Transformação genética em células vegetais utilizando ultra-sons

A Transformação Mediada por Agrobacterium Assistida por Sonicação (SAAT) é um método eficiente para infetar células vegetais com genes estranhos utilizando Agrobacterium como transportador. A cavitação ultra-sónica provoca a sonoporação, que pode ser descrita como micro-feridas direcionadas do tecido vegetal. Através destes ultra-sons cria micro-feridas, DNA e vectores de DNA pode ser eficientemente transportado para a matriz celular.

sonoporação – Transformação celular reforçada por ultra-sons

Quando se aplicam ultra-sons de baixa frequência (aprox. 20 kHz) a suspensões celulares, os efeitos da cavitação acústica provocam uma permeabilização transitória da membrana nos tecidos celulares. Este efeito ultrassónico é conhecido como sonoporação e é utilizado para a transferência de genes para células ou tecidos.
As vantagens da ultrassonografia baseiam-se no seu princípio de funcionamento mecânico não térmico, o que torna a ultrassonografia frequentemente mais versátil e menos dependente dos tipos de células. A aplicação versátil de sonoporação abre a possibilidade para a utilização de plantas transgénicas, que têm um potencial significativo na bioprodução de proteínas terapêuticas humanas complexas. Estes bioreactores à base de plantas podem ser facilmente manipulados geneticamente, evitam a potencial contaminação com agentes patogénicos humanos, não danificam as bactérias mediadoras da transformação (por exemplo, Agrobacterium) e constituem um método de biossíntese económico e eficaz.

Transformação celular assistida por ultra-sons

A sonicação é uma técnica que aplica ondas de ultra-sons de baixa frequência para agitar partículas em solução, para misturar soluções, aumentando assim a taxa de transferência de massa e dissolução. Simultaneamente, a sonicação pode remover os gases dissolvidos dos líquidos. Na transformação de plantas, a sonicação provocará a formação de micro-sondas no tecido vegetal e aumentará a entrega de ADN nu ao protoplasto da planta.

Para a transformação genética, a transformação mediada por Agrobacterium assistida por sonicação (SAAT) é o método preferido e tem uma eficiência significativamente mais elevada do que a sonicação utilizada para transferir ADN nu e vectores de ADN diretamente para o protoplasto. Numerosos estudos demonstraram que a transformação mediada por Agrobacterium assistida por sonicação (SAAT) pode ser utilizada para induzir a rutura mecânica e a formação de feridas nas células vegetais através de ondas de ultra-sons e da cavitação acústica resultante. Um tratamento ultrassónico curto cria micro feridas na superfície dos explantes. Como as células feridas permitirão a penetração da Agrobacterium na parte mais profunda dos tecidos vegetais, aumentando assim a probabilidade de as células vegetais serem infectadas. Além disso, os compostos fenólicos secretados aumentam a transformação. As micro-feridas geradas por ultra-sons tornam a penetração dos explantes pelas bactérias também mais viável. O SAAT foi utilizado com êxito para a transformação genética em espécies vegetais consideradas particularmente resistentes à Agrobacterium.
O facto de ser um método muito simples e pouco dispendioso, bem como o aumento significativo da transferência de genes mediada por Agrobacterium, são as principais vantagens da SAAT. Para além da aplicação bem sucedida da SAAT na transformação de Chenopodium rubrum L. e Beta vulgaris L., esta abordagem também foi aplicada na produção de holotoxina termolábil recombinante de Escherichia coli de tipo selvagem e de adjuvantes de vacinas LT mutantes de Escherichia coli em Nicotiana tabacum, em que foram detectados os títulos mais elevados de IgG sistémica específica de LT-B em aves.
(cf. Laere et al., 2016; M. Klimek-Chodacka e R. Baranski, 2014)

Procedimento geral para a transferência de genes por sonoporação em células vegetais

1. Preparação do material genético: Comece por preparar o material genético que pretende introduzir nas células vegetais. Pode ser ADN de plasmídeo, ARN ou outros ácidos nucleicos.
2. Isolamento de células vegetais: Isolar as células vegetais que se pretende atingir. Dependendo da sua experiência, estas células podem ser isoladas de tecidos ou culturas vegetais.
3. Suspensão celular: Suspender as células vegetais num meio ou tampão adequado. Isto é essencial para garantir que as células estão saudáveis e num estado conducente à absorção de genes.
4. Configure o seu Sonicator: Prepare o seu sonicador do tipo sonda através da sonicação de parâmetros pré-definidos, tais como amplitude, tempo, energia e temperatura. Mergulhar a sonda ultra-sónica na suspensão celular.
5. Sonicação: Iniciar o processo de sonicação. A rápida oscilação da ponta da sonda gera bolhas de cavitação no líquido. Estas bolhas expandem-se e colapsam devido às ondas ultra-sónicas, criando forças mecânicas e microfluxos na suspensão.
6. Sonoporação: As forças mecânicas e o microfluxo gerado pela cavitação criam temporariamente poros e orifícios nas membranas das células vegetais. O material genético presente na suspensão pode entrar nas células vegetais através destes poros.
7. Incubação: Após o tratamento por sonoporação, incubar as células vegetais para permitir que recuperem e estabilizem as suas membranas. Este é um passo crucial para garantir a sobrevivência das células e o sucesso da transferência de genes.

Transferência de genes através de Agrobacterium ou lipossomas

Existem duas formas comuns de transfectar células vegetais. Utilizam agrobactérias, um género de bactérias Gram-negativas, ou lipossomas como transportadores do material genético.

• Sonoporação mediada por Agrobacterium: A Agrobacterium tumefaciens é uma bactéria comummente utilizada na engenharia genética de plantas. Neste método, o ADN plasmídico que contém o gene desejado é introduzido na Agrobacterium, que é depois misturada com células vegetais. A suspensão de células é submetida a sonoporação utilizando um sonicador do tipo sonda. A energia ultra-sónica aumenta a transferência do material genético da Agrobacterium para as células vegetais. Este método é amplamente utilizado para a modificação genética das plantas.
• Sonoporação mediada por lipossomas: Os lipossomas são vesículas à base de lípidos que podem transportar material genético. Neste método, os lipossomas carregados com ADN plasmídico ou outros ácidos nucleicos são misturados com células vegetais. A sonoporação com um sonicador do tipo sonda é utilizada para facilitar a absorção dos lipossomas pelas células vegetais. Os ultra-sons rompem as bicamadas lipídicas dos lipossomas, libertando o material genético para as células vegetais. Esta abordagem é útil para estudos de expressão genética transitória em células vegetais.

Benefícios cientificamente comprovados da Transformação Mediada por Agrobacterium Assistida por Sonicação (SAAT)

A Transformação Mediada por Agrobacterium Assistida por Sonicação (SAAT) tem sido aplicada a numerosas espécies de plantas. Um tratamento ultrassónico curto e relativamente suave de culturas de células vegetais provoca a sonoporação, que subsequentemente permite uma penetração profunda de Agrobacterium como transportador de genes. Abaixo pode ler estudos exemplares que demonstram os efeitos benéficos da SAAT.

Transformação assistida por ultra-sons de Ashwagandha

A fim de melhorar a eficiência da transformação em W. somnifera (conhecida como ashwagandha ou cereja de inverno), Dehdashti e colegas (2016) investigaram o uso de acetosiringona (AS) e sonicação.
A acetosiringona (AS) foi adicionada em três fases: Cultura líquida de Agrobacterium, infeção por Agrobacterium e co-cultura de explantes com Agrobacterium. A adição de 75 μM de AS à cultura líquida de Agrobacterium foi considerada óptima para a indução de genes vir.
A aplicação adicional de sonicação (SAAT) resultou na maior expressão do gene. Verificou-se que a expressão do gene gusA em raízes peludas era melhor quando as folhas e as pontas dos rebentos eram submetidas a ultra-sons durante 10 e 20 segundos, respetivamente. A eficiência de transformação do protocolo melhorado foi registada em 66,5 e 59,5% no caso de explantes de folhas e de pontas de rebentos, respetivamente. Quando comparada com outros protocolos, a eficiência de transformação deste protocolo melhorado foi 2,5 vezes superior para as folhas e 3,7 vezes superior para as pontas de rebentos. As análises de Southern blot confirmaram 1-2 cópias do transgene gusA nas linhas W1-W4, enquanto que 1-4 cópias do transgene foram detectadas na linha W5 gerada pelo protocolo melhorado.

Efeito da duração da transformação mediada por Agrobacterium assistida por sonicação (SAAT) na frequência de transformação de explantes de folhas de W. somnifera (a) e de pontas de rebentos (b)
(estudo e gráfico: © Dehdashti et al., 2016)

Transformação de algodão assistida por ultra-sons

Hussain et al. (2007) demonstram os efeitos benéficos da transformação do algodão assistida por sonicação. A cavitação acústica causada por ultra-sons de baixa frequência cria micro-feridas sobre e abaixo da superfície do tecido vegetal (sonoporação) e permite que a Agrobacterium viaje mais profundamente e completamente através do tecido vegetal. Esta forma de ferida aumenta a probabilidade de infetar as células vegetais que se encontram mais profundamente no tecido. A fim de avaliar a eficiência da transformação do SAAT, foi medida a expressão do gene GUS. O sistema GUS é um sistema de genes repórteres, particularmente útil em biologia molecular de plantas e microbiologia. Ajustando vários parâmetros do SAAT, a expressão transiente de GUS no algodão, utilizando embriões maduros como explante, foi significativamente melhorada. O GUS foi detectado pela primeira vez 24 horas após a incubação dos explantes e, às 48 horas, a expressão do GUS era muito intensa, o que serviu como um indicador útil de uma transformação bem sucedida do explante de algodão após a transformação mediada por Agrobacterium assistida por sonicação (SAAT). A comparação de várias técnicas de transformação (nomeadamente biolística, Agro, BAAT, SAAT), a transformação mediada por Agrobacterium assistida por sonicação (SAAT) apresentou, de longe, os melhores resultados de transformação.

Escolha do procedimento de transformação com base na expressão transiente de GUS. A transformação mediada por Agrobacterium assistida por sonicação (SAAT) apresenta uma expressão transitória significativamente mais elevada.
(estudo e gráfico: © Hussain et al., 2007)

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