโครเพลทมาตรฐานใดก็ได้! การเตรียมตัวอย่างแบบปริมาณมากด้วย UIP400MTP
กระบวนการทำงานด้านโปรตีโอมิกส์ของ EV ที่อ้างอิงใช้ EV ปริมาณเทียบเท่าโปรตีน 5 ไมโครกรัม, เมทานอล 25 ไมโครลิตร, การโซนิคด้วย UIP400MTP เป็นเวลา 3 นาที, การย่อยด้วยทริปซิน/Lys-C, การทำให้เป็นกรดด้วย TFA, และการวิเคราะห์ด้วย nano-LC-MS/MS
ขั้นตอนที่แนะนำสำหรับการวิเคราะห์ LC-MS/MS และการวิเคราะห์ข้อมูล
หลังจากการย่อยและการทำให้เป็นกรด ตัวอย่างสามารถวิเคราะห์ได้โดยใช้ LC แบบเฟสย้อนกลับแบบนาโนโฟลว์ที่เชื่อมต่อกับเครื่องแมสสเปกโตรเมตรีแบบ tandem ความละเอียดสูง ในกระบวนการทำงานที่เผยแพร่แล้ว เปปไทด์จะถูกแยกบนระบบ nano-LC และวิเคราะห์โดยการเก็บข้อมูลแบบไม่ขึ้นกับข้อมูลบนเครื่องแมสสเปกโตรมิเตอร์ Orbitrap
| เวที | คำแนะนำ | วัตถุประสงค์ |
|---|---|---|
| ตัวอย่างการโหลด | ใช้กับดัก C18 หรืออุปกรณ์โหลดเปปไทด์ที่เทียบเท่า | เข้มข้นเปปไทด์และกำจัดสารปนเปื้อนที่มีขั้วสูง |
| การแยกเปปไทด์ | ใช้ LC แบบเฟสย้อนกลับชนิดนาโนโฟลว์ | ปรับปรุงการแยกเปปไทด์และความไวของ MS |
| การได้มาซึ่งสินทรัพย์ถาวร | ใช้ DIA, DDA หรือ MS แบบเฉพาะเจาะจง ขึ้นอยู่กับการออกแบบการศึกษา | สร้างข้อมูลสเปกตรัมในระดับเปปไทด์ |
| การค้นหาฐานข้อมูล | ใช้ฐานข้อมูลอ้างอิงที่เหมาะสมกับสายพันธุ์ | สนับสนุนการระบุเพปไทด์และโปรตีน |
| การควบคุมแบบเอฟดีอาร์ | ใช้เกณฑ์การค้นพบเท็จของเปปไทด์และโปรตีน | ควบคุมความมั่นใจในการระบุ |
| การวัดเชิงปริมาณ | ส่งออกตารางปริมาณเปปไทด์, ปรีคอร์เซอร์, และโปรตีน | ช่วยให้สามารถเปรียบเทียบทางสถิติระหว่างกลุ่มได้ |
รายการตรวจสอบการควบคุมคุณภาพ
- ยืนยันการป้อนข้อมูลโปรตีนเทียบเท่า EV ที่เท่ากันในทุกตัวอย่าง
- ใช้รูปแบบการประมวลผลตัวอย่างแบบสุ่มหรือแบบสมดุล
- รักษามวลของเมทานอล, เวลาการสั่น, เวลาการอบแห้ง, และปริมาณการย่อยให้คงที่
- ติดตามผลผลิตของเปปไทด์และการระบุโปรตีนทั้งหมด
- ตรวจสอบอัตราการตัดไม่สมบูรณ์และกระจายความยาวของเปปไทด์
- ตรวจสอบรูปร่างของยอดโครมาโทกราฟีและความสามารถในการทำซ้ำของเวลาการคงตัว
- รวมช่องว่างเพื่อตรวจสอบยอดคงเหลือ
- ใช้ตัวอย่าง QC ที่รวมกันสำหรับการศึกษาขนาดใหญ่
- ประเมินค่าสัมประสิทธิ์ความแปรปรวนของค่าซ้ำ
- ใช้ PCA หรือวิธีการที่เกี่ยวข้องเพื่อระบุผลกระทบของชุดข้อมูลหรือตัวอย่างที่ผิดปกติ
การบันทึกข้อเสนอแนะ
เมื่อเผยแพร่หรือบันทึกขั้นตอนการทำงานนี้ ให้รายงานปริมาณ EV ที่ป้อน รูปแบบเพลต ปริมาตรเมทานอล แอมพลิจูด และระยะเวลาการอัลตราโซนิกของ UIP400MTP เงื่อนไขการปั่นเหวี่ยง วิธีการอบแห้ง บัฟเฟอร์การย่อย ความเข้มข้นของเอนไซม์ ระยะเวลาการย่อย สภาวะการทำให้เป็นกรด แพลตฟอร์ม LC-MS/MS, โหมดการเก็บข้อมูล, เวอร์ชันซอฟต์แวร์, ฐานข้อมูล, เกณฑ์ FDR, วิธีการปรับให้เป็นมาตรฐาน, และกระบวนการทางสถิติ
เครื่องโซนิเคเตอร์ไมโครเพลทของ Hielscher ทุกรุ่นบันทึกพารามิเตอร์กระบวนการที่สำคัญโดยอัตโนมัติ เช่น แอมพลิจูด ระยะเวลาการโซนิค และอุณหภูมิ พร้อมวันที่และเวลาเป็นไฟล์ CVS ลงใน SD-card ที่ติดตั้งในตัวเครื่อง การบันทึกข้อมูลสำหรับความสม่ำเสมอและการควบคุมคุณภาพไม่เคยง่ายขนาดนี้มาก่อน!
สำหรับการวิเคราะห์โปรตีโอมิกส์ของ DIA ให้ใช้การตั้งค่าการเก็บข้อมูลที่สม่ำเสมอในทุกตัวอย่าง และรวมตัวอย่าง QC ที่ผสมไว้หากเป็นไปได้ ตรวจสอบจำนวนพรีเคอร์เซอร์ ความเสถียรของเวลาการเก็บรักษา และความแปรปรวนของการทำซ้ำ
กระบวนการทำงานนี้เป็นตัวอย่างที่ผ่านการทดสอบในห้องปฏิบัติการสำหรับโปรตีโอมิกส์ของ EV สำหรับตัวอย่างประเภทอื่น ๆ ควรปรับปริมาณตัวอย่างที่ใส่ เงื่อนไขของตัวทำละลาย เวลาในการโซนิค การเตรียมสารละลายสำหรับการย่อย และกลยุทธ์การฉีดเข้า LC-MS/MS ให้เหมาะสมก่อนขยายขนาดไปสู่การศึกษาเต็มรูปแบบ
การศึกษาอย่างละเอียด: โปรตีโอมิกส์แบบ EV Shotgun ในการศึกษา PLA2G12A
การศึกษา PLA2G12A นำเสนอตัวอย่างที่เป็นรูปธรรมของการใช้ UIP400MTP ในกระบวนการทำงานแบบ shotgun proteomics คำถามทางชีววิทยาคือ phospholipase ที่ถูกหลั่งออกมา PLA2G12A ปรับเปลี่ยนถุงหุ้มเซลล์นอกเซลล์ที่มาจากเซลล์ Th17 อย่างไร และส่งผลต่อการเปลี่ยนแปลงของเซลล์ T ที่เป็นอันตรายอย่างไร ผู้เขียนแสดงให้เห็นว่า PLA2G12A ออกฤทธิ์บนเยื่อหุ้ม EV เพื่อผลิตไลโซฟอสโฟลิพิด รวมถึง 1-โอเลออยล์-ไลโซฟอสฟาทิดิลเอทานอลามีน และสัญญาณไลโซฟอสฟาทิดิกแอซิดที่ตามมาผ่าน LPA2 มีส่วนช่วยในการแยกแยะ Th17 นอกเหนือจากการส่งสัญญาณของไขมันแล้ว การศึกษายังได้ตรวจสอบเนื้อหาของ EV รวมถึงปริมาณ RNA และโปรตีน ทำให้การวิเคราะห์โปรตีโอมิกส์แบบช็อตกันเป็นองค์ประกอบสำคัญในกลยุทธ์การจำแนกลักษณะ
ในกระบวนการเตรียม EV เซลล์ Th17 ถูกเพาะเลี้ยงในอาหารเลี้ยงเซลล์ที่มีซีรั่มจากตัวอ่อนวัวที่ผ่านการกำจัดเอ็กโซโซมแล้ว ซุปเปอร์นาแทนต์จากวัฒนธรรมถูกนำไปปั่นเหวี่ยงเพื่อกำจัดเซลล์ จากนั้นกรองผ่านฟิลเตอร์ขนาด 0.22 µm ทำให้เข้มข้นด้วยการกรองอัลตรา/การปั่นเหวี่ยงอัลตรา, ล้าง, ละลายใหม่ใน PBS, และวัดปริมาณโปรตีนด้วยวิธี BCA. การเตรียม EV จากต้นน้ำนี้ทำให้มั่นใจได้ว่าปริมาณวัสดุ EV ที่เทียบเท่ากับโปรตีนที่กำหนดไว้สามารถถูกนำไปใช้ในกระบวนการทำงานของโปรตีโอมิกส์ได้
สำหรับการวิเคราะห์โปรตีโอมิกส์แบบช็อตกัน ผู้เขียนใช้ตัวอย่าง EV ที่เทียบเท่ากับโปรตีน 5 ไมโครกรัม ตัวอย่างเหล่านี้ถูกทำให้แห้งในหลอด PCR และเติมเมทานอล 25 ไมโครลิตร จากนั้นตัวอย่างถูกทำให้สั่นด้วยคลื่นเสียงในเครื่องโซนิคไมโครเพลท UIP400MTP เป็นเวลา 3 นาที หลังจากการโซนิคแล้ว ตัวอย่างถูกนำไปปั่นเหวี่ยงที่ 4°C เป็นเวลา 20 นาที ที่ความเร็ว 19,000 × g หลังจากนำส่วนใสที่ลอยอยู่ด้านบนออก 20 µL แล้ว ตัวอย่างถูกนำไปปั่นเหวี่ยงจนแห้ง โปรตีนถูกทำให้ละลายโดยการสั่นด้วยคลื่นเสียงในสารละลายทริปซิน/Lys-C ปริมาตร 4 µL ที่ความเข้มข้น 100 ng/µL ใน 50 mM แอมโมเนียมไบคาร์บอเนต การย่อยสลายดำเนินการเป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 37°C โดยเขย่าที่ความเร็ว 300 รอบต่อนาที จากนั้นทำการปรับความเป็นกรดของสารย่อยด้วยไตรฟลูออโรอะซิติกแอซิด 1.25% ปริมาตร 1 µL และส่งเข้าสู่การวิเคราะห์ด้วยเทคนิค nano-flow LC-high-resolution tandem mass spectrometry
กระบวนการทำงานนี้เน้นหลักการที่มีประโยชน์หลายประการสำหรับการวิเคราะห์โปรตีนใน EV ด้วยวิธีการที่ใช้ทรัพยากรน้อย ประการแรก ปริมาณตัวอย่างถูกปรับให้เป็นมาตรฐานตามปริมาณโปรตีน ซึ่งมีความสำคัญเมื่อเปรียบเทียบ EV จากจีโนไทป์หรือการรักษาที่แตกต่างกัน ประการที่สอง เมทานอลถูกใช้ก่อนการโซนิค ซึ่งช่วยในการทำลายและสกัดโปรตีนในขณะที่หลีกเลี่ยงการใช้ระบบสารลดแรงตึงผิวที่อาจทำให้การวิเคราะห์ LC-MS/MS ซับซ้อนขึ้น ประการที่สาม ขั้นตอนการโซนิเคชันมีความสั้นและมาตรฐาน ซึ่งสามารถทำงานร่วมกับกระบวนการตัวอย่างแบบขนานได้ ประการที่สี่ การย่อยด้วยทริปซิน/Lys-C ดำเนินการในปริมาณที่น้อยมาก ซึ่งช่วยลดการเจือจางและสนับสนุนการกู้คืนเปปไทด์ในปริมาณต่ำ ประการสุดท้าย การเปลี่ยนจากขั้นตอนการย่อยไปสู่การทำให้เป็นกรดและการวิเคราะห์ด้วย LC-MS/MS โดยตรง ช่วยลดขั้นตอนการจัดการที่ไม่จำเป็น
วิธีการ LC-MS/MS ที่ใช้ในกระบวนการด้านล่างใช้การแยกเฟสย้อนกลับแบบนาโนโฟลว์เชื่อมต่อกับเครื่องแมสสเปกโตรมิเตอร์ Q-Exactive HF Orbitrap ตัวอย่างถูกดักจับบนคอลัมน์พรีคอลัมน์ C18 จากนั้นแยกบนคอลัมน์วิเคราะห์ที่มีเส้นผ่านศูนย์กลางภายใน 50 ไมโครเมตร ที่อัตราการไหล 200 นาโนลิตรต่อนาที และอุณหภูมิ 40 องศาเซลเซียส ความชันของกราเดียนต์เริ่มต้นจากตัวทำละลายอินทรีย์ต่ำไปจนถึงตัวทำละลาย B 35% ภายใน 60 นาที ตามด้วยการล้างด้วยตัวทำละลายอินทรีย์สูงและการปรับสมดุลใหม่ การเก็บข้อมูลด้วยแมสสเปกโตรเมตรี (MS) ดำเนินการในโหมดบวกไอออน โดยใช้การเก็บข้อมูลแบบไม่ขึ้นกับข้อมูล (data-independent acquisition) ร่วมกับการแตกตัวด้วยพลังงานสูง ไฟล์ดิบ DIA ถูกวิเคราะห์โดยใช้ DIA-NN 1.8 พร้อมด้วยห้องสมุดสเปกตรัมที่คาดการณ์ด้วยวิธี in silico
การสกัดโปรตีนแบบปริมาณมาก ด้วยเครื่องสะท้อนเสียงแบบแผ่น 96 หลุม UIP400MTP
คําถามที่พบบ่อย
ใครได้ประโยชน์มากที่สุดจากการใช้ไมโครเพลทโซนิเคชันในงานโปรตีโอมิกส์แบบช็อตกัน?
การสั่นด้วยคลื่นเสียงในไมโครเพลทมีประโยชน์อย่างยิ่งสำหรับห้องปฏิบัติการโปรตีโอมิกส์ที่ประมวลผลตัวอย่างหลายรายการพร้อมกัน รวมถึงศูนย์บริการกลาง กลุ่มวิจัยโปรตีโอมิกส์ ห้องปฏิบัติการภูมิคุ้มกันวิทยา ทีมวิจัยเชิงแปล และห้องปฏิบัติการวิทยาศาสตร์ชีวภาพที่มุ่งสู่กระบวนการทำงานแบบ LC-MS/MS ที่มีประสิทธิภาพสูงขึ้น การสั่นด้วยคลื่นเสียงในไมโครเพลทมีความสำคัญอย่างยิ่งเมื่อความแม่นยำระหว่างตัวอย่างมีความสำคัญอย่างยิ่ง
ทำไมต้องใช้ UIP400MTP แทนเครื่องโซนิเคเตอร์แบบหัวโพรบทั่วไป?
เครื่องโซนิเคเตอร์แบบหัวสัมผัสทั่วไปมักจะประมวลผลตัวอย่างทีละชิ้น และต้องทำความสะอาดอย่างระมัดระวังระหว่างตัวอย่างเพื่อลดการปนเปื้อนข้าม เครื่องโซนิเคเตอร์ไมโครเพลท รุ่น UIP400MTP และ UIP550MTP รองรับการโซนิเคชันแบบขนานในรูปแบบเพลทหรือปริมาณน้อย ช่วยลดการจัดการด้วยมือ เพิ่มความสม่ำเสมอ และปรับปรุงการเตรียมตัวอย่างหลายตัวอย่างให้มีประสิทธิภาพมากขึ้น นอกจากนี้ยังสามารถผสานเข้ากับกระบวนการทำงานอัตโนมัติได้อย่างง่ายดายอีกด้วย
การโซนิเคชันมีบทบาทอย่างไรในกระบวนการทำงานของโปรตีโอมิกส์แบบช็อตกัน?
การโซนิเคชันมักถูกใช้ในขั้นตอนการเตรียมตัวอย่างก่อนการย่อยสลาย สามารถช่วยในการทำลายโครงสร้าง การสกัด การทำให้เป็นเนื้อเดียวกัน และการคืนสภาพก่อนการย่อยด้วยเอนไซม์ทริปซิน, ไลส์-ซี หรือส่วนผสมของทริปซิน/ไลส์-ซี
นอกจากนี้ การสั่นด้วยคลื่นเสียงยังสามารถนำมาใช้ระหว่างการย่อยสลายเพื่อเร่งการย่อยโปรตีนโดยเอนไซม์ได้อย่างมีนัยสำคัญ ค้นพบศักยภาพของการย่อยโปรตีนแบบผ่านปริมาณมากด้วยการใช้โซนิเคชันเพื่อการทำงานของโปรตีโอมิกส์ที่รวดเร็ว!
การสั่นด้วยไมโครเพลทมีประโยชน์สำหรับการวิเคราะห์โปรตีนในเวสิเคิลนอกเซลล์หรือไม่?
ใช่. อนุภาคเซลล์นอกเซลล์เป็นอนุภาคที่มีไขมันสูงและมีเยื่อหุ้มที่สามารถทำให้การประมวลผลซ้ำได้ยาก ในการศึกษา PLA2G12A ที่อ้างอิง ตัวอย่าง EV ได้รับการบำบัดด้วยเมทานอล, โซนิเคชันด้วย UIP400MTP, ทำให้แห้ง, ย่อยด้วยทริปซิน/Lys-C, และวิเคราะห์ด้วย nano-LC/MS/MS.
ตัวอย่างประเภทใดที่สามารถได้รับประโยชน์จากการใช้ไมโครเพลทโซนิเคชัน?
การสั่นด้วยไมโครเพลทสามารถมีประโยชน์สำหรับเซลล์ไลเสต, ส่วนของออร์แกเนลล์, อิมมูโนพรีซิพิเทต, โปรตีนที่รวมตัวกัน, ตัวอย่างที่มีเยื่อหุ้ม, อนุภาคเซลล์นอกเซลล์, และตัวอย่างชีวภาพที่มีปริมาณน้อยอื่น ๆ แต่ละประเภทของตัวอย่างควรได้รับการปรับให้เหมาะสมสำหรับความเข้มและเวลาของการสั่น, สภาพของตัวทำละลาย, ปริมาณที่ใส่เข้าไป, และกลยุทธ์การย่อยสลาย
การสั่นด้วยคลื่นเสียงแทนที่การย่อยด้วยเอนไซม์หรือไม่?
ไม่. การทำโซนิเคชันช่วยเตรียมตัวอย่างสำหรับการย่อยโดยการปรับปรุงการแตกตัว, การสกัด, หรือการละลายใหม่. การย่อยโปรตีนด้วยเอนไซม์โปรตีเอสยังคงจำเป็นเพื่อสร้างเปปไทด์สำหรับการวิเคราะห์โปรตีโอมิกส์แบบล่างขึ้นบน.
อ่านเพิ่มเติมเกี่ยวกับการย่อยโปรตีนที่ส่งเสริมด้วยคลื่นเสียงความถี่สูงในงานโปรตีโอมิกส์!
UIP400MTP สามารถใช้งานร่วมกับโปรตีโอมิกส์แบบอินพุตต่ำได้หรือไม่?
ใช่ รูปแบบไมโครเพลทเหมาะอย่างยิ่งสำหรับกระบวนการทำงานที่มีปริมาณน้อย ซึ่งการเก็บรักษาตัวอย่างและการประมวลผลที่สม่ำเสมอมีความสำคัญ ในกระบวนการทำงาน EV ที่เผยแพร่ การเตรียมโปรตีโอมิกส์ได้ดำเนินการด้วย EV ปริมาณเทียบเท่าโปรตีน 5 ไมโครกรัม
การสั่นด้วยไมโครเพลทสามารถปรับปรุงความน่าเชื่อถือได้หรือไม่?
เครื่องโซนิเคเตอร์ของ Hielscher รองรับการทำซ้ำได้โดยการปรับใช้เงื่อนไขการโซนิคตามมาตรฐานกับตัวอย่างหลายชุด อย่างไรก็ตาม ปัจจัยอื่นๆ เช่น การแยกเซลล์หรือ EV การปรับมาตรฐานอินพุต ประสิทธิภาพการย่อยสลาย ความเสถียรของ LC-MS/MS การประมวลผลข้อมูล และการวิเคราะห์ทางสถิติ ล้วนมีส่วนทำให้เกิดการทำซ้ำได้ของโปรตีโอมิกส์โดยรวมเช่นกัน
การสั่นด้วยคลื่นเสียงในไมโครเพลทช่วยเพิ่มความลึกในการระบุโปรตีนหรือไม่?
อาจช่วยเพิ่มความลึกในการระบุตัวตนเมื่อการรบกวนตัวอย่างหรือการคืนสภาพเป็นปัจจัยจำกัด ผลลัพธ์ขึ้นอยู่กับชนิดของตัวอย่าง เคมีของโปรตีน กลยุทธ์การทำความสะอาด สภาพการย่อยประสิทธิภาพของวิธีการ LC-MS/MS
ควรปรับปรุงอะไรก่อนการใช้งานเวิร์กโฟลว์เป็นประจำ?
พารามิเตอร์หลักประกอบด้วย การป้อนตัวอย่าง, ส่วนประกอบของบัฟเฟอร์หรือตัวทำละลาย, รูปแบบของแผ่น, ความกว้างและระยะเวลาของคลื่นอัลตราโซนิก, สภาพการแห้ง, ปริมาณการย่อย, ความเข้มข้นของเอนไซม์, ระยะเวลาการบ่ม, และปริมาณการฉีดเข้า LC-MS/MS การทดสอบนำร่องแนะนำก่อนนำไปใช้กับชุดทดลองเต็มรูปแบบ
สามารถใช้วิธีการทำงานนี้กับ DIA โปรตีโอมิกส์ได้หรือไม่?
ใช่. กระบวนการทำงานของ EV ที่อ้างถึงใช้การเก็บข้อมูลแบบไม่ขึ้นกับข้อมูล (data-independent acquisition) ตามด้วยการวิเคราะห์ DIA-NN. การสั่นสะเทือนไมโครเพลทเป็นส่วนหนึ่งของกระบวนการเตรียมตัวอย่างต้นน้ำ และสามารถรวมเข้ากับวิธีการโปรตีโอมิกส์แบบ DIA, DDA หรือแบบกำหนดเป้าหมายได้.
ควรติดตามตัวชี้วัดการควบคุมคุณภาพใดบ้าง?
เมตริกคุณภาพที่แนะนำ ได้แก่ ผลผลิตเปปไทด์ จำนวนเปปไทด์และกลุ่มโปรตีนที่ระบุได้ อัตราการตัดไม่สมบูรณ์ การกระจายความยาวของเปปไทด์ รูปทรงของพีคโครมาโทกราฟี ความเสถียรของเวลาการคงอยู่ ค่าสัมประสิทธิ์ความแปรปรวนของซ้ำ การปนเปื้อนข้าม การแยกกลุ่มชีวภาพโดย PCA หรือวิธีที่เกี่ยวข้อง
ข้อดีหลักของการผสานโมเดลไมโครเพลทโซนิเคเตอร์ UIP400MTP หรือ UIP550MTP เข้ากับการเตรียมตัวอย่างโปรตีโอมิกส์คืออะไร?
ข้อได้เปรียบหลักคือการประมวลผลตัวอย่างปริมาณน้อยแบบขนานที่ได้มาตรฐาน ซึ่งช่วยให้ห้องปฏิบัติการลดความแปรปรวนที่เกิดจากมนุษย์และเตรียมตัวอย่างชีวภาพที่ซับซ้อนให้มีความสม่ำเสมอมากขึ้นสำหรับการย่อยสลาย การวิเคราะห์ด้วย LC-MS/MS และการวิเคราะห์โปรตีโอมิกส์เชิงปริมาณ
เครื่องโซนิคเอเตอร์ไมโครเพลทของ Hielscher สามารถผสานเข้ากับกระบวนการทำงานอัตโนมัติได้อย่างไร้รอยต่อ
วรรณกรรม / อ้างอิง
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet UIP550MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- Mochizuki-Ono C., Taketomi Y., Irie A., Kano K. et al. (2026): PLA2G12A-driven extracellular vesicle-lipid signaling amplifies pathogenic T cell responses in inflammatory diseases. Cell Reports 45, 2026.
- Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
- Lischnig A., Bergqvist M., Ochiya T., Lässer C. (2023): Corrigendum for “Quantitative Proteomics Identifies Proteins Enriched in Large and Small Extracellular Vesicles”. Molecular & Cellular Proteomics, 22; 2023.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.
Hielscher Ultrasonics ผลิตโฮโมจีไนเซอร์อัลตราโซนิกประสิทธิภาพสูงจาก ห้องทดลอง ถึง ขนาดอุตสาหกรรม