Transformação Genética em Células Vegetais usando Ultrassom

A Transformação Mediada por Agrobacterium Assistida por Sonicação (SAAT) é um método eficiente para infectar células vegetais com genes estranhos usando Agrobacterium como transportador. A cavitação ultrassônica causa sonoporação, que pode ser descrita como microferimento direcionado do tecido vegetal. Por meio dessas micro-feridas criadas por ultrassom, o DNA e os vetores de DNA podem ser transportados com eficiência para a matriz celular.

sonoporação – Transformação Celular Ultrassonicamente Aprimorada

Quando o ultrassom de baixa frequência (aprox. 20kHz) é aplicado a suspensões celulares, os efeitos da cavitação acústica causam uma permeabilização transitória da membrana nos tecidos celulares. Esse efeito ultrassônico é conhecido como sonoporação e é usado para transferência de genes para células ou tecidos.
As vantagens da ultrassonografia são baseadas em seu princípio de funcionamento mecânico não térmico, o que torna a sonicação muitas vezes mais versátil e menos dependente dos tipos de células. A aplicação versátil da sonoporação abre a possibilidade para a utilização de plantas transgênicas, que possuem potencial significativo na bioprodução de proteínas terapêuticas humanas complexas. Esses biorreatores à base de plantas podem ser facilmente manipulados geneticamente, evitar a contaminação potencial com patógenos humanos, não danificar as bactérias mediadoras de transformação (por exemplo, Agrobacterium) e são um método barato e eficaz de biossíntese.

Transformação celular assistida por ultrassom

A sonicação é uma técnica que aplica ondas de ultrassom de baixa frequência para agitar partículas em solução, para misturar soluções, aumentando assim a taxa de transferência de massa e dissolução. Simultaneamente, a sonicação pode remover gases dissolvidos de líquidos. Na transformação de plantas, a sonicação causará a formação de microferidas no tecido vegetal e aumentará a entrega de DNA nu no protoplasto da planta.

Para a transformação genética, a Transformação Mediada por Agrobacterium Assistida por Sonicação (SAAT) é o método preferido e tem uma eficiência significativamente maior do que a sonicação usada para transferir DNA nu e vetores de DNA diretamente para o protoplasto. Numerosos estudos demonstraram que a transformação mediada por Agrobacterium assistida por sonicação (SAAT) pode ser usada para induzir ruptura mecânica e formação de feridas em células vegetais por ondas de ultrassom e a cavitação acústica resultante. Um tratamento ultrassônico curto cria micro-feridas na superfície dos explantes. Como as células feridas permitirão a penetração de Agrobacterium na parte mais profunda dos tecidos vegetais, aumentando assim a probabilidade de as células vegetais serem infectadas. Além disso, os compostos fenólicos secretados aumentam a transformação. As microferidas geradas por ultrassom tornam a penetração do explante por bactérias também mais viável. O SAAT foi utilizado com sucesso para transformação genética em espécies vegetais particularmente consideradas resistentes a Agrobacterium.
Por ser um método muito simples e barato, bem como o aprimoramento significativo da transferência gênica mediada por Agrobacterium são as principais vantagens do SAAT. Além da aplicação bem-sucedida de SAAT na transformação de Chenopodium rubrum L. e Beta vulgaris L., essa abordagem também foi aplicada na produção de holotoxina termolábil do tipo selvagem recombinante de Escherichia coli e adjuvantes da vacina LT mutante de Escherichia coli em Nicotiana tabacum, nos quais os maiores títulos sistêmicos de IgG específicos para LT-B foram detectados em aves.
(cf. Laere et al., 2016; M. Klimek-Chodacka e R. Baranski, 2014)

Procedimento geral para transferência de genes via sonoporação em células vegetais

1. Preparação do material genético: Comece preparando o material genético que deseja introduzir nas células vegetais. Pode ser DNA de plasmídeo, RNA ou outros ácidos nucléicos.
2. Isolamento de células vegetais: Isole as células vegetais que você deseja atingir. Dependendo do seu experimento, essas células podem ser isoladas de tecidos ou culturas vegetais.
3. Suspensão celular: Suspenda as células vegetais em um meio ou tampão adequado. Isso é essencial para garantir que as células estejam saudáveis e em um estado propício à absorção de genes.
4. Configure seu Sonicator: Prepare seu sonicador do tipo sonda pré-definindo parâmetros de sonicação, como amplitude, tempo, energia e temperatura. Mergulhe a sonda ultrassônica na suspensão celular.
5. Sonication: Inicie o procedimento de sonicação. A rápida oscilação da ponta da sonda gera bolhas de cavitação no líquido. Essas bolhas se expandem e colapsam devido às ondas ultrassônicas, criando forças mecânicas e microfluxo na suspensão.
6. Sonoporação: As forças mecânicas e o microfluxo gerados pela cavitação criam temporariamente poros e buracos nas membranas das células vegetais. O material genético presente na suspensão pode entrar nas células vegetais por esses poros.
7. Incubação: Após o tratamento de sonoporação, incube as células vegetais para permitir que elas recuperem e estabilizem suas membranas. Este é um passo crucial para garantir a sobrevivência celular e a transferência de genes bem-sucedida.

Transferência de genes via Agrobacterium ou lipossomas

Existem duas formas comuns de transfectar células vegetais. Eles usam agrobacterium, um gênero de bactérias Gram-negativas, ou lipossomas como portadores do material genético.

• Sonoporação mediada por Agrobacterium: Agrobacterium tumefaciens é uma bactéria comumente usada em engenharia genética de plantas. Neste método, o DNA plasmidial contendo o gene desejado é introduzido no Agrobacterium, que é então misturado com células vegetais. A suspensão celular é submetida a sonoporação usando um sonicador tipo sonda. A energia ultrassônica aumenta a transferência do material genético de Agrobacterium para as células vegetais. Este método é amplamente utilizado para a modificação genética de plantas.
• Sonoporação mediada por lipossomas: Os lipossomas são vesículas à base de lipídios que podem transportar material genético. Neste método, lipossomas carregados com DNA de plasmídeo ou outros ácidos nucléicos são misturados com células vegetais. A sonoporação usando um sonicador do tipo sonda é empregada para facilitar a captação de lipossomas pelas células vegetais. O ultrassom interrompe as bicamadas lipídicas dos lipossomas, liberando o material genético nas células vegetais. Essa abordagem é útil para estudos de expressão gênica transitória em células vegetais.

Benefícios cientificamente comprovados da transformação mediada por agrobactérias assistida por sonicação (SAAT)

A Transformação Mediada por Agrobacterium Assistida por Sonicação (SAAT) tem sido aplicada a inúmeras espécies de plantas. Um tratamento ultrassônico curto e relativamente suave de culturas de células vegetais causa sonoporação, que subsequentemente permite uma penetração profunda de Agrobacterium como transportador de genes. Abaixo você pode ler estudos exemplares que demonstram os efeitos benéficos do SAAT.

Transformação assistida por ultrassom de Ashwagandha

A fim de melhorar a eficiência de transformação em W. somnifera (conhecida como ashwagandha ou cereja de inverno), Dehdashti e colegas (2016) investigaram o uso de acetosiringona (AS) e sonicação.
A acetosiringona (AS) foi adicionada em três etapas: cultura líquida de Agrobacterium, infecção por Agrobacterium e co-cultura de explantes com Agrobacterium. A adição de 75 μM de AS à cultura líquida de Agrobacterium mostrou-se ótima para a indução de genes vir.
A aplicação adicional de sonicação (SAAT) resultou em maior expressão gênica. A expressão do gene gusA em raízes pilosas foi considerada melhor quando as folhas e pontas dos brotos foram sonicadas por 10 e 20s, respectivamente. A eficiência de transformação do protocolo melhorado foi registrada em 66,5 e 59,5% no caso dos explantes de folhas e ápices da parte aérea, respectivamente. Quando comparado com outros protocolos, a eficiência de transformação deste protocolo aprimorado foi 2,5 vezes maior para folhas e 3,7 vezes maior para pontas de brotos. As análises de Southern blot confirmaram 1–2 cópias do transgene gusA nas linhagens W1-W4, enquanto 1–4 cópias do transgene foram detectadas na linhagem W5 gerada pelo protocolo aprimorado.

Efeito da duração da transformação mediada por Agrobacterium assistida por sonicação (SAAT) na frequência de transformação de explantes de folhas (a) e pontas da parte aérea (b) de W. somnifera
(estudo e gráfico: © Dehdashti et al., 2016)

Transformação do algodão assistida por ultrassom

Hussain et al. (2007) demonstram os efeitos benéficos da transformação do algodão assistida por sonicação. A cavitação acústica causada pelo ultrassom de baixa frequência cria micro-feridas na superfície e abaixo da superfície do tecido vegetal (sonoporação) e permite que o Agrobacterium viaje mais fundo e completamente por todo o tecido vegetal. Essa forma de ferimento aumenta a probabilidade de infectar células vegetais mais profundas no tecido. Para avaliar a eficiência de transformação do SAAT, a expressão do gene GUS foi medida. O sistema repórter GUS é um sistema de gene repórter, particularmente útil em biologia molecular e microbiologia vegetal. Ajustando vários parâmetros SAAT, a expressão transitória de GUS em algodão usando embriões maduros como explante foi significativamente aumentada. O GUS foi detectado pela primeira vez 24h após a incubação dos explantes e, em 48h, a expressão do GUS foi muito intensa, o que serviu como um indicador útil da transformação bem-sucedida do explante de algodão após a transformação mediada por Agrobacterium assistida por sonicação (SAAT). A comparação de várias técnicas de transformação (nomeadamente biolística, Agro, BAAT, SAAT), transformação mediada por Agrobacterium assistida por sonicação (SAAT) mostrou, de longe, os melhores resultados de transformação.

Escolha do procedimento de transformação com base na expressão transitória de GUS. A transformação mediada por Agrobacterium assistida por sonicação (SAAT) mostra uma expressão transitória significativamente maior.
(estudo e gráfico: © Hussain et al., 2007)

Soluções ultrassônicas de alto desempenho para sonoporação e SAAT

A Hielscher Ultrasonics tem uma longa experiência no desenvolvimento e fabricação de ultrassônicos de alto desempenho para laboratórios, instalações de pesquisa, bem como produção industrial com rendimentos muito altos. Para microbiologia e ciências da vida, a Hielscher oferece várias soluções para acomodar diferentes requisitos necessários para tecidos específicos e seus tratamentos. Para a ultrassonografia simultânea de várias amostras, a Hielscher oferece o UIP400MTP para placas multipoços, o VialTweeter para a sonicação de até 10 frascos (por exemplo, tubos Eppendorf) ou o CupHorn ultrassônico. Os ultrassônicos do tipo sonda estão disponíveis de 50 a 400 watts como homogeneizadores de laboratório, enquanto os sistemas industriais cobrem a faixa de potência de 500 watts a 16kW.
Entre em contato conosco e informe-nos sobre seus requisitos de aplicação e processo. Nossa equipe experiente terá prazer em recomendar o ultrassônico mais adequado para o seu processo biológico.
A tabela abaixo fornece uma indicação da capacidade aproximada de processamento de nossos ultrassônicos: