Ultrazvočna dezagregacija celic v bakterijskih vzorcih
Bakterijski vzorci redko prispejo kot prave suspenzije posameznih celic. Kulture rastejo v verigah in kosmih, okoljski izolati tvorijo agregate, povezane z zunajceličnimi polimernimi snovmi, centrifugirani peleti pa se pogosto kljub temeljitemu vrtinčenju težko resuspendirajo. Določanje števila živih celic, optične gostote, pretočna citometrija in profiliranje mikrobioma predpostavljajo, da en delec ustreza eni celici. Ultrazvočna dezagregacija celic odpravi to neskladje: kratki, nadzorovani sunki sonikacije ločijo agregate na posamezne celice, ne da bi jih lizirali.
Zakaj agregacija celic ogroža vaše rezultate
Agregacija je biološka značilnost, ne napaka pri pripravi. Staphylococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Actinomyces in številne okoljske vrste rastejo v verigah, skupkih ali fragmentih biofilma, zunajcelična DNA in polisaharidi pa zlepljajo celice v peletih in eluatih brisov. Analitične posledice so sistematične:
- Število kolonij je podcenjeno, ker en skupek tvori eno kolonijo ne glede na to, koliko celic vsebuje.
- Meritve optične gostote in števci delcev zaznavajo agregate namesto celic, kar izkrivlja rastne krivulje.
- Pretočna citometrija in razvrščanje celic napačno štejeta dogodke, ki ustrezajo skupkom celic, in jih izključujeta iz analize.
- Ekstrakcije DNA in beljakovin zajemajo le celice na površini agregata, kar izkrivlja podatke o mikrobiomu in podatke omik.
Običajni ukrepi so počasni, nepopolni ali povzročajo kemijske spremembe. Intenzivno pipetiranje in vrtinčenje ne odstranita mikroagregatov. Dispergiranje z encimi ali kelatorji spremeni celično površino, ki jo morda nameravate analizirati. Mehanska dezagregacija z nadzorovano kavitacijo učinkuje v nekaj sekundah in ne zahteva dodatkov.
En agregat pomeni eno kolonijo – in en napačen rezultat. Oglejte si, kako ultrazvočna dezagregacija ustvari prave suspenzije posameznih celic brez lize, aerosolov ali rokovanja s sondo. Zaprosite za več informacij!
Sonikator za več epruvet VialTweeter za brezkontaktno pripravo vzorcev: razdružite skupke celic v zaprtih epruvetah
Kako sonikacija razdruži celice, ne da bi jih lizirala
Ultrazvočna dezagregacija celic izkorišča razliko v mehanski trdnosti. Bakterijske agregate povezujejo razmeroma šibke medcelične vezi in zunajcelični matriks, nepoškodovana celična ovojnica pa prenese bistveno večji strig. Ko umerjeni ultrazvok vstopi v suspenzijo, akustična kavitacija ustvarja mikrostrujanje, tlačne pulze in strižne sile, ki najprej delujejo na mejnih površinah agregatov. Skupki, verige in fragmenti biofilma se zaradi striga razdružijo (deaglomeracija), preden je dosežena raven energije, pri kateri membrane počijo (liza).
Ultrazvočna dezagregacija skupkov bakterijskih celic
Dezagregacija ali liza – pomen parametrov sonikacije
V praksi to pomeni, da se dezagregacija in liza izvajata z isto napravo pri različnih parametrih delovanja. Pri zmerni amplitudi, kratkih pulznih ciklih in nadzorovani temperaturi dobite suspenzijo posameznih živih celic. Povečanje amplitude, časa izpostavljenosti ali temperature vzorca usmeri proces k popolni razgradnji celic za pridobivanje znotrajceličnih ciljnih sestavin. Generatorji Hielscher omogočajo natančno nastavitev amplitude, moči, pulzov in vnosa energije ter shranjevanje metode, zato je korak dezagregacije ponovljiv med vzorci, izvajalci in posameznimi obdelavami.
Učinkovita brezkontaktna sonikacija
Sonikacija v kopeli ne more zagotoviti takšnega nadzora. Ultrazvočne čistilne kopeli in rezervoarji zagotavljajo le nizko ultrazvočno energijo, kar povzroča nepopolno pripravo, kavitacija pa nastaja neenakomerno, zato je obdelava vsake epruvete odvisna od njenega položaja v kopeli. VialTweeter prenaša intenzivne, usmerjene ultrazvočne sile neposredno skozi steno posode v do 10 zaprtih vzorcev hkrati. Obdelave, ki v kopeli zahtevajo dolgo in spremenljivo izpostavljenost, se zaključijo s standardiziranim vzorcem pulzov.
Brezkontaktni sonikatorji Hielscher dovajajo intenziven, usmerjen ultrazvok skozi stene zaprtih vial. VialTweeter obdeluje do 10 vial hkrati z enako intenzivnostjo, brez sonde v vzorcu, brez navzkrižne kontaminacije in brez sproščanja aerosolov. Kadar to zahteva zmogljivost obdelave vzorcev, sonikatorja za mikroplošče UIP400MTP in UIP550MTP razširita enak nadzorovani prenos energije na plošče z več vdolbinicami.
VialTweeter hkrati sonikira do 10 manjših vial in do 5 večjih epruvet.
Prednosti brezkontaktne ultrazvočne dezagregacije
- Brez navzkrižne kontaminacije: Ker so viale ves čas zaprte in v vzorec ni potopljena nobena sonda, sta navzkrižna kontaminacija in izguba vzorca popolnoma preprečeni. Med vzorci ni treba ničesar sterilizirati, posamezna obdelava pa ne more vplivati na naslednjo.
- Zaščita pred aerosoli: Sonikacija s sondo v odprti posodi ustvarja kužne aerosole in kontaminira površine naprave. Sonikacija v zaprtih vialah zadrži vzorec v njegovi epruveti, kar je pomembno pri ravnanju s patogenimi bakterijami, kot je Mycobacterium tuberculosis, in drugimi biološkimi agensi ravni BSL-2 ali BSL-3.
- Brez erozije konice: Titanove sonde lahko med delovanjem v vzorec sproščajo majhno količino mikrodelcev. Ti delci vplivajo na optično gostoto in število delcev pri nadaljnjih meritvah. Posredna sonikacija skozi steno posode ta vir trdnih delcev v celoti odpravi.
- Enakomerna zmogljivost obdelave vzorcev: VialTweeter dovaja enako intenzivnost ultrazvoka v vsako od do 10 vial, zato so rezultati sonikacije enakomerni in ponovljivi. Vplivi položaja, ki otežujejo obdelavo v kopelih in obdelavo posameznih vzorcev s sondo, izginejo, izhodiščne vrednosti pa ostanejo primerljive med ponovitvami.
- Celovitost vzorca: epruvete ostanejo zaprte med celotno obdelavo, zato se vzorec ne more kontaminirati, pokvariti ali izhlapeti. Majhne volumne je mogoče obdelati brez redčenja, tudi dragocene klinične pelete, pri katerih dodaten korak prenosa ni dopusten.
- Nadzor procesa: Amplituda je nastavljiva od 20 do 100%, pulzni način od 0 do 100%, sistemi pa podpirajo spremljanje temperature, zato toplotno občutljivi sevi in beljakovine ostanejo pod pragovi, pri katerih nastanejo poškodbe.
Tipične uporabe
- Analiza mikrobioma in črevesne vsebine: dispergiranje bakterij Lactobacillus in Bifidobacterium ter fekalnih vzorcev pred nacepljanjem na plošče ali sekvenciranjem, da skupki ne zmanjšajo izmerjenega števila celic.
- Mikrobiologija živil in vode: dezagregacija kosmov v brisih, izpirkih in obogatitvenih bujonih za natančno določanje števila kolonij in viabilnosti.
- Raziskave biofilmov: pridobivanje celic z nosilcev in površin v obliki suspenzij posameznih celic, brez encimske obdelave, ki bi odstranila površinske beljakovine.
- Klinična diagnostika: resuspendiranje sputuma, gnoja in eluatov brisov v pogojih zadrževanja biološkega materiala.
- Celične kulture: ločevanje skupkov celic sesalcev, žuželk in CHO pred štetjem in pasažiranjem.
- Priprava skozi celoten delovni postopek: ista naprava, ki pri nizki amplitudi izvaja dezagregacijo, pri višjih nastavitvah izvede popolno razgradnjo celic, zato liza, ekstrakcija beljakovin in fragmentacija DNA sledijo brez prenašanja med epruvetami.
Sonikator za plošče z več vdolbinicami UIP400MTP za deaglomeracijo skupkov celic z veliko zmogljivostjo obdelave vzorcev
Sonikatorja za mikroplošče UIP400MTP in UIP550MTP poleg plošč z več vdolbinicami obdelujeta tudi stojala z epruvetami.
Poiščite pravi sonikator za svoj postopek dezagregacije
Sonikator za več epruvet VialTweeter
Metoda izbora za sterilno dezagregacijo v zaprtih vialah. VialTweeter, ki ga poganja 200-vatni procesor UP200St pri 26 kHz s samodejnim uglaševanjem, posredno prenaša ultrazvok skozi stene do 10 zaprtih vial hkrati, z do 10 W na epruveto, za enakomerne in ponovljive rezultate brez navzkrižne kontaminacije in izgube vzorca. Titanovo sonotrodo VialTweeter je mogoče avtoklavirati, nastavitve amplitude in pulzov pa je mogoče prilagajati in shranjevati, kar zagotavlja razpon nadzora, ki ga potrebuje protokol deaglomeracije. Standardna sonotroda z 10 mesti sprejme viale za samodejne vzorčevalnike, mikrocentrifugirne epruvete ter epruvete Eppendorf ali Nunc s prostornino od 1 do 5 mL. Vpenjalna naprava VialPress omogoča obdelavo do 5 večjih posod s premerom do 20 mm.
Namenski modeli VialTweeter za eno epruveto so na voljo za epruvete Falcon in za posamezne viale, pri čemer so prilagojeni velikosti posode. Odstranite blokovno sonotrodo in osnovna enota UP200St deluje kot običajen sonikator s sondo za neposredno obdelavo majhnih do srednje velikih vzorcev.
Sonikatorji za mikroplošče
Povečanje obsega priprave vzorcev do velike zmogljivosti obdelave s sonikacijo plošč z več vdolbinicami: pri postopkih s ploščami sonikatorja za mikroplošče UIP400MTP in UIP550MTP razširita brezkontaktno, enakomerno sonikacijo z desetih epruvet na celotno ploščo.
400-vatni UIP400MTP obdeluje standardne mikrotitrske plošče in plošče z več vdolbinicami, vključno s formati s 96 vdolbinicami, z natančnim nadzorom amplitude, moči in pulzov ter s časovnikom, temperaturno sondo in hlajenjem z vodno kopeljo. Odstranjevanje biofilmov in obdelava bakterijskih kultur sta uveljavljeni uporabi sonikatorja za mikroplošče UIP400MTP.
550-vatni UIP550MTP je zmogljivejša možnost – idealna za zahtevnejše uporabe.
Oba sistema za brezkontaktno sonikacijo zanesljivo obdelujeta plošče s 6, 12, 24, 48, 96 in 384 vdolbinicami ter stojala z epruvetami in petrijevke. Sonikatorji za mikroplošče Hielscher delujejo s katero koli standardno ploščo, s čimer se izognete dragemu potrošnemu materialu, vezanemu na posameznega proizvajalca. S programirljivimi temperaturnimi omejitvami se sonikacija pri najvišji temperaturi vzorca samodejno začasno ustavi in po ohladitvi nadaljuje, kar ohranja viabilnost v ponavljajočih se ciklih. Pametna in zanesljiva priprava vzorcev z veliko zmogljivostjo obdelave za ponovljive rezultate.
Spodnja tabela podaja pregled približne zmogljivosti obdelave naših sonikatorjev za laboratorijske vzorce, ki se uporabljajo v vedah o življenju, genomiki, proteomiki in diagnostiki:
| Priporočene naprave | Prostornina šarže | Pretok |
|---|---|---|
| Sonikator za več epruvet VialTweeter | viale od 0,5 do 1,5mL | n.a. |
| Sonikator za plošče z več vdolbinicami UIP400MTP (440 vatov) | plošče z več vdolbinicami / mikrotitrske plošče | n.a. |
| Sonikator za plošče z več vdolbinicami UIP550MTP (550 vatov) | plošče z več vdolbinicami / mikrotitrske plošče | n.a. |
| Ultrazvočni CupHorn | CupHorn za viale ali čašo | n.a. |
| Sonikator s sondo UP100H z močjo 100 vatov | 1 do 500mL | 10 do 200mL/min |
| UP200Ht, UP200St modela sonikatorjev s sondo z močjo 200 vatov | 10 do 1000mL | 20 do 200mL/min |
| Sonikator s sondo UP400St z močjo 400 vatov | 10 do 2000mL | 20 do 400mL/min |
| GDmini2 | sterilni ultrazvočni mikropretočni reaktor | n.a. |
| Ultrazvočni stresalnik sit | n.a. | n.a. |
Pogosta vprašanja o ultrazvočni dezagregaciji celic
Kakšna je razlika med dezagregacijo celic in lizo celic?
Dezagregacija, imenovana tudi deaglomeracija, loči celice v skupkih v suspenzijo posameznih celic, pri čemer celice ostanejo nepoškodovane in žive. Liza pretrga celično ovojnico in sprosti znotrajcelično vsebino. Oba procesa poganja strig zaradi kavitacije, razlika pa je v vnosu energije. Z optimiziranimi nastavitvami amplitude, pulzov in temperature sonikacija doseže dezagregacijo pod pragom lize.
Zakaj ultrazvočne kopeli niso primerne za standardizirano dezagregacijo?
Kopeli zagotavljajo le nizko ultrazvočno energijo, kar vodi do nepopolne priprave, kavitacija pa se po rezervoarju razvija zelo neenakomerno, zato je vsak vzorec deležen drugačne obdelave glede na svoj položaj. Določanje mikrobiološkega števila in primerjalne študije so odvisni od primerljivosti. Brezkontaktni sonikatorji, kot so sonikator za več epruvet VialTweeter ter sonikatorja za mikroplošče UIP400MTP in UIP550MTP, obdelujejo vse posode pri prilagojenih ultrazvočnih pogojih, kar izboljšuje ponovljivost med ponovitvami.
Ali lahko sonikacija poškoduje celice?
Da, če parametri niso nadzorovani. Prekomerna sonikacija ali nenadzorovano segrevanje lahko poškodujeta celice, sproščena DNA pa povzroči viskoznost vzorcev in spodbuja ponovno agregacijo. Zato je treba proces razviti premišljeno: zmerna amplituda, pulzni cikli, hlajenje in naprave s temperaturnimi omejitvami ohranjajo obdelavo na območju dezagregacije na krivulji.
Vsi digitalni sonikatorji Hielscher ponujajo natančno nastavljive parametre, priključljive temperaturne senzorje, programirljive nastavitve in samodejno beleženje podatkov za zanesljivo pripravo vzorcev.
Ali je treba vzorec prenesti v drugo posodo?
Ne. Viale in plošče se obdelujejo v svojih prvotnih, zaprtih posodah. Posredna sonikacija preprečuje tako izgube pri prenosu kot prenos ostankov med vzorci, povezan z rokovanjem s sondo.
Katere formate vial lahko obdeluje VialTweeter?
Standardna sonotroda z 10 mesti sprejme viale za samodejne vzorčevalnike, mikrocentrifugirne epruvete ter epruvete Eppendorf ali Nunc s prostornino od 1 do 5 mL. Dodatek VialPress sprejme do 5 večjih posod s premerom do 20 mm. Namenski modeli VialTweeter za eno epruveto so na voljo za epruvete Falcon ter za prilagojene formate posameznih vial ali večje formate.
Ali lahko z eno napravo izvajam dezagregacijo in lizo?
Da. Ista konfiguracija, ki pri zmerni amplitudi izvaja dezagregacijo, pri višji amplitudi in daljši izpostavljenosti izvede popolno razgradnjo celic, zato lahko priprava suspenzije posameznih celic in nadaljnja ekstrakcija potekata zaporedoma brez menjave platforme.
Ali se sonikacija uporablja pri testih MBEC?
Sonikacija je uveljavljen in večinoma standarden sestavni del postopka. Pri testu MBEC s pokrovom s čepki se po gojenju biofilmov na polistirenskih čepkih in njihovi izpostavitvi antibiotiku čepki prenesejo v svež medij ter obdelajo z vrtinčenjem in sonikacijo, da se pritrjene celice biofilma odstranijo in dezagregirajo v planktonsko suspenzijo pred serijskim redčenjem in določanjem števila živih celic (MBEC se odčita kot najnižja koncentracija, ki zmanjša število pridobljenih živih celic za ≥3 log10 glede na neobdelani biofilm). Sonikacija bistveno izboljša kakovost dispergiranja: nepopolno sproščanje celic, vgrajenih v matriks EPS, povzroča podcenjevanje eradikacije in zvišuje vrednosti MBEC. Ciljna sonikacija vdolbinic, ki sprejmejo čepke, po testnih ploščah s sonikatorjem za mikroplošče UIP400MTP odpravi tradicionalne slabosti sonikacije v kopeli – in sicer neenakomerno porazdelitev energije, segrevanje ter tveganje za aerosole in navzkrižno kontaminacijo.
Spoznajte, kako brezkontaktni sonikator za mikroplošče UIP400MTP olajša teste MBEC!
Ali se sonikacija uporablja pri testih MIC?
Sonikacija se uporablja v različnih postopkih, povezanih s testi MIC, za izboljšanje učinkovitosti in ponovljivosti:
- mikobakteriologija, kjer se sputum in drugi viskozni vzorci pred testiranjem občutljivosti rutinsko dekontaminirajo in homogenizirajo, včasih s sonikacijo, kratko dispergiranje mikobakterijskih inokulumov, ki tvorijo skupke, pa omogoča natančno določanje MIC;
- organizmi, nagnjeni k agregaciji (npr. streptokoki in stafilokoki v peletih), pri katerih mikroagregati izkrivljajo gostoto inokuluma; in
- kombinirana diagnostika, kot je gojenje iz tekočine po sonikaciji vsadka, ki mu sledi testiranje občutljivosti pri okužbi umetnega sklepa (uporaba, podobna MBEC, ne klasična uporaba MIC).
Literatura / Viri
- FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
- FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet UIP550MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- Bahnan W, Happonen L, Khakzad H, Kumra Ahnlide V, de Neergaard T, Wrighton S, André O, Bratanis E, Tang D, Hellmark T, Björck L, Shannon O, Malmström L, Malmström J, Nordenfelt P. (2023): A human monoclonal antibody bivalently binding two different epitopes in streptococcal M protein mediates immune function. EMBO Mol Med. 2023 Feb 8;15(2):e16208.
- Wrighton S., Ahnlide V.K., André O., Bahnan W., Nordenfelt P. (2023): Group A streptococci induce stronger M protein-fibronectin interaction when specific human antibodies are bound. Frontiers in Microbiology 14:1069789.
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
Izberite svojo ploščo! Sonikator za mikroplošče UIP550MTP dezagregira bakterijske vzorce v kateri koli standardni plošči z več vdolbinicami.
Modeli sonikatorjev za več vzorcev Hielscher UIP400MTP za mikroplošče, VialTweeter in CupHorn: hitra priprava vzorcev z veliko zmogljivostjo obdelave