การใช้คลื่นอัลตราซาวนด์ในไมโครเพลตสำหรับโปรตีโอมิกส์แบบช็อตกัน – บันทึกการประยุกต์ใช้งาน
โปรตีโอมิกส์แบบช็อตกันอาศัยการเตรียมตัวอย่างที่มีประสิทธิภาพและให้ผลซ้ำได้ เพื่อเปลี่ยนวัสดุชีวภาพที่ซับซ้อนให้เป็นเปปไทด์ที่พร้อมสำหรับ LC-MS/MS เครื่องอัลตราซาวนด์สำหรับไมโครเพลต UIP400MTP สนับสนุนกระบวนการนี้ด้วยการใช้คลื่นอัลตราซาวนด์กับตัวอย่างปริมาตรน้อยหลายตัวอย่างพร้อมกันภายใต้สภาวะที่เป็นมาตรฐาน ช่วยให้ห้องปฏิบัติการปรับปรุงการทำให้โครงสร้างแตก การสกัด และการทำให้กลับละลายในขั้นตอนการทำงานที่ใช้ไมโครเพลต บันทึกการประยุกต์ใช้งานนี้อธิบายวิธีผสาน UIP400MTP เข้ากับการเตรียมตัวอย่างสำหรับโปรตีโอมิกส์ โดยใช้ขั้นตอนการทำงานกับเวสิเคิลนอกเซลล์ที่ตีพิมพ์จากการศึกษา PLA2G12A/Th17 เป็นตัวอย่างที่ผ่านการทดสอบในห้องปฏิบัติการ
การใช้คลื่นอัลตราซาวนด์ในไมโครเพลตเพื่อให้โปรตีโอมิกส์แบบช็อตกันให้ผลซ้ำได้มากขึ้น
สำหรับนักวิจัยด้านโปรตีโอมิกส์ การเตรียมตัวอย่างที่ให้ผลซ้ำได้มีความสำคัญอย่างยิ่งต่อข้อมูล LC-MS/MS ที่มีคุณภาพสูง เครื่องอัลตราซาวนด์สำหรับไมโครเพลต UIP400MTP รองรับการใช้คลื่นอัลตราซาวนด์หลายตัวอย่างพร้อมกันภายใต้สภาวะที่เป็นมาตรฐาน ในขั้นตอนการทำงานที่ใช้เพลตและขั้นตอนการทำงานกับตัวอย่างปริมาตรน้อยที่รองรับตัวอย่างจำนวนมาก
เครื่องนี้มีประโยชน์อย่างยิ่งสำหรับห้องปฏิบัติการที่ทำงานกับ:
- ชุดตัวอย่างขนาดใหญ่ที่ต้องการการประมวลผลอย่างสม่ำเสมอในหลุมจำนวนมาก
- วัสดุตั้งต้นที่มีปริมาณจำกัด ซึ่งต้องลดการสูญเสียตัวอย่างและความแปรปรวนให้เหลือน้อยที่สุด
- ตัวอย่างที่มีลิพิดสูง เช่น เวสิเคิลนอกเซลล์
- สิ่งเตรียมทางชีวภาพที่ซับซ้อนซึ่งต้องการการทำให้โครงสร้างแตก การสกัด หรือการทำให้กลับละลายอย่างมีประสิทธิภาพ
- โปรตีโอมิกส์แบบช็อตกันเชิงเปรียบเทียบ ซึ่งจำเป็นต้องให้ผลซ้ำได้ระหว่างสภาวะต่าง ๆ และตัวอย่างซ้ำ
การผสานการใช้คลื่นอัลตราซาวนด์ในไมโครเพลตก่อนการย่อยช่วยให้นักวิจัยเพิ่มความพร้อมของตัวอย่างสำหรับ:
- การสกัดโปรตีนและการทำให้กลับละลาย
- การย่อยด้วย Trypsin/Lys-C
- การเก็บข้อมูลด้วย Nano-LC/MS/MS
- การวิเคราะห์โปรตีโอมิกส์เชิงปริมาณในขั้นตอนถัดไป
เรียนรู้ว่าการใช้คลื่นอัลตราซาวนด์ในไมโครเพลตช่วยลดความแปรปรวนจากการปฏิบัติงานด้วยมือ ปรับปรุงการทำให้โครงสร้างตัวอย่างแตก และเตรียมตัวอย่างชีวภาพที่ซับซ้อนสำหรับการวิเคราะห์ LC-MS/MS ที่เชื่อถือได้อย่างไร
การใช้คลื่นอัลตราซาวนด์ในไมโครเพลตสามารถให้ประโยชน์แก่:
- ศูนย์เครื่องมือกลางด้านโปรตีโอมิกส์
- ห้องปฏิบัติการวิจัย EV
- ห้องปฏิบัติการด้านภูมิคุ้มกันวิทยาและชีววิทยาของเซลล์
- กลุ่มวิจัยเชิงแปลผล
- ทีมวิทยาศาสตร์ชีวภาพที่กำลังขยายจากการเตรียมตัวอย่างทีละตัวอย่างไปสู่ขั้นตอนการทำงานที่รองรับตัวอย่างได้มากขึ้น
การเตรียมตัวอย่างที่รองรับตัวอย่างจำนวนมากสำหรับการวิเคราะห์โปรตีโอมของเวสิเคิลนอกเซลล์
โปรตีโอมิกส์แบบช็อตกันคืออะไร?
โปรตีโอมิกส์แบบช็อตกันได้กลายเป็นกลยุทธ์การวิเคราะห์หลักสำหรับการระบุลักษณะของตัวอย่างชีวภาพที่ซับซ้อน ตั้งแต่สารที่ได้จากการสลายเซลล์ทั้งเซลล์และสารสกัดจากเนื้อเยื่อ ไปจนถึงออร์แกเนลล์ที่ผ่านการทำให้บริสุทธิ์ เวสิเคิลนอกเซลล์ และสิ่งส่งตรวจทางคลินิกที่มีปริมาณตั้งต้นน้อย จุดแข็งหลักอยู่ที่การเชื่อมโยงการย่อยโปรตีน โครมาโทกราฟีของเหลวร่วมกับแทนเดมแมสสเปกโทรเมทรีความละเอียดสูง และการอนุมานโปรตีนจากเปปไทด์ด้วยวิธีเชิงคำนวณ อย่างไรก็ตาม คุณภาพของชุดข้อมูลโปรตีโอมขั้นสุดท้ายถูกกำหนดตั้งแต่ก่อนที่ตัวอย่างจะเข้าสู่เครื่องแมสสเปกโทรมิเตอร์เป็นเวลานาน การทำให้โครงสร้างตัวอย่างแตกอย่างมีประสิทธิภาพ การทำให้โปรตีนละลาย การกำจัดสารรบกวน การย่อยด้วยเอนไซม์ที่ให้ผลซ้ำได้ และการกู้คืนเปปไทด์อย่างมีประสิทธิผลและสม่ำเสมอ ล้วนเป็นปัจจัยชี้ขาดต่อความครอบคลุมเชิงลึกและความน่าเชื่อถือเชิงปริมาณ
สำหรับนักวิจัยด้านโปรตีโอมิกส์และห้องปฏิบัติการวิทยาศาสตร์ชีวภาพที่ทำงานกับตัวอย่างซึ่งมีปริมาณจำกัดหรือมีคุณค่าสูง การเตรียมตัวอย่างมักเป็นคอขวดของกระบวนการ
UIP400MTP ช่วยให้มั่นใจได้ถึงการเตรียมตัวอย่างที่เชื่อถือได้และการผสานเข้ากับขั้นตอนการทำงานที่มีอยู่ในห้องปฏิบัติการได้อย่างง่ายดาย
ความท้าทายของเวสิเคิลนอกเซลล์ในโปรตีโอมิกส์
ตัวอย่างเช่น เวสิเคิลนอกเซลล์ (EVs) เป็นกลุ่มตัวอย่างที่มีความท้าทายเป็นพิเศษ เวสิเคิลเหล่านี้เป็นอนุภาคระดับนาโนที่มีเยื่อหุ้มและมีลิพิดสูง โดยให้ผลได้โปรตีนค่อนข้างต่ำและมีโอกาสสูงที่ลิพิด เกลือ สารซักฟอก โปรตีนในซีรัม และองค์ประกอบอื่น ๆ ของเมทริกซ์จะติดตามมาด้วย ลักษณะเหล่านี้อาจรบกวนประสิทธิภาพการย่อย สมรรถนะของโครมาโทกราฟี เสถียรภาพของอิเล็กโทรสเปรย์ และการระบุชนิดเปปไทด์ ดังนั้น ขั้นตอนการเตรียมตัวอย่างสำหรับโปรตีโอมิกส์ของ EV จึงต้องมีประสิทธิภาพเพียงพอที่จะทำให้โครงสร้างเวสิเคิลแตกและทำให้โปรตีนที่บรรจุอยู่ภายในละลาย ขณะเดียวกันต้องยังคงเข้ากันได้กับการย่อยด้วยเอนไซม์และการวิเคราะห์ LC-MS/MS ในขั้นตอนถัดไป
ในบริบทนี้ การใช้คลื่นอัลตราซาวนด์ที่เข้ากันได้กับไมโครเพลตเป็นแนวทางที่ใช้งานได้จริงสำหรับการประมวลผลตัวอย่างหลายตัวอย่างพร้อมกันและให้ผลซ้ำได้ เครื่องอัลตราซาวนด์สำหรับไมโครเพลตของ Hielscher รุ่น UIP400MTP (400 W) และ UIP550MTP (550 W) ออกแบบมาเพื่อใช้คลื่นอัลตราซาวนด์กับตัวอย่างในเพลตหลายหลุมและภาชนะปริมาตรน้อย โดยรองรับขั้นตอนการทำงานที่ประมวลผลตัวอย่างได้มากกว่าเครื่องอัลตราซาวนด์แบบโพรบเดี่ยวทั่วไป รูปแบบนี้น่าสนใจสำหรับห้องปฏิบัติการด้านโปรตีโอมิกส์ เพราะสามารถลดความแปรปรวนจากการปฏิบัติงานด้วยมือ ปรับปรุงการจัดการตัวอย่างหลายตัวอย่างพร้อมกัน และผสานเข้ากับกระบวนการเตรียมตัวอย่างที่ใช้เพลตได้อย่างเป็นธรรมชาติมากขึ้น
ตัวอย่างขั้นตอนการทำงาน
ขั้นตอนการทำงานด้านโปรตีโอมิกส์ของเวสิเคิลนอกเซลล์ล่าสุดในการศึกษาชีววิทยาของเซลล์ Th17 ที่ขับเคลื่อนโดย PLA2G12A เป็นตัวอย่างที่มีประโยชน์และผ่านการทดสอบในห้องปฏิบัติการ ว่าสามารถนำเครื่องอัลตราซาวนด์สำหรับไมโครเพลต UIP400MTP มาใช้ในการเตรียมตัวอย่างสำหรับโปรตีโอมิกส์แบบช็อตกันได้อย่างไร ในชุดการศึกษาดังกล่าว ตัวอย่าง EV ได้รับการประมวลผลเพื่อวิเคราะห์โปรตีโอมโดยใช้การจัดการด้วยเมทานอล การใช้คลื่นอัลตราซาวนด์ด้วย UIP400MTP การปั่นเหวี่ยง การทำให้แห้ง การย่อยด้วย trypsin/Lys-C และ LC ที่อัตราการไหลระดับนาโนร่วมกับแทนเดม MS ความละเอียดสูง งานวิจัยทางชีววิทยานี้รายงานในปี 2026 โดย Mochizuki-Ono และคณะ โดยการวิเคราะห์โปรตีโอมิกส์ช่วยระบุลักษณะการเปลี่ยนแปลงของโปรตีนที่บรรจุอยู่ใน EV จากการทำงานของ PLA2G12A ในบริบทของการตอบสนองของเซลล์ T ที่ก่อโรค
เครื่องอัลตราซาวนด์สำหรับเพลต 96 หลุม UIP400MTP สำหรับการสกัดโปรตีนที่รองรับตัวอย่างจำนวนมาก
เครื่องอัลตราซาวนด์: เครื่องอัลตราซาวนด์สำหรับไมโครเพลต UIP400MTP
ปริมาณตั้งต้น: EV ที่มีปริมาณเทียบเท่าโปรตีน 5 µg
การย่อย: Trypsin/Lys-C
การอ่านผล: Nano-LC-MS/MS / โปรตีโอมิกส์แบบ DIA
คำแนะนำทีละขั้นตอน: การเตรียมตัวอย่าง EV โดยใช้ UIP400MTP ช่วยสำหรับโปรตีโอมิกส์แบบช็อตกัน
ขั้นตอนการทำงานนี้อธิบายวิธีเตรียมตัวอย่างเวสิเคิลนอกเซลล์ (EV) ที่มีปริมาณตั้งต้นน้อยสำหรับโปรตีโอมิกส์แบบช็อตกัน โดยใช้เครื่องอัลตราซาวนด์สำหรับไมโครเพลต UIP400MTP วิธีนี้อ้างอิงจากขั้นตอนการทำงานด้านโปรตีโอมิกส์ของ EV ที่ตีพิมพ์ ซึ่งมีการปรับตัวอย่าง EV ให้เป็นมาตรฐาน ทำให้แห้ง จัดการด้วยเมทานอล ใช้คลื่นอัลตราซาวนด์ ย่อยด้วย trypsin/Lys-C ปรับให้เป็นกรด และวิเคราะห์ด้วย nano-LC-MS/MS
กระบวนการนี้มีไว้สำหรับนักวิจัยด้านโปรตีโอมิกส์และห้องปฏิบัติการวิทยาศาสตร์ชีวภาพที่เตรียม EV หรือตัวอย่างชีวภาพชนิดอื่นที่มีปริมาตรน้อยและมีลิพิดสูง สำหรับโปรตีโอมิกส์แบบช็อตกันชนิดบอตทอมอัพ
ภาพรวมขั้นตอนการทำงาน
| ขั้นตอน | วัตถุประสงค์ | ผลลัพธ์หลัก |
|---|---|---|
| การเตรียม EV | แยก ล้าง และวัดปริมาณตัวอย่าง EV | EV ตั้งต้นที่ปรับปริมาณให้เป็นมาตรฐานแล้ว |
| การทำให้ตัวอย่างแห้ง | กำจัดของเหลวก่อนการประมวลผลโดยใช้ตัวทำละลายช่วย | วัสดุ EV ที่แห้งแล้ว |
| การจัดการด้วยเมทานอล | ช่วยทำให้โครงสร้างวัสดุ EV ที่มีลิพิดสูงแตก | ตัวอย่างที่เปียกด้วยเมทานอล |
| การใช้คลื่นอัลตราซาวนด์ด้วย UIP400MTP | ส่งเสริมการทำให้โครงสร้างแตก การสกัด และการทำให้เป็นเนื้อเดียวกัน | ตัวอย่าง EV ที่ผ่านการประมวลผลแล้ว |
| การย่อย | สร้างเปปไทด์จากโปรตีนของ EV | สารเปปไทด์ที่ได้จากการย่อยด้วย Trypsin/Lys-C |
| การวิเคราะห์ LC-MS/MS | แยก ตรวจวัด และวัดปริมาณเปปไทด์ | ชุดข้อมูลโปรตีโอมิกส์ |
| การวิเคราะห์ข้อมูล | ระบุชนิดและวัดปริมาณเปปไทด์และโปรตีน | ผลลัพธ์ระดับโปรตีน |
ระเบียบวิธีทีละขั้นตอน
| ขั้นที่ | คำแนะนำ | พารามิเตอร์สำคัญ |
|---|---|---|
| 1 | เตรียมตัวอย่าง EV ที่ผ่านการทำให้บริสุทธิ์ โดยใช้ขั้นตอนการแยกที่ห้องปฏิบัติการกำหนดไว้แล้ว | กำจัดเซลล์ เศษวัสดุ และสารปนเปื้อนหลักก่อนการเตรียมตัวอย่างสำหรับโปรตีโอมิกส์ |
| 2 | วัดปริมาณโปรตีนใน EV ตัวอย่างเช่น โดยการทดสอบ BCA | ปรับตัวอย่างทั้งหมดให้มีปริมาณตั้งต้นเทียบเท่าโปรตีนเท่ากัน |
| 3 | ถ่าย EV ที่มีปริมาณเทียบเท่าโปรตีน 5 µg ลงในหลอด PCR ที่สะอาด หรือหลอดปริมาตรน้อยที่เข้ากันได้ | ใช้หลอดที่มีการจับตัวอย่างกับผิวหลอดต่ำเมื่อมีข้อกังวลเรื่องการสูญเสียตัวอย่าง |
| 4 | ทำให้ตัวอย่าง EV แห้งสนิท | หลีกเลี่ยงความร้อนสูงเกินไป และยืนยันว่าไม่มีของเหลวที่มองเห็นได้เหลืออยู่ |
| 5 | เติมเมทานอล 25 µL ลงในตัวอย่าง EV ที่แห้งแล้วแต่ละตัวอย่าง | ตรวจสอบให้แน่ใจว่าวัสดุที่แห้งแล้วเปียกทั่วทั้งหมด |
| 6 | ใช้คลื่นอัลตราซาวนด์กับตัวอย่างเป็นเวลา 3 นาที โดยใช้เครื่องอัลตราซาวนด์สำหรับไมโครเพลต UIP400MTP | ใช้การตั้งค่าการใช้คลื่นอัลตราซาวนด์และหลักการจัดวางตัวอย่างแบบเดียวกันสำหรับตัวอย่างทั้งหมด |
| 7 | ปั่นเหวี่ยงตัวอย่างที่ผ่านการใช้คลื่นอัลตราซาวนด์ที่ 19,000 × g เป็นเวลา 20 นาที ที่ 4°C | หลีกเลี่ยงการรบกวนตะกอนหรือวัสดุที่ไม่ละลายใด ๆ หลังการปั่นเหวี่ยง |
| 8 | นำของเหลวส่วนใส 20 µL ออกอย่างระมัดระวัง | ใช้เทคนิคการปิเปตที่สม่ำเสมอกับตัวอย่างทั้งหมด |
| 9 | ทำให้วัสดุตัวอย่างที่เหลือแห้งสนิท | ดำเนินการย่อยต่อทันที หรือเก็บรักษาเฉพาะภายใต้สภาวะที่ผ่านการตรวจสอบความใช้ได้แล้วเท่านั้น |
| 10 | เติมสารละลาย trypsin/Lys-C 4 µL ที่ความเข้มข้น 100 ng/µL ในแอมโมเนียมไบคาร์บอเนต 50 mM | เตรียมสารละลายเอนไซม์ใหม่ หรือใช้ส่วนแบ่งสารละลายที่เก็บรักษาอย่างเหมาะสม |
| 11 | ใช้คลื่นอัลตราซาวนด์ช่วงสั้น ๆ เพื่อทำให้วัสดุโปรตีนที่แห้งแล้วละลายในสารละลายสำหรับการย่อย | รวบรวมของเหลวทั้งหมดไว้ที่ก้นหลอดหลังการใช้คลื่นอัลตราซาวนด์ |
| 12 | ย่อยเป็นเวลา 2 ชั่วโมง ที่ 37°C พร้อมเขย่าที่ 300 rpm | ปิดฝาให้แน่นเพื่อป้องกันการระเหย |
| 13 | เติม TFA ความเข้มข้น 1.25% ปริมาตร 1 µL เพื่อปรับสารที่ได้จากการย่อยให้เป็นกรด | การปรับให้เป็นกรดจะหยุดการย่อยและเตรียมเปปไทด์สำหรับ LC-MS/MS |
| 14 | ถ่ายสารที่ได้จากการย่อยลงในขวดตัวอย่างหรือเพลตที่เข้ากันได้กับ LC-MS | หลีกเลี่ยงการถ่ายเศษวัสดุที่ไม่ละลายไปด้วย |
| 15 | วิเคราะห์ด้วย nano-LC-MS/MS | ใช้ปริมาตรฉีดตัวอย่าง โปรแกรมไล่ระดับของ LC และการตั้งค่าการเก็บข้อมูล MS ที่สม่ำเสมอ |
| 16 | ประมวลผลข้อมูลดิบโดยใช้ซอฟต์แวร์โปรตีโอมิกส์แบบ DIA, DDA หรือแบบมุ่งเป้าตามความเหมาะสม | ใช้ฐานข้อมูล ความจำเพาะของเอนไซม์ การตั้งค่าการดัดแปลง และเกณฑ์ FDR ที่เหมาะสม |
(เทียบกับ Mochizuki-Ono et al., 2026)
เครื่องอัลตราซาวนด์สำหรับเพลตหลายหลุม UIP400MTP
เหตุใดจึงใช้คลื่นอัลตราซาวนด์ในไมโครเพลต?
UIP400MTP ช่วยให้สามารถใช้คลื่นอัลตราซาวนด์กับตัวอย่างปริมาตรน้อยหลายตัวอย่างพร้อมกันภายใต้สภาวะที่เป็นมาตรฐาน ซึ่งมีประโยชน์เมื่อความสามารถในการให้ผลซ้ำ ปริมาณตัวอย่างตั้งต้นที่น้อย และความสามารถในการประมวลผลตัวอย่างหลายตัวอย่างเป็นสิ่งสำคัญ
ใช้ไมโครเพลตมาตรฐานชนิดใดก็ได้! การเตรียมตัวอย่างที่รองรับตัวอย่างจำนวนมากด้วย UIP400MTP
ขั้นตอนการทำงานด้านโปรตีโอมิกส์ของ EV ที่อ้างอิงใช้ EV ตั้งต้นที่มีปริมาณเทียบเท่าโปรตีน 5 µg เมทานอล 25 µL การใช้คลื่นอัลตราซาวนด์ด้วย UIP400MTP เป็นเวลา 3 นาที การย่อยด้วย trypsin/Lys-C การปรับให้เป็นกรดด้วย TFA และการวิเคราะห์ nano-LC-MS/MS
ขั้นตอน LC-MS/MS และการวิเคราะห์ข้อมูลที่แนะนำ
หลังการย่อยและการปรับให้เป็นกรด สามารถวิเคราะห์ตัวอย่างโดยใช้ LC แบบเฟสย้อนกลับที่อัตราการไหลระดับนาโน ซึ่งเชื่อมต่อกับแทนเดมแมสสเปกโทรเมทรีความละเอียดสูง ในขั้นตอนการทำงานที่ตีพิมพ์ มีการแยกเปปไทด์ด้วยระบบ nano-LC และวิเคราะห์โดยการเก็บข้อมูลแบบไม่ขึ้นกับข้อมูลบนเครื่องแมสสเปกโทรมิเตอร์ Orbitrap
| ขั้นตอน | ข้อแนะนำ | วัตถุประสงค์ |
|---|---|---|
| การโหลดตัวอย่าง | ใช้คอลัมน์ดักจับ C18 หรือชุดอุปกรณ์โหลดเปปไทด์ที่เทียบเท่า | เพิ่มความเข้มข้นของเปปไทด์และกำจัดสารปนเปื้อนที่มีขั้วสูง |
| การแยกเปปไทด์ | ใช้ LC แบบเฟสย้อนกลับที่อัตราการไหลระดับนาโน | ปรับปรุงการแยกเปปไทด์และความไวของ MS |
| การเก็บข้อมูล MS | ใช้ DIA, DDA หรือ MS แบบมุ่งเป้า ขึ้นอยู่กับการออกแบบการศึกษา | สร้างข้อมูลสเปกตรัมระดับเปปไทด์ |
| การค้นหาฐานข้อมูล | ใช้ฐานข้อมูลอ้างอิงที่เหมาะสมกับสปีชีส์ | สนับสนุนการระบุชนิดเปปไทด์และโปรตีน |
| การควบคุม FDR | ใช้เกณฑ์อัตราการค้นพบผิดสำหรับเปปไทด์และโปรตีน | ควบคุมระดับความเชื่อมั่นในการระบุชนิด |
| การวัดปริมาณ | ส่งออกตารางปริมาณเปปไทด์ ไอออนสารตั้งต้น และโปรตีน | ช่วยให้สามารถเปรียบเทียบทางสถิติระหว่างกลุ่ม |
รายการตรวจสอบการควบคุมคุณภาพ
- ยืนยันว่าตัวอย่างทั้งหมดมีปริมาณ EV ตั้งต้นเทียบเท่าโปรตีนเท่ากัน
- ใช้การจัดวางตัวอย่างสำหรับการประมวลผลแบบสุ่มหรือแบบสมดุล
- รักษาปริมาตรเมทานอล ระยะเวลาการใช้คลื่นอัลตราซาวนด์ ระยะเวลาการทำให้แห้ง และปริมาตรการย่อยให้สม่ำเสมอ
- ติดตามผลได้เปปไทด์และจำนวนโปรตีนทั้งหมดที่ระบุชนิดได้
- ตรวจสอบอัตราการตัดที่ไม่เกิดขึ้น ณ ตำแหน่งที่ควรถูกตัด และการกระจายความยาวเปปไทด์
- ตรวจสอบรูปร่างพีกโครมาโทกราฟีและความสามารถในการให้ผลซ้ำของเวลารีเทนชัน
- รวมตัวอย่างเปล่าไว้เพื่อติดตามการตกค้างข้ามตัวอย่าง
- ใช้ตัวอย่าง QC ที่รวมจากหลายตัวอย่างสำหรับการศึกษาขนาดใหญ่ขึ้น
- ประเมินสัมประสิทธิ์ความแปรปรวนของตัวอย่างซ้ำ
- ใช้ PCA หรือวิธีที่เกี่ยวข้องเพื่อระบุผลจากรุ่นการประมวลผลหรือตัวอย่างที่มีค่าผิดปกติ
ข้อแนะนำในการบันทึกข้อมูลกระบวนการ
เมื่อตีพิมพ์หรือจัดทำเอกสารขั้นตอนการทำงานนี้ ให้รายงานปริมาณ EV ตั้งต้น รูปแบบเพลต ปริมาตรเมทานอล แอมพลิจูดและระยะเวลาการใช้คลื่นอัลตราซาวนด์ของ UIP400MTP สภาวะการปั่นเหวี่ยง วิธีทำให้แห้ง บัฟเฟอร์สำหรับการย่อย ความเข้มข้นของเอนไซม์ ระยะเวลาการย่อย สภาวะการปรับให้เป็นกรด แพลตฟอร์ม LC-MS/MS โหมดการเก็บข้อมูล เวอร์ชันซอฟต์แวร์ ฐานข้อมูล เกณฑ์ FDR วิธีปรับข้อมูลให้เป็นมาตรฐาน และขั้นตอนการวิเคราะห์ทางสถิติ
เครื่องอัลตราซาวนด์สำหรับไมโครเพลตของ Hielscher ทุกเครื่องบันทึกพารามิเตอร์กระบวนการที่สำคัญโดยอัตโนมัติ เช่น แอมพลิจูด ระยะเวลาการใช้คลื่นอัลตราซาวนด์ และอุณหภูมิ พร้อมประทับวันที่และเวลาเป็นไฟล์ CVS บนการ์ด SD ที่ติดตั้งในตัว การบันทึกข้อมูลเพื่อให้ผลซ้ำได้และควบคุมคุณภาพไม่เคยง่ายเท่านี้มาก่อน!
สำหรับโปรตีโอมิกส์แบบ DIA ให้ใช้การตั้งค่าการเก็บข้อมูลที่สม่ำเสมอกับตัวอย่างทั้งหมด และรวมตัวอย่าง QC ที่รวมจากหลายตัวอย่างไว้เมื่อทำได้ ติดตามจำนวนไอออนสารตั้งต้น เสถียรภาพของเวลารีเทนชัน และความแปรปรวนของตัวอย่างซ้ำ
ขั้นตอนการทำงานนี้เป็นตัวอย่างที่ผ่านการทดสอบในห้องปฏิบัติการสำหรับโปรตีโอมิกส์ของ EV สำหรับตัวอย่างชนิดอื่น ให้ปรับปริมาณตั้งต้น สภาวะตัวทำละลาย ระยะเวลาการใช้คลื่นอัลตราซาวนด์ ปริมาตรการย่อย และกลยุทธ์การฉีดตัวอย่างสำหรับ LC-MS/MS ให้เหมาะสมก่อนขยายไปสู่การศึกษาเต็มรูปแบบ
รายละเอียดการศึกษา: โปรตีโอมิกส์แบบช็อตกันของ EV ในการศึกษา PLA2G12A
การศึกษา PLA2G12A เป็นตัวอย่างที่เป็นรูปธรรมของการใช้ UIP400MTP ในขั้นตอนการทำงานโปรตีโอมิกส์แบบช็อตกัน คำถามทางชีววิทยาคือฟอสโฟลิเปส PLA2G12A ที่หลั่งออกมาดัดแปลงเวสิเคิลนอกเซลล์ที่มาจากเซลล์ Th17 อย่างไร และส่งผลต่อการเปลี่ยนแปลงสภาพของเซลล์ T ที่ก่อโรคอย่างไร ผู้เขียนแสดงให้เห็นว่า PLA2G12A ออกฤทธิ์ต่อเยื่อหุ้ม EV เพื่อสร้างไลโซฟอสโฟลิพิด รวมถึง 1-oleoyl-lysophosphatidylethanolamine และการส่งสัญญาณของกรดไลโซฟอสฟาติดิกในขั้นตอนถัดไปผ่าน LPA2 มีส่วนต่อการเปลี่ยนแปลงสภาพเป็น Th17 นอกเหนือจากการส่งสัญญาณของลิพิด การศึกษาเหล่านี้ยังตรวจสอบสารที่บรรจุอยู่ใน EV รวมถึงปริมาณ RNA และโปรตีน ทำให้โปรตีโอมิกส์แบบช็อตกันเป็นองค์ประกอบสำคัญของกลยุทธ์การระบุลักษณะ
ในขั้นตอนการเตรียม EV มีการเพาะเลี้ยงเซลล์ Th17 ในอาหารเลี้ยงเซลล์ที่มีซีรัมจากลูกโคในครรภ์ซึ่งกำจัดเอ็กโซโซมแล้ว ขั้นแรกนำของเหลวส่วนใสจากการเพาะเลี้ยงมาปั่นเหวี่ยงเพื่อกำจัดเซลล์ กรองผ่านตัวกรอง 0.22 µm เพิ่มความเข้มข้นด้วยการกรองแบบอัลตราฟิลเทรชัน/การปั่นเหวี่ยงความเร็วสูงยิ่งยวด ล้าง ทำให้แขวนลอยอีกครั้งใน PBS และวัดปริมาณด้วยการทดสอบโปรตีน BCA การเตรียม EV ในขั้นตอนต้นนี้ช่วยให้มั่นใจว่าสามารถนำวัสดุ EV ที่มีปริมาณเทียบเท่าโปรตีนตามที่กำหนดเข้าสู่ขั้นตอนการทำงานด้านโปรตีโอมิกส์ได้
สำหรับการวิเคราะห์โปรตีโอมิกส์แบบช็อตกัน ผู้เขียนใช้ตัวอย่าง EV ที่มีปริมาณเทียบเท่าโปรตีน 5 µg ตัวอย่างเหล่านี้ถูกทำให้แห้งในหลอด PCR และเติมเมทานอล 25 µL จากนั้นใช้คลื่นอัลตราซาวนด์กับตัวอย่างเป็นเวลา 3 นาที โดยใช้เครื่องอัลตราซาวนด์สำหรับไมโครเพลต UIP400MTP หลังการใช้คลื่นอัลตราซาวนด์ นำตัวอย่างไปปั่นเหวี่ยงที่ 4°C เป็นเวลา 20 นาที ที่ 19,000 × g หลังนำของเหลวส่วนใส 20 µL ออก นำตัวอย่างไปปั่นเหวี่ยงจนแห้ง จากนั้นทำให้โปรตีนละลายด้วยคลื่นอัลตราซาวนด์ในสารละลาย trypsin/Lys-C 4 µL ที่ความเข้มข้น 100 ng/µL ในแอมโมเนียมไบคาร์บอเนต 50 mM ดำเนินการย่อยเป็นเวลา 2 ชั่วโมง ที่ 37°C พร้อมเขย่าที่ 300 rpm ปรับสารที่ได้จากการย่อยให้เป็นกรดด้วยกรดไตรฟลูออโรแอซีติกความเข้มข้น 1.25% ปริมาตร 1 µL และนำไปวิเคราะห์ด้วย LC ที่อัตราการไหลระดับนาโนร่วมกับแทนเดมแมสสเปกโทรเมทรีความละเอียดสูง
ขั้นตอนการทำงานนี้เน้นหลักการที่มีประโยชน์หลายประการสำหรับโปรตีโอมิกส์ของ EV ที่มีปริมาณตั้งต้นน้อย ประการแรก ปริมาณตั้งต้นถูกปรับให้เป็นมาตรฐานตามปริมาณเทียบเท่าโปรตีน ซึ่งสำคัญเมื่อเปรียบเทียบ EV จากจีโนไทป์หรือการจัดการที่แตกต่างกัน ประการที่สอง มีการใช้เมทานอลก่อนการใช้คลื่นอัลตราซาวนด์ เพื่อช่วยทำให้โครงสร้างแตกและสกัด โดยหลีกเลี่ยงระบบสารซักฟอกที่อาจทำให้ LC-MS/MS ซับซ้อนขึ้น ประการที่สาม ขั้นตอนการใช้คลื่นอัลตราซาวนด์ใช้เวลาสั้นและเป็นมาตรฐาน ซึ่งเข้ากันได้กับการประมวลผลตัวอย่างหลายตัวอย่างพร้อมกัน ประการที่สี่ การย่อยด้วย trypsin/Lys-C ดำเนินการในปริมาตรน้อยมาก ช่วยลดการเจือจางและสนับสนุนการกู้คืนเปปไทด์จากตัวอย่างตั้งต้นปริมาณน้อย ประการสุดท้าย การดำเนินการต่อโดยตรงจากการย่อยไปสู่การปรับให้เป็นกรดและ LC-MS/MS ช่วยลดขั้นตอนการจัดการที่ไม่จำเป็นให้เหลือน้อยที่สุด
วิธี LC-MS/MS ในขั้นตอนถัดไปใช้การแยกแบบเฟสย้อนกลับที่อัตราการไหลระดับนาโน เชื่อมต่อกับเครื่องแมสสเปกโทรมิเตอร์ Q-Exactive HF Orbitrap ตัวอย่างถูกดักจับบนพรีคอลัมน์ C18 จากนั้นแยกบนคอลัมน์วิเคราะห์ที่มีเส้นผ่านศูนย์กลางภายใน 50 µm ที่ 200 nL/min และ 40°C โปรแกรมไล่ระดับเริ่มจากสัดส่วนตัวทำละลายอินทรีย์ต่ำไปจนถึงตัวทำละลาย B 35% ในช่วง 60 นาที ตามด้วยการล้างด้วยตัวทำละลายที่มีสัดส่วนสารอินทรีย์สูงและการปรับเข้าสู่สมดุลอีกครั้ง การเก็บข้อมูล MS ดำเนินการในโหมดไอออนบวก โดยใช้การเก็บข้อมูลแบบไม่ขึ้นกับข้อมูลร่วมกับการแตกตัวด้วยการชนที่พลังงานสูงขึ้น ไฟล์ข้อมูลดิบ DIA ถูกวิเคราะห์ด้วย DIA-NN 1.8 โดยใช้คลังสเปกตรัมที่ทำนายด้วยวิธี in silico
การสกัดโปรตีนที่รองรับตัวอย่างจำนวนมาก ด้วยเครื่องอัลตราซาวนด์สำหรับเพลต 96 หลุม UIP400MTP
คำถามที่พบบ่อย
ใครได้รับประโยชน์มากที่สุดจากการใช้คลื่นอัลตราซาวนด์ในไมโครเพลตสำหรับโปรตีโอมิกส์แบบช็อตกัน?
การใช้คลื่นอัลตราซาวนด์ในไมโครเพลตมีประโยชน์อย่างยิ่งสำหรับห้องปฏิบัติการด้านโปรตีโอมิกส์ที่ประมวลผลตัวอย่างหลายตัวอย่างพร้อมกัน รวมถึงศูนย์เครื่องมือกลาง กลุ่มวิจัยโปรตีโอม ห้องปฏิบัติการภูมิคุ้มกันวิทยา ทีมวิจัยเชิงแปลผล และห้องปฏิบัติการวิทยาศาสตร์ชีวภาพที่กำลังเปลี่ยนไปสู่ขั้นตอนการทำงาน LC-MS/MS ที่รองรับตัวอย่างได้มากขึ้น วิธีนี้มีความเกี่ยวข้องเป็นพิเศษเมื่อความสามารถในการให้ผลซ้ำระหว่างตัวอย่างมีความสำคัญอย่างยิ่ง
เหตุใดจึงใช้ UIP400MTP แทนเครื่องอัลตราซาวนด์แบบโพรบทั่วไป?
เครื่องอัลตราซาวนด์แบบโพรบทั่วไปมักประมวลผลตัวอย่างทีละตัวอย่าง และต้องทำความสะอาดอย่างระมัดระวังระหว่างตัวอย่างเพื่อลดการตกค้างข้ามตัวอย่าง เครื่องอัลตราซาวนด์สำหรับไมโครเพลตรุ่น UIP400MTP และ UIP550MTP รองรับการใช้คลื่นอัลตราซาวนด์หลายตัวอย่างพร้อมกันในรูปแบบที่ใช้เพลตหรือปริมาตรน้อย ช่วยลดการจัดการด้วยมือ เพิ่มความสม่ำเสมอ และทำให้การเตรียมตัวอย่างหลายตัวอย่างมีความคล่องตัว เครื่องเหล่านี้ยังสามารถผสานเข้ากับขั้นตอนการทำงานอัตโนมัติได้อย่างง่ายดายด้วย
การใช้คลื่นอัลตราซาวนด์อยู่ในขั้นตอนใดของโปรตีโอมิกส์แบบช็อตกัน?
โดยทั่วไปจะใช้คลื่นอัลตราซาวนด์ในช่วงเตรียมตัวอย่างก่อนการย่อย วิธีนี้สามารถช่วยทำให้โครงสร้างแตก สกัด ทำให้เป็นเนื้อเดียวกัน และทำให้กลับละลาย ก่อนการย่อยด้วยเอนไซม์ trypsin, Lys-C หรือส่วนผสม trypsin/Lys-C
นอกจากนี้ ยังสามารถใช้คลื่นอัลตราซาวนด์ระหว่างการย่อยเพื่อเร่งการย่อยโปรตีนด้วยเอนไซม์ได้อย่างมาก ค้นพบศักยภาพของการย่อยโปรตีนที่รองรับตัวอย่างจำนวนมากโดยใช้คลื่นอัลตราซาวนด์ เพื่อขั้นตอนการทำงานโปรตีโอมิกส์ที่รวดเร็ว!
การใช้คลื่นอัลตราซาวนด์ในไมโครเพลตมีประโยชน์ต่อโปรตีโอมิกส์ของเวสิเคิลนอกเซลล์หรือไม่?
มีประโยชน์ เวสิเคิลนอกเซลล์เป็นอนุภาคที่มีลิพิดสูงและมีเยื่อหุ้ม ซึ่งอาจประมวลผลให้ได้ผลซ้ำอย่างสม่ำเสมอได้ยาก ในการศึกษา PLA2G12A ที่อ้างอิง มีการจัดการตัวอย่าง EV ด้วยเมทานอล ใช้คลื่นอัลตราซาวนด์ด้วย UIP400MTP ทำให้แห้ง ย่อยด้วย trypsin/Lys-C และวิเคราะห์ด้วย nano-LC/MS/MS
ตัวอย่างชนิดใดสามารถได้รับประโยชน์จากการใช้คลื่นอัลตราซาวนด์ในไมโครเพลต?
การใช้คลื่นอัลตราซาวนด์ในไมโครเพลตอาจมีประโยชน์สำหรับสารที่ได้จากการสลายเซลล์ ส่วนแยกออร์แกเนลล์ ตะกอนจากการตกตะกอนด้วยภูมิคุ้มกัน กลุ่มโปรตีนที่รวมตัวกัน ตัวอย่างที่มีเยื่อหุ้มสูง เวสิเคิลนอกเซลล์ และสิ่งเตรียมทางชีวภาพปริมาตรน้อยชนิดอื่น ควรปรับความเข้มและระยะเวลาการใช้คลื่นอัลตราซาวนด์ สภาวะตัวทำละลาย ปริมาณตั้งต้น และกลยุทธ์การย่อยให้เหมาะสมกับตัวอย่างแต่ละชนิด
การใช้คลื่นอัลตราซาวนด์ทดแทนการย่อยด้วยเอนไซม์หรือไม่?
ไม่ทดแทน การใช้คลื่นอัลตราซาวนด์ช่วยเตรียมตัวอย่างสำหรับการย่อย โดยปรับปรุงการทำให้โครงสร้างแตก การสกัด หรือการทำให้กลับละลาย ยังคงจำเป็นต้องย่อยโปรตีนเพื่อสร้างเปปไทด์สำหรับโปรตีโอมิกส์แบบช็อตกันชนิดบอตทอมอัพ
อ่านเพิ่มเติมเกี่ยวกับการย่อยโปรตีนที่ส่งเสริมด้วยคลื่นอัลตราซาวนด์ในขั้นตอนการทำงานด้านโปรตีโอมิกส์!
UIP400MTP เข้ากันได้กับโปรตีโอมิกส์ที่ใช้ตัวอย่างตั้งต้นปริมาณน้อยหรือไม่?
เข้ากันได้ รูปแบบไมโครเพลตเหมาะอย่างยิ่งกับขั้นตอนการทำงานปริมาตรน้อยที่การรักษาตัวอย่างและการประมวลผลอย่างสม่ำเสมอมีความสำคัญ ในขั้นตอนการทำงานกับ EV ที่ตีพิมพ์ มีการเตรียมตัวอย่างสำหรับโปรตีโอมิกส์โดยใช้ EV ตั้งต้นที่มีปริมาณเทียบเท่าโปรตีน 5 µg
การใช้คลื่นอัลตราซาวนด์ในไมโครเพลตสามารถปรับปรุงความสามารถในการให้ผลซ้ำได้หรือไม่?
เครื่องอัลตราซาวนด์ของ Hielscher สนับสนุนความสามารถในการให้ผลซ้ำ โดยใช้สภาวะการใช้คลื่นอัลตราซาวนด์ที่เป็นมาตรฐานกับตัวอย่างหลายตัวอย่าง อย่างไรก็ตาม ปัจจัยอื่น ๆ เช่น การแยกเซลล์หรือ EV การปรับปริมาณตั้งต้นให้เป็นมาตรฐาน ประสิทธิภาพการย่อย เสถียรภาพของ LC-MS/MS การประมวลผลข้อมูล และการวิเคราะห์ทางสถิติ ก็มีส่วนต่อความสามารถในการให้ผลซ้ำของโปรตีโอมิกส์โดยรวมเช่นกัน
การใช้คลื่นอัลตราซาวนด์ในไมโครเพลตช่วยเพิ่มความลึกในการระบุชนิดโปรตีนหรือไม่?
วิธีนี้อาจมีส่วนช่วยเพิ่มความลึกในการระบุชนิด เมื่อการทำให้โครงสร้างตัวอย่างแตกหรือการทำให้กลับละลายเป็นปัจจัยจำกัด ผลที่ได้ขึ้นอยู่กับชนิดตัวอย่าง เคมีของโปรตีน กลยุทธ์การกำจัดสิ่งรบกวน สภาวะการย่อย และสมรรถนะของวิธี LC-MS/MS
ควรปรับสิ่งใดให้เหมาะสมก่อนใช้ขั้นตอนการทำงานนี้เป็นประจำ?
พารามิเตอร์สำคัญ ได้แก่ ปริมาณตัวอย่างตั้งต้น องค์ประกอบของบัฟเฟอร์หรือตัวทำละลาย รูปแบบเพลต แอมพลิจูดและระยะเวลาการใช้คลื่นอัลตราซาวนด์ สภาวะการทำให้แห้ง ปริมาตรการย่อย ความเข้มข้นของเอนไซม์ ระยะเวลาการบ่ม และปริมาณฉีดตัวอย่างสำหรับ LC-MS/MS แนะนำให้ทดสอบนำร่องก่อนนำขั้นตอนการทำงานนี้ไปใช้กับชุดการทดลองทั้งหมด
สามารถใช้ขั้นตอนการทำงานนี้กับโปรตีโอมิกส์แบบ DIA ได้หรือไม่?
ได้ ขั้นตอนการทำงานกับ EV ที่อ้างอิงใช้การเก็บข้อมูลแบบไม่ขึ้นกับข้อมูล ตามด้วยการวิเคราะห์ด้วย DIA-NN การใช้คลื่นอัลตราซาวนด์ในไมโครเพลตเป็นส่วนหนึ่งของกระบวนการเตรียมตัวอย่างในขั้นตอนต้น และสามารถผสานเข้ากับวิธีโปรตีโอมิกส์แบบ DIA, DDA หรือแบบมุ่งเป้าได้
ควรติดตามตัวชี้วัดการควบคุมคุณภาพใดบ้าง?
ตัวชี้วัด QC ที่แนะนำ ได้แก่ ผลได้เปปไทด์ จำนวนเปปไทด์และกลุ่มโปรตีนที่ระบุชนิดได้ อัตราการตัดที่ไม่เกิดขึ้น ณ ตำแหน่งที่ควรถูกตัด การกระจายความยาวเปปไทด์ รูปร่างพีกโครมาโทกราฟี เสถียรภาพของเวลารีเทนชัน สัมประสิทธิ์ความแปรปรวนของตัวอย่างซ้ำ การตกค้างข้ามตัวอย่าง และการแยกกลุ่มทางชีววิทยาด้วย PCA หรือวิธีที่เกี่ยวข้อง
ข้อได้เปรียบหลักของการผสานเครื่องอัลตราซาวนด์สำหรับไมโครเพลตรุ่น UIP400MTP หรือ UIP550MTP เข้ากับการเตรียมตัวอย่างสำหรับโปรตีโอมิกส์คืออะไร?
ข้อได้เปรียบหลักคือการประมวลผลตัวอย่างปริมาตรน้อยหลายตัวอย่างพร้อมกันภายใต้สภาวะที่เป็นมาตรฐาน ซึ่งช่วยให้ห้องปฏิบัติการลดความแปรปรวนจากการปฏิบัติงานด้วยมือ และเตรียมตัวอย่างชีวภาพที่ซับซ้อนอย่างสม่ำเสมอมากขึ้นสำหรับการย่อย การเก็บข้อมูล LC-MS/MS และการวิเคราะห์โปรตีโอมิกส์เชิงปริมาณ
เครื่องอัลตราซาวนด์สำหรับไมโครเพลตของ Hielscher สามารถผสานเข้ากับขั้นตอนการทำงานอัตโนมัติได้อย่างราบรื่น
วรรณกรรม / เอกสารอ้างอิง
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet UIP550MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- Mochizuki-Ono C., Taketomi Y., Irie A., Kano K. et al. (2026): PLA2G12A-driven extracellular vesicle-lipid signaling amplifies pathogenic T cell responses in inflammatory diseases. Cell Reports 45, 2026.
- Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
- Lischnig A., Bergqvist M., Ochiya T., Lässer C. (2023): Corrigendum for “Quantitative Proteomics Identifies Proteins Enriched in Large and Small Extracellular Vesicles”. Molecular & Cellular Proteomics, 22; 2023.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.
Hielscher Ultrasonics ผลิตเครื่องโฮโมจีไนเซอร์อัลตราซาวนด์สมรรถนะสูงตั้งแต่ขนาด ห้องปฏิบัติการ ไปจนถึงขนาด อุตสาหกรรม