Ultrazvočna razgradnja celic v bakterijskih vzorcih
Bakterijski vzorci redko prispejo v obliki prave enocelične suspenzije. Kulture rastejo v verigah in flokih, izolati iz okolja tvorijo agregate, povezane z ekstracelularnimi polimernimi snovmi, centrifugirani peleti pa se pogosto ne dajo ponovno suspendirati kljub temeljitem mešanju z vorteksom. Štetje živih celic, optična gostota, pretočna citometrija in profiliranje mikrobioma vsi temeljijo na predpostavki, da ena delca ustreza eni celici. Ultrazvočna dezagregacija celic reši ta konflikt: kratki, nadzorovani ultrazvočni impulzi ločijo agregate v posamezne celice, ne da bi jih razgradili.
Zakaj agregacija celic vpliva na vaše rezultate
Agregacija je biološka lastnost, ne pa napaka pri pripravi vzorca. Bakterije iz rodov Staphylococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Actinomyces in številne druge vrste iz okolja rastejo v verigah, skupkih ali fragmentih biofilma, pri čemer ekstracelularna DNK in polisaharidi povezujejo celice v pelete in eluate iz brisov. Analitične posledice so sistematične:
- Število kolonij je podcenjeno, saj en grozd tvori eno kolonijo, ne glede na to, koliko celic vsebuje.
- Merilniki optične gostote in števci delcev prikazujejo agregate namesto celic, kar povzroča odstopanje v krivuljah rasti.
- Pri pretočni citometriji in sortiranju celic se združeni dogodki ne upoštevajo in se izključijo iz analize.
- Izolacije DNK in beljakovin zajemajo le celice na površini agregata, kar povzroča pristranskost podatkov o mikrobiomu in omikskih podatkov.
Konvencionalne metode so počasne, nepopolne ali povzročajo kemijske spremembe. Močno pipetiranje in mešanje z vorteksom pustita za seboj mikroagregate. Enzimatska disperzija ali disperzija na osnovi kelatorjev spreminja površino celic, ki jo nameravate analizirati. Mehanska dezagregacija s kontrolirano kavitacijo deluje v nekaj sekundah in ne zahteva nobenih dodatkov.
Ena skupnost je enaka eni koloniji – in en napačen rezultat. Preverite, kako ultrazvočna razgradnja ustvarja prave enocelične suspenzije brez lize, aerosolov ali rokovanja s sondami. Zahtevajte več informacij!
Večcevni sonikator VialTweeter za brezdotično pripravo vzorca: razdrobite celične kepe v zaprtih epruvetah
Kako ultrazvok razdruži celice, ne da bi jih uničil
Ultrazvočna razgradnja celic izkorišča razliko v mehanski trdnosti. Bakterijske agregate držijo skupaj relativno šibke medcelične vezi in ekstracelularna matrica, medtem ko nepoškodovana celična ovojnica prenese bistveno večji strižni napor. Ko kalibrirani ultrazvok vstopi v suspenzijo, akustična kavitacija ustvari mikrotoke, tlačne impulze in strižne sile, ki najprej delujejo na mejnih površinah agregatov. Grude, verige in fragmenti biofilma se razrežejo (deaglomeracija), še preden se doseže raven energije, pri kateri se membrane pretrgajo (liza).
Ultrazvočna razgradnja skupkov bakterijskih celic
Razčlenitev ali liza – Zakaj so parametri ultrazvoka pomembni
Praktična posledica tega je, da sta dezagregacija in liza isti postopek, ki se izvaja z različnimi parametri. Pri zmerni amplitudi, kratkih impulznih ciklih in nadzorovani temperaturi dobite suspenzijo živih posameznih celic. Z povečanjem amplitude, časa izpostavljenosti ali temperature vzorca se proces preusmeri v popolno razgradnjo celic za intracelularne tarče. Hielscherjevi generatorji omogočajo natančno nastavitev amplitude, moči, impulza in vnosa energije ter shranjevanje metode, tako da je korak dezintegracije ponovljiv pri vseh vzorcih, operaterjih in serijah.
Učinkovita brezstična ultrazvočna obdelava
Ultrazvočno čiščenje v kopeli ne more doseči takšnega nadzora. Ultrazvočne čistilne kopeli in posode zagotavljajo le nizko raven ultrazvočne energije, kar povzroča nepopolno pripravo, kavitacija pa poteka neenakomerno, zato se vsaka epruveta obdeluje glede na njen položaj v kopeli. VialTweeter prenaša intenzivne, usmerjene ultrazvočne sile neposredno skozi steno posode v do 10 zaprtih vzorcev hkrati. Obdelave, ki zahtevajo dolgo, spremenljivo izpostavljenost v kopeli, se izvedejo v standardiziranem impulznem vzorcu.
Brezkontaktni ultrazvočni aparati podjetja Hielscher oddajajo intenziven, usmerjen ultrazvok skozi stene zaprtih viale. Naprava VialTweeter obdeluje do 10 viale hkrati z enako intenzivnostjo, brez sonde v vzorcu, brez navzkrižne kontaminacije in brez sproščanja aerosolov. Kadar to zahteva zmogljivost, ultrazvočni aparati za mikroplošče UIP400MTP in UIP550MTP omogočajo enak nadzorovan prenos energije tudi na plošče z več luknjami.
The VialTweeter sočasno sonificira do 10 manjših stekleničk in do 5 večjih epruvet.
Prednosti brezstične ultrazvočne razgradnje
- Brez navzkrižne kontaminacije: Ker so viale ves čas zaprte in v vzorec ni potopljena nobena sonda, se popolnoma preprečita navzkrižna kontaminacija in izguba vzorca. Med posameznimi vzorci ni treba ničesar sterilizirati, en preskus pa ne more vplivati na naslednjega.
- Zaščita pred aerosoli: Ultrazvok z odprto sondo ustvarja nalezljive aerosole in onesnažuje površine instrumentov. Pri ultrazvoku v zaprti epruveti je vzorec zaprt v lastni epruveti, kar je pomembno pri ravnanju s patogenimi bakterijami, kot je Mycobacterium tuberculosis, ter drugimi povzročitelji, za katere veljajo varnostni ravni BSL-2 ali BSL-3.
- Brez izgube napitnine: Titanove sonde lahko med delovanjem v vzorec sprostijo majhno količino mikrodelcev. Ti delci spremenijo optično gostoto in število delcev v nadaljnjem toku. Posredno ultrazvočno obdelovanje skozi steno posode ta vir trdnih snovi v celoti odpravi.
- Enotna prepustnost: Naprava VialTweeter zagotavlja enako intenzivnost ultrazvoka za vsako od največ 10 epruvet, zato so rezultati sonikacije enakomerni in ponovljivi. Učinki položaja, ki so značilni za ultrazvočne kopeli in sondiranje posameznih vzorcev, izginejo, vaše izhodiščne vrednosti pa ostanejo primerljive med ponovitvami.
- Celovitost vzorca: Epruvete ostanejo med celotnim postopkom zaprte, zato vzorec ne more biti onesnažen, pokvarjen ali se izhlapiti. Majhne količine se obdelujejo brez razredčevanja, vključno z dragocenimi kliničnimi peleti, pri katerih si dodatnega koraka prenosa ne moremo privoščiti.
- Nadzor procesa: Amplitudo je mogoče nastaviti v razponu od 20 do 100 %, impulzni način pa v razponu od 0 do 100 %; sistemi podpirajo tudi spremljanje temperature, tako da se toplotno občutljivi sevi in beljakovine ohranijo pod pragom, ki bi jim lahko povzročil poškodbe.
Tipične aplikacije
- Analiza mikrobioma in črevesne vsebine: razpršitev bakterij Lactobacillus, Bifidobacterium in fekalnih vzorcev pred nanosom na gojišče ali sekvenciranjem, da se prepreči zmanjšanje števila bakterij zaradi nastanka grudkov.
- Mikrobiologija hrane in vode: razgradnja flokov v brisih, izpirankah in gojiščih za natančno določanje števila kolonij in življenskih sposobnosti.
- Raziskave biofilmov: pridobivanje celic z nosilcev in površin v obliki suspenzij posameznih celic, brez encimske obdelave, ki bi odstranila površinske proteine.
- Klinična diagnostika: ponovna suspenzija izpljunka, gnoja in eluatov iz brisov v zaprtih pogojih.
- Celična kultura: ločevanje zlepljenih agregatov sesalcev, žuželk in celic CHO pred štetjem in prenosom.
- Priprava celotnega delovnega toka: isti instrument, ki pri nizki amplitudi razčlenjuje vzorce, pri višjih nastavitvah izvede popolno razbitje celic, tako da se liza, ekstrakcija beljakovin in fragmentacija DNK izvedejo brez prenosa v druge epruvete.
Sonikator za plošče z več vdolbinicami UIP400MTP za visoko zmogljivo razbijanje celičnih strdkov
Sonikatorji za mikroplošče modelov UIP400MTP in UIP550MTP niso namenjeni le ploščam z več jamicami, temveč obdelujejo tudi stojala z epruvetami.
Poiščite pravi sonikator za svoj postopek razgradnje
VialTweeter Multi-Tube Sonicator
Najprimernejša metoda za razbijanje sterilnih, zaprtih viale. Napaja ga 200-vatni procesor UP200St s frekvenco 26 kHz in avtomatskim nastavljanjem, VialTweeter posredno prenaša ultrazvok skozi stene do 10 zaprtih viale hkrati, z močjo do 10 W na viale, kar zagotavlja enakomerne in ponovljive rezultate brez navzkrižne kontaminacije in izgube vzorca. Titanova sonotroda VialTweeter je primerna za avtoklaviranje, amplituda in impulz pa sta nastavljiva in shranljiva, kar ustreza obsegu nadzora, ki ga zahteva protokol razbijanja agregatov. Standardna sonotroda z 10 položaji je primerna za viale avtomatskega vzorčevalnika, epruvete za mikrocentrifugo ter epruvete Eppendorf ali Nunc s prostornino od 1 do 5 mL. Priprava za vpenjanje VialPress omogoča obdelavo do 5 večjih posod s premerom do 20 mm.
Na voljo so namenski enocevni modeli VialTweeter za cevi Falcon ter za posamezne viale, prilagojene velikosti posode. Razstavite blok sonotrode in jedrna enota UP200St deluje kot običajni sondni ultrazvočni aparat za neposredno obdelavo majhnih do srednje velikih vzorcev.
Ultrazvočni aparati za mikroplošče
Prehod na pripravo vzorcev z visoko zmogljivostjo z ultrazvočno obdelavo plošč z več luknjami: Pri delovnih postopkih, ki temeljijo na ploščah, ultrazvočni aparati za mikroplošče UIP400MTP in UIP550MTP omogočajo brezstično in enakomerno ultrazvočno obdelavo, ki se razširi z desetih epruvet na celotno ploščo.
400-vatni UIP400MTP je namenjen obdelavi standardnih mikrotitrskih in večluknjastih plošč, vključno z 96-luknjastimi formati, in omogoča natančno krmiljenje amplitude, moči in pulziranja ter vključuje časovnik, temperaturno sondo in hlajenje z vodno kopeljo. Odstranjevanje biofilma in obdelava bakterijskih kultur sta uveljavljeni uporabi ultrazvočnega naprave za mikroplošče UIP400MTP.
Model UIP550MTP z močjo 550 vatov je zmogljivejša izbira – idealen za zahtevnejše uporabe.
Oba brezdotična ultrazvočna sistema zanesljivo obdelujeta plošče s 6, 12, 24, 48, 96 in 384 vdolbinicami ter stojala za epruvete in Petrijeve posodice. Mikroploščni sonikatorji podjetja Hielscher delujejo z vsako standardno ploščo, s čimer se izognete dragim lastniškim potrošnim materialom. Zaradi programirljivih temperaturnih omejitev se sonikacija samodejno ustavi pri najvišji temperaturi vzorca in nadaljuje po ohladitvi, kar ohranja vitalnost celic v ponavljajočih se ciklih. Pametna in zanesljiva priprava vzorcev z visoko zmogljivostjo za ponovljive rezultate.
V spodnji tabeli je prikazan pregled približne zmogljivosti naših laboratorijskih ultrazvočnih naprav za obdelavo vzorcev, ki se uporabljajo v bioloških vedah, genomiki, proteomiki in diagnostiki:
| Priporočene naprave | Obseg serije | Pretok |
|---|---|---|
| VialTweeter Multi-Tube Sonicator | 0vialke s prostornino od 0,5 do 1,5 ml | n.a. |
| Ultrazvočni aparat za plošče z več vdolbinami UIP400MTP (440 vatov) | Plošče z več jamicami / mikrotitri | n.a. |
| Ultrazvočni aparat za plošče z več vdolbinami UIP550MTP (550 vatov) | Plošče z več jamicami / mikrotitri | n.a. |
| Ultrazvočni CupHorn | CupHorn za viale ali čašo | n.a. |
| UP100H 100-vatni ultrazvočni aparat s sondo | 1 do 500 ml | 10 do 200 ml / min |
| UP200Ht, UP200St Modeli ultrazvočnih naprav s sondo z močjo 200 vatov | 10 do 1000 ml | 20 do 200 ml / min |
| UP400St, 400-vatni ultrazvočni aparat s sondo | 10 do 2000 ml | 20 do 400 ml / min |
| GDmini2 | sterilen ultrazvočni reaktor z mikropretokom | n.a. |
| Ultrazvočni stresalnik za sito | n.a. | n.a. |
Pogosta vprašanja o ultrazvočni dezagregaciji celic
Kakšna je razlika med razpadom celic in lizo celic?
Disagregacija, imenovana tudi deaglomeracija, loči zlepljene celice v suspenzijo posameznih celic, pri čemer celice ostanejo nepoškodovane in življenjsko sposobne. Liza pretrga celično ovojnico in sprosti intracelularno vsebino. Oba procesa poganjata kavitacijski strižni sili, razlika pa je v vneseni energiji. Z optimiziranimi nastavitvami amplitude, impulzov in temperature sonikacija doseže dezagregacijo pod pragom lize.
Zakaj ultrazvočne kopeli niso primerne za standardizirano razgradnjo?
Kopeli zagotavljajo le nizko raven ultrazvočne energije, kar vodi do nepopolne obdelave, kavitacija pa se po rezervoarju razvija zelo neenakomerno, tako da je vsak vzorec obdelan drugače, odvisno od njegovega položaja. Mikrobiološke analize in primerjalne študije temeljijo na primerljivosti. Brezkontaktni sonikatorji, kot sta sonikator za več epruvet VialTweeter ter sonikatorja za mikroplošče modelov UIP400MTP in UIP550MTP, obdelujejo vse posode pod prilagojenimi ultrazvočnimi pogoji, kar izboljša ponovljivost med ponovitvami.
Ali lahko ultrazvok poškoduje celice?
Da, če se parametri ne nadzorujejo. Prekomerno ultrazvočno obdelovanje ali nenadzorovano segrevanje lahko poškoduje celice, sproščena DNK pa povzroči, da vzorci postanejo viskozni in spodbuja ponovno agregacijo. Zato je treba postopek razviti premišljeno: zmerna amplituda, impulzni cikli, hlajenje in naprave z omejeno temperaturo zagotavljajo, da obdelava ostane na strani krivulje, ki ustreza dezagregaciji.
Vsi digitalni ultrazvočni aparati podjetja Hielscher omogočajo natančno nadzorovanje parametrov, vgradljive temperaturne senzorje, programirljive nastavitve in avtomatsko beleženje podatkov za zanesljivo pripravo vzorcev.
Ali je treba vzorec prenesti v drugo posodo?
Ne. Vialke in plošče se obdelujejo v njihovih originalnih, zaprtih embalažah. Posredno ultrazvočno obdelovanje preprečuje tako izgube pri prenosu kot tudi prenos snovi, povezan z rokovanjem s sondo.
Katere oblike viale lahko obdeluje naprava VialTweeter?
Standardna sonotroda z 10 položaji je primerna za viale za avtomatski vzorčevalnik, epruvete za mikrocentrifugo ter epruvete Eppendorf ali Nunc s prostornino od 1 do 5 mL. Dodatna oprema VialPress omogoča namestitev do 5 večjih posod s premerom do 20 mm. Na voljo so namenski modeli VialTweeter za eno epruveto, ki so primerni za epruvete Falcon ter za prilagojene formate z eno epruveto ali večjimi formati.
Ali lahko z enim samim instrumentom opravim razčlenitev in lizo?
Da. Ista naprava, ki pri zmerni amplitudi razčlenjuje celice, pri višji amplitudi in daljši izpostavljenosti povzroči popolno razgradnjo celic, tako da se lahko suspenzija posameznih celic in nadaljnja ekstrakcija izvajata zaporedoma brez menjave platform.
Ali se pri testih MBEC uporablja ultrazvok?
Ultrazvok je uveljavljen in v veliki meri standarden del postopka. V testu MBEC s pokrovčki na palicah se po rasti biofilmov na polistirenskih palicah in izpostavitvi antibiotiku palice prenesejo v svež gojišče ter se jim izvede mešanje z vrtinčnikom in sonikacija, da se odlepi in razkroji prilepljene celice biofilma v planktonsko suspenzijo pred serijskim redčenjem in štetjem živih celic (MBEC se odčita kot najnižja koncentracija, ki zmanjša število izoliranih celic za ≥3 log10 v primerjavi z neobdelanim biofilmom). Ultrazvok znatno izboljša kakovost disperzije: nepopolno sproščanje vgrajenih celic iz matriksa EPS podcenjuje izkoreninjenje in precenjuje vrednosti MBEC. Ciljno sonikacijo jamic z nosilci palic po celotnih testnih ploščah z mikroploščnim sonikatorjem UIP400MTP premaga tradicionalne slabosti sonikacije v kopeli – in sicer neenakomerna porazdelitev energije, pregrevanje ter tveganje za nastanek aerosolov in navzkrižno onesnaženje.
Preberite, kako brezkontaktni ultrazvočni aparat za mikroplošče UIP400MTP olajša izvajanje MBEC-testov!
Ali se pri določanju minimalne zaviralne koncentracije (MIC) uporablja ultrazvok?
Ultrazvok se uporablja v različnih delovnih postopkih, povezanih z MIC, za izboljšanje učinkovitosti in ponovljivosti:
- mikobakteriologija, kjer se sputum in drugi viskozni vzorci pred testiranjem občutljivosti rutinsko dekontaminirajo in homogenizirajo, včasih z ultrazvokom, pri čemer je za natančno določitev minimalne inhibicijske koncentracije (MIC) koristno, da se inokuli mikobakterij, ki tvorijo strdke, na kratko dispergirajo;
- organizmi, pri katerih se pogosto tvorijo agregati (npr. streptokoki, stafilokoki v peletih), pri katerih mikroagregati izkrivljajo gostoto inokula; in
- kombinirana diagnostika, kot je ultrazvočna analiza implantata in kultiviranje tekočine, ki ji sledi testiranje občutljivosti pri okužbi protetičnega sklepa (uporaba po vzoru metode MBEC, ne klasične metode MIC).
Odkrijte uporabo ultrazvoka pri določanju minimalne inhibicijske koncentracije (MIC)!
Literatura / Reference
- FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
- FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet UIP550MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- Bahnan W, Happonen L, Khakzad H, Kumra Ahnlide V, de Neergaard T, Wrighton S, André O, Bratanis E, Tang D, Hellmark T, Björck L, Shannon O, Malmström L, Malmström J, Nordenfelt P. (2023): A human monoclonal antibody bivalently binding two different epitopes in streptococcal M protein mediates immune function. EMBO Mol Med. 2023 Feb 8;15(2):e16208.
- Wrighton S., Ahnlide V.K., André O., Bahnan W., Nordenfelt P. (2023): Group A streptococci induce stronger M protein-fibronectin interaction when specific human antibodies are bound. Frontiers in Microbiology 14:1069789.
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
Izberi si svoj krožnik! Ultrazvočni aparat za mikroplošče UIP550MTP razčleni bakterijske vzorce v kateri koli standardni plošči z več luknjami.
Modeli sonikatorjev Hielscher Multi-Sample Sonicator UIP400MTP za mikroplošče, VialTweeter in Cuphorn: hitra in zmogljiva priprava vzorcev