Transformação Genética em Células Vegetais usando Ultrassônicos

A Transformação Mediada por Agrobacterium Assistida por Sonication (SAAT) é um método eficiente para infectar células vegetais com genes estranhos usando a Agrobacterium como transportador. A cavitação ultrassônica causa sonoporação, que pode ser descrita como micro-ferida direcionada do tecido vegetal. Através dessas ultrasonicamente cria micro-feridas, os vetores de DNA e DNA podem ser transportados eficientemente para a matriz celular.

sonoporação – Transformação celular ultrasonicamente aprimorada

Ultrassonicator UP100H é um homogeneizador de laboratório frequentemente usado para a preparação de amostras de placas de cultura celular.Quando o ultrassom de baixa frequência (aproximadamente 20kHz) é aplicado em suspensões celulares, os efeitos da cavitação acústica causam uma permeabilização transitória da membrana nos tecidos celulares. Este efeito ultrassônico é conhecido como sonoporação e é usado para transferência genética em células ou tecidos.
As vantagens da ultrassônica baseiam-se em seu princípio de trabalho mecânico não térmico, que torna a sônica muitas vezes mais versátil e menos dependente de tipos celulares. A aplicação versátil da sonoporação abre a possibilidade de utilização de plantas transgênicas, que têm potencial significativo na bioprodução de proteínas terapêuticas humanas complexas. Esses bioreatores à base de plantas podem ser fáceis de manipular geneticamente, prevenir a contaminação potencial com patógenos humanos, não danificar bactérias mediadores de transformação (por exemplo, Agrobacterium), e são um método barato e eficaz de biosíntese.

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O vídeo mostra o sistema de preparação de amostras ultrassônicas UIP400MTP, que permite a preparação confiável da amostra de qualquer placa multi-bem padrão usando ultrassom de alta intensidade. Aplicações típicas do UIP400MTP incluem lise celular, DNA, RNA e cromatina, bem como extração de proteínas.

Ultrassonicator UIP400MTP para sônica de placa multi-bem

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Transformação celular ultrassônica assistida

Ultrassonicadores do tipo sonda, como o UP200St, são homogeneizadores de tecido confiáveis e amplamente utilizados para a preparação de amostras em genética, por exemplo, para a Transformação Mediada por Agrobacterium Assistida por Sonication (SAAT).A sônicação é uma técnica que aplica ondas de ultrassom de baixa frequência para agitar partículas em solução, para misturar soluções, aumentando assim a taxa de transferência de massa e dissolução. Simultaneamente, a sônica pode remover gases dissolvidos dos líquidos. Na transformação das plantas, a sônica causará a formação de microwounds no tecido vegetal e aumentará a entrega de DNA nu no protoplasto vegetal.

Para a transformação genética, a Transformação Mediada por Agrobacterium Assistida por Sonication (SAAT) é o método preferido e tem uma eficiência significativamente maior do que a sônica usada para transferir DNA nu e vetores de DNA diretamente para o protoplasto. Inúmeros estudos demonstraram que a sônica assistida transformação mediada por Agrobacterium (SAAT) pode ser usada para induzir perturbações mecânicas e formação de feridas nas células vegetais por ondas de ultrassom e a cavitação acústica resultante. Um pequeno tratamento ultrassônico cria micro-feridas na superfície das explantas. Como as células feridas permitirão a penetração de Agrobacterium na parte mais profunda dos tecidos vegetais, aumentando assim a probabilidade de as células vegetais serem infectadas. Além disso, os compostos fenólicos secretados melhoram a transformação. As micro-feridas geradas ultrasonicamente tornam a penetração de explant por bactérias também mais viável. A SAAT foi utilizada com sucesso para transformação genética em espécies vegetais particularmente consideradas resistentes ao Agrobacterium.
Ser um método muito simples e barato, bem como o aprimoramento significativo da transferência genética mediada por Agrobacterium são as principais vantagens do SAAT. Além da aplicação bem-sucedida de SAAT na transformação do rubrum de Chenopodium L. e Beta vulgaris L., essa abordagem também foi aplicada na produção de escherichia coli wild-labile holotoxina e Escherichia coli mutante LT adjuvantes em tabacum Nicotiana, no qual os mais elevados lt-b-específicos IgGes específicos do LT foram detectados em aves.
(cf. Laere et al., 2016; M. Klimek-Chodacka e R. Baranski, 2014)

O VialTweeter pode ser usado para infecção por DNA de células de plano, por exemplo, usando a transformação mediada por Agrobacterium assistida por sônica (SAAT)

VialTweeter para a sônica simultânea de múltiplos tubos de amostra, por exemplo, para a transformação mediada pela agrobacterium assistida por sônica (SAAT)

Procedimento Geral para Transferência de Genes via Sonoporação em Células Vegetais

  1. Preparo do Material Genético: Comece preparando o material genético que você deseja introduzir nas células vegetais. Isso pode ser DNA plasmidial, RNA, ou outros ácidos nucleicos.
  2. Isolamento de Células Vegetais: Isole as células vegetais que você deseja segmentar. Dependendo do seu experimento, essas células podem ser isoladas de tecidos vegetais ou culturas.
  3. Suspensão celular: Suspender as células vegetais em um meio ou tampão adequado. Isso é essencial para garantir que as células estejam saudáveis e em um estado propício à captação de genes.
  4. Configure seu Sonicator: Prepare seu sonicador do tipo sonda por parâmetros pré-definidos de sonicação, como amplitude, tempo, energia e temperatura. Mergulhe a sonda ultra-sônica na suspensão da célula.
  5. sonicação: Inicie o procedimento de sonicação. A rápida oscilação da ponta da sonda gera bolhas de cavitação no líquido. Essas bolhas se expandem e colapsam devido às ondas ultrassônicas, criando forças mecânicas e microfluxo na suspensão.
  6. Sonoporação: As forças mecânicas e o microfluxo gerado pela cavitação criam poros e buracos temporários nas membranas das células vegetais. O material genético presente na suspensão pode entrar nas células vegetais por esses poros.
  7. Incubação: Após o tratamento de sonoporação, incubar as células vegetais para permitir que elas se recuperem e estabilizem suas membranas. Este é um passo crucial para garantir a sobrevivência celular e a transferência de genes bem-sucedida.

Transferência de Genes Via Agrobacterium ou Lipossomas

Existem duas formas comuns de transfectar células vegetais. Eles usam agrobactérias, um gênero de bactérias Gram-negativas, ou lipossomas como portadores do material genético.

  • Sonoporação Mediada por Agrobacterium: Agrobacterium tumefaciens é uma bactéria comumente utilizada em engenharia genética vegetal. Neste método, o DNA plasmidial contendo o gene desejado é introduzido na Agrobacterium, que é então misturada com células vegetais. A suspensão celular é submetida à sonoporação usando um sonicador do tipo sonda. A energia ultra-sônica aumenta a transferência do material genético de Agrobacterium para as células vegetais. Este método é amplamente utilizado para a modificação genética de plantas.
  • Sonoporação mediada por lipossomas: Os lipossomas são vesículas à base de lipídios que podem transportar material genético. Neste método, lipossomas carregados com DNA plasmidial ou outros ácidos nucléicos são misturados com células vegetais. A sonoporação usando um sonicador do tipo sonda é empregada para facilitar a captação de lipossomas pelas células vegetais. O ultrassom rompe as bicamadas lipídicas dos lipossomas, liberando o material genético nas células vegetais. Esta abordagem é útil para estudos de expressão gênica transitória em células vegetais.

Benefícios cientificamente comprovados da transformação mediada por agrobacterium assistido por sônica (SAAT)

A Transformação Mediada por Agrobacterium Assistida por Sonication (SAAT) tem sido aplicada a inúmeras espécies vegetais. Um tratamento ultrassônico curto e relativamente leve das culturas celulares vegetais causa sonoporação, o que posteriormente permite uma penetração profunda do Agrobacterium como transportador genético. Abaixo você pode ler estudos exemplares que demonstram os efeitos benéficos do SAAT.

Sonicator UP200Ht com micro-ponta para transfecção de células vegetais com genes via sonoporação

Sonicator UP200Ht para transfecção gênica via sonoporação

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Transformação Ultrasonicamente Assistida de Ashwagandha

Para melhorar a eficiência de transformação em W. somnifera (conhecida como ashwagandha ou cereja de inverno), Dehdashti e colegas (2016) investigaram o uso de acetosyringona (AS) e sonicação.
A acetosiingona (AS) foi adicionada em três etapas: Cultura líquida de Agrobacterium, Infecção agrobacterium e cocultura de explants com Agrobacterium. A adição de 75 μM AS à cultura líquida de Agrobacterium foi considerada ótima para a indução de genes vir.
A aplicação adicional da sônica (SAAT) resultou na maior expressão genética. A expressão genética gusA em raízes peludas foi considerada melhor quando as pontas das folhas e brotos foram sônicas para 10 e 20 anos, respectivamente. A eficiência de transformação do protocolo melhorado foi registrada em 66,5 e 59,5% no caso de explantas de folhas e brotos, respectivamente. Quando comparado com outros protocolos, a eficiência de transformação deste protocolo melhorado foi encontrada 2,5 vezes maior para folhas e 3,7 vezes mais para pontas de tiro. Análises de manchas do sul confirmaram 1-2 cópias do transgene gusA nas linhas W1-W4, enquanto 1-4 cópias transgênicas foram detectadas na linha W5 gerada pelo protocolo melhorado.

A duração da sônica (tempo exposto ao ultrassom) afeta a transformação mediada pela agrobacterium assistida por sônica (SAAT) na transformação em W. somnifera

Efeito da duração da transformação mediada pela agrobacterium assistida pela sônica (SAAT) na frequência de transformação da folha W. somnifera (a) e das explantas da ponta de tiro (b)
(estudo e gráfico: © Dehdashti et al., 2016)

Sonicators como o UP200St são usados para preparar material genético como DNA, RNA, miRNA e a subsequente transfecção gênica via sonoporação. A sonoporação permite transfectar células vegetais com material genético usando agrobactérias.

Homogeneizador tipo sonda UP200St para sonoporação e transfecção gênica

Transformação ultrasonicamente assistida do algodão

Hussain et al. (2007) demonstram os efeitos benéficos da transformação assistida pela sônica. A cavitação acústica causada pelo ultrassom de baixa frequência cria micro-feridas dentro e abaixo da superfície do tecido vegetal (sonoporação) e permite que a Agrobacterium viaje mais fundo e completamente por todo o tecido vegetal. Essa moda ferida aumenta a probabilidade de infectar células vegetais mais profundas no tecido. Para avaliar a eficiência de transformação do SAAT, mediu-se a expressão genética GUS. O sistema de repórteres GUS é um sistema genético repórter, particularmente útil em biologia molecular vegetal e microbiologia. Ajustando vários parâmetros SAAT, a expressão transitória GUS no algodão usando embriões maduros como explante foi significativamente aprimorada. GUS foi detectado pela primeira vez 24h após a incubação das explantas e às 48h, a expressão GUS foi muito intensa, o que serviu como um indicador útil de transformação bem sucedida da explanta de algodão após a sônica assistida Transformação Mediada agrobacterium (SAAT). A comparação de várias técnicas de transformação (ou seja, biolística, Agro, BAAT, SAAT), transformação mediada por Agrobacterium assistida por sônica (SAAT) mostrou de longe os melhores resultados da transformação.

A transformação mediada pela Agrobacterium assistida por sonicação (SAAT) mostra uma expressão transitória significativamente maior quando comparada aos métodos alternativos de infecção.

Escolha do procedimento de transformação com base na expressão transitória do GUS. A transformação mediada por Agrobacterium assistida por sonicação (SAAT) mostra uma expressão transitória significativamente maior.
(estudo e gráfico: © Hussain et al., 2007)

 

Este tutorial explica que tipo de sonicator é melhor para suas tarefas de preparação de amostras, como lise, interrupção celular, isolamento de proteínas, fragmentação de DNA e RNA em laboratórios, análise e pesquisa. Escolha o tipo de sonicator ideal para sua aplicação, volume de amostra, número de amostra e taxa de transferência. Hielscher Ultrasonics tem o homogeneizador ultra-sônico ideal para você!

Como encontrar o sonicator perfeito para ruptura celular e extração de proteínas em ciência e análise

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Soluções ultrassônicas de alto desempenho para sonoporação e SAAT

A Hielscher Ultrasonics é experiente há muito tempo no desenvolvimento e fabricação de ultrassononicadores de alto desempenho para laboratórios, instalações de pesquisa, bem como produção industrial com rendimentos muito altos. Para microbiologia e ciência da vida, a Hielscher oferece várias soluções para acomodar diferentes requisitos necessários para tecidos específicos e seus tratamentos. Para a ultrassonização simultânea de numerosas amostras, o Hielscher oferece o UIP400MTP para placas multiwell, o VialTweeter para a sônica de até 10 frascos (por exemplo, tubos Eppendorf) ou o CupHorn ultrassônico. Os ultrassonicadores do tipo sonda estão disponíveis de 50 a 400 watts como homogeneizadores de laboratório, enquanto os sistemas industriais cobrem a faixa de energia de 500 watts a 16kW.
Entre em contato conosco e informe-nos sobre seus requisitos de aplicação e processo. Nossa equipe bem experiente ficará feliz em recomendar o ultrassônico mais adequado para o seu processo biológico.
A tabela abaixo dá-lhe uma indicação da capacidade de processamento aproximado de nossos ultrasonicators:

Volume batch Quociente de vazão Dispositivos Recomendados
placas multiwell / microtiter n / D. UIP400MTP
até 10 frascos n / D. VialTweeter
até 5 frascos/tubos ou 1 vaso maior n / D. Cuphorn
1 a 500mL 10 a 200 mL / min UP100H
10 a 2000 mL 20 a 400 mL / min UP200Ht, UP400St
0.1 a 20L 00,2 a 4 L / min UIP2000hdT
10 a 100L 2 de 10L / min UIP4000hdT
n / D. 10 a 100L / min UIP16000
n / D. maior aglomerado de UIP16000

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Homogeneizadores ultrassônicos de alta cisalhamento são usados em laboratório, bancada, piloto e processamento industrial.

A Hielscher Ultrasonics fabrica homogeneizadores ultrassônicos de alto desempenho para aplicações de mistura, dispersão, emulsificação e extração em escala laboratoria, piloto e industrial.



Literatura / Referências


Ultrassônicos de alto desempenho! A gama de produtos da Hielscher abrange todo o espectro desde o ultrassônico de laboratório compacto sobre unidades de bancada até sistemas ultrassônicos industriais completos.

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