Transformação Genética em Células Vegetais usando Ultrassônicos

A Transformação Mediada por Agrobacterium Assistida por Sonication (SAAT) é um método eficiente para infectar células vegetais com genes estranhos usando a Agrobacterium como transportador. A cavitação ultrassônica causa sonoporação, que pode ser descrita como micro-ferida direcionada do tecido vegetal. Através dessas ultrasonicamente cria micro-feridas, os vetores de DNA e DNA podem ser transportados eficientemente para a matriz celular.

sonoporação – Transformação celular ultrasonicamente aprimorada

Quando o ultrassom de baixa frequência (aproximadamente 20kHz) é aplicado em suspensões celulares, os efeitos da cavitação acústica causam uma permeabilização transitória da membrana nos tecidos celulares. Este efeito ultrassônico é conhecido como sonoporação e é usado para transferência genética em células ou tecidos.
As vantagens da ultrassônica baseiam-se em seu princípio de trabalho mecânico não térmico, que torna a sônica muitas vezes mais versátil e menos dependente de tipos celulares. A aplicação versátil da sonoporação abre a possibilidade de utilização de plantas transgênicas, que têm potencial significativo na bioprodução de proteínas terapêuticas humanas complexas. Esses bioreatores à base de plantas podem ser fáceis de manipular geneticamente, prevenir a contaminação potencial com patógenos humanos, não danificar bactérias mediadores de transformação (por exemplo, Agrobacterium), e são um método barato e eficaz de biosíntese.

Transformação celular ultrassônica assistida

A sônicação é uma técnica que aplica ondas de ultrassom de baixa frequência para agitar partículas em solução, para misturar soluções, aumentando assim a taxa de transferência de massa e dissolução. Simultaneamente, a sônica pode remover gases dissolvidos dos líquidos. Na transformação das plantas, a sônica causará a formação de microwounds no tecido vegetal e aumentará a entrega de DNA nu no protoplasto vegetal.

Para a transformação genética, a Transformação Mediada por Agrobacterium Assistida por Sonication (SAAT) é o método preferido e tem uma eficiência significativamente maior do que a sônica usada para transferir DNA nu e vetores de DNA diretamente para o protoplasto. Inúmeros estudos demonstraram que a sônica assistida transformação mediada por Agrobacterium (SAAT) pode ser usada para induzir perturbações mecânicas e formação de feridas nas células vegetais por ondas de ultrassom e a cavitação acústica resultante. Um pequeno tratamento ultrassônico cria micro-feridas na superfície das explantas. Como as células feridas permitirão a penetração de Agrobacterium na parte mais profunda dos tecidos vegetais, aumentando assim a probabilidade de as células vegetais serem infectadas. Além disso, os compostos fenólicos secretados melhoram a transformação. As micro-feridas geradas ultrasonicamente tornam a penetração de explant por bactérias também mais viável. A SAAT foi utilizada com sucesso para transformação genética em espécies vegetais particularmente consideradas resistentes ao Agrobacterium.
Ser um método muito simples e barato, bem como o aprimoramento significativo da transferência genética mediada por Agrobacterium são as principais vantagens do SAAT. Além da aplicação bem-sucedida de SAAT na transformação do rubrum de Chenopodium L. e Beta vulgaris L., essa abordagem também foi aplicada na produção de escherichia coli wild-labile holotoxina e Escherichia coli mutante LT adjuvantes em tabacum Nicotiana, no qual os mais elevados lt-b-específicos IgGes específicos do LT foram detectados em aves.
(cf. Laere et al., 2016; M. Klimek-Chodacka e R. Baranski, 2014)

Benefícios cientificamente comprovados da transformação mediada por agrobacterium assistido por sônica (SAAT)

A Transformação Mediada por Agrobacterium Assistida por Sonication (SAAT) tem sido aplicada a inúmeras espécies vegetais. Um tratamento ultrassônico curto e relativamente leve das culturas celulares vegetais causa sonoporação, o que posteriormente permite uma penetração profunda do Agrobacterium como transportador genético. Abaixo você pode ler estudos exemplares que demonstram os efeitos benéficos do SAAT.

Transformação Ultrasonicamente Assistida de Ashwagandha

Para melhorar a eficiência de transformação em W. somnifera (conhecida como ashwagandha ou cereja de inverno), Dehdashti e colegas (2016) investigaram o uso de acetosyringona (AS) e sonicação.
A acetosiingona (AS) foi adicionada em três etapas: Cultura líquida de Agrobacterium, Infecção agrobacterium e cocultura de explants com Agrobacterium. A adição de 75 μM AS à cultura líquida de Agrobacterium foi considerada ótima para a indução de genes vir.
A aplicação adicional da sônica (SAAT) resultou na maior expressão genética. A expressão genética gusA em raízes peludas foi considerada melhor quando as pontas das folhas e brotos foram sônicas para 10 e 20 anos, respectivamente. A eficiência de transformação do protocolo melhorado foi registrada em 66,5 e 59,5% no caso de explantas de folhas e brotos, respectivamente. Quando comparado com outros protocolos, a eficiência de transformação deste protocolo melhorado foi encontrada 2,5 vezes maior para folhas e 3,7 vezes mais para pontas de tiro. Análises de manchas do sul confirmaram 1-2 cópias do transgene gusA nas linhas W1-W4, enquanto 1-4 cópias transgênicas foram detectadas na linha W5 gerada pelo protocolo melhorado.

Efeito da duração da transformação mediada pela agrobacterium assistida pela sônica (SAAT) na frequência de transformação da folha W. somnifera (a) e das explantas da ponta de tiro (b)
(estudo e gráfico: © Dehdashti et al., 2016)

Transformação ultrasonicamente assistida do algodão

Hussain et al. (2007) demonstram os efeitos benéficos da transformação assistida pela sônica. A cavitação acústica causada pelo ultrassom de baixa frequência cria micro-feridas dentro e abaixo da superfície do tecido vegetal (sonoporação) e permite que a Agrobacterium viaje mais fundo e completamente por todo o tecido vegetal. Essa moda ferida aumenta a probabilidade de infectar células vegetais mais profundas no tecido. Para avaliar a eficiência de transformação do SAAT, mediu-se a expressão genética GUS. O sistema de repórteres GUS é um sistema genético repórter, particularmente útil em biologia molecular vegetal e microbiologia. Ajustando vários parâmetros SAAT, a expressão transitória GUS no algodão usando embriões maduros como explante foi significativamente aprimorada. GUS foi detectado pela primeira vez 24h após a incubação das explantas e às 48h, a expressão GUS foi muito intensa, o que serviu como um indicador útil de transformação bem sucedida da explanta de algodão após a sônica assistida Transformação Mediada agrobacterium (SAAT). A comparação de várias técnicas de transformação (ou seja, biolística, Agro, BAAT, SAAT), transformação mediada por Agrobacterium assistida por sônica (SAAT) mostrou de longe os melhores resultados da transformação.

Escolha do procedimento de transformação com base na expressão transitória do GUS. A transformação mediada por Agrobacterium assistida por sonicação (SAAT) mostra uma expressão transitória significativamente maior.
(estudo e gráfico: © Hussain et al., 2007)

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