Transformação genética em células vegetais com ultrassons

A transformação mediada por Agrobacterium assistida por sonicação (SAAT) é um método eficiente para infetar células vegetais com genes estranhos utilizando Agrobacterium como transportador. A cavitação ultrassónica provoca sonoporação, que pode ser descrita como a criação direcionada de microlesões no tecido vegetal. Através destas microlesões criadas por ultrassons, o DNA e os vetores de DNA podem ser transportados eficientemente para a matriz celular.

Sonoporação – Transformação celular potenciada por ultrassons

Quando se aplicam ultrassons de baixa frequência (aprox. 20kHz) a suspensões celulares, os efeitos da cavitação acústica provocam uma permeabilização transitória das membranas nos tecidos celulares. Este efeito ultrassónico é conhecido como sonoporação e é utilizado para transferir genes para células ou tecidos.
As vantagens do tratamento ultrassónico baseiam-se no seu princípio de funcionamento mecânico não térmico, que torna frequentemente a sonicação mais versátil e menos dependente dos tipos de células. A aplicação versátil da sonoporação abre a possibilidade de utilização de plantas transgénicas, que têm um potencial significativo na bioprodução de proteínas terapêuticas humanas complexas. Estes biorreatores à base de plantas podem ser facilmente manipulados geneticamente, evitam a potencial contaminação por agentes patogénicos humanos, não danificam as bactérias que medeiam a transformação (por exemplo, Agrobacterium) e constituem um método de biossíntese económico e eficaz.

Transformação celular assistida por ultrassons

A sonicação é uma técnica que aplica ondas ultrassónicas de baixa frequência para agitar partículas em solução e misturar soluções, aumentando assim a velocidade de transferência de massa e de dissolução. Simultaneamente, a sonicação pode remover gases dissolvidos dos líquidos. Na transformação de plantas, a sonicação provocará a formação de microlesões no tecido vegetal e melhorará a introdução de DNA nu no protoplasto vegetal.

Para a transformação genética, a transformação mediada por Agrobacterium assistida por sonicação (SAAT) é o método preferido e tem uma eficiência significativamente superior à da sonicação utilizada para transferir DNA nu e vetores de DNA diretamente para o protoplasto. Numerosos estudos demonstraram que a transformação mediada por Agrobacterium assistida por sonicação (SAAT) pode ser utilizada para induzir rutura mecânica e formação de lesões nas células vegetais através de ondas ultrassónicas e da cavitação acústica resultante. Um tratamento ultrassónico breve cria microlesões na superfície dos explantes. As células lesionadas permitirão a penetração de Agrobacterium nas partes mais profundas dos tecidos vegetais, aumentando assim a probabilidade de as células vegetais serem infetadas. Além disso, os compostos fenólicos secretados potenciam a transformação. As microlesões geradas por ultrassons também tornam mais viável a penetração de bactérias nos explantes. A SAAT foi utilizada com sucesso para a transformação genética de espécies vegetais consideradas particularmente resistentes a Agrobacterium.
As principais vantagens da SAAT são o facto de ser um método muito simples e económico, bem como o aumento significativo da transferência de genes mediada por Agrobacterium. Além da aplicação bem-sucedida da SAAT na transformação de Chenopodium rubrum L. e Beta vulgaris L., esta abordagem também foi aplicada à produção de holotoxina termolábil recombinante de Escherichia coli de tipo selvagem e de adjuvantes vacinais LT mutantes de Escherichia coli em Nicotiana tabacum, tendo sido detetados em aves os títulos sistémicos mais elevados de IgG específica para LT-B.
(cf. Laere et al., 2016; M. Klimek-Chodacka e R. Baranski, 2014)

Procedimento geral para a transferência de genes por sonoporação em células vegetais

1. Preparação do material genético: Comece por preparar o material genético que pretende introduzir nas células vegetais. Este poderá ser DNA plasmídico, RNA ou outros ácidos nucleicos.
2. Isolamento de células vegetais: Isole as células vegetais que pretende atingir. Dependendo da sua experiência, estas células podem ser isoladas de tecidos ou culturas vegetais.
3. Suspensão celular: Suspenda as células vegetais num meio ou numa solução tampão adequados. Isto é essencial para garantir que as células estão saudáveis e num estado propício à captação de genes.
4. Configuração do sonicador: Prepare o seu sonicador de sonda, predefinindo parâmetros de sonicação como a amplitude, o tempo, a energia e a temperatura. Mergulhe a sonda ultrassónica na suspensão celular.
5. Sonicação: Inicie o procedimento de sonicação. A oscilação rápida da ponta da sonda gera bolhas de cavitação no líquido. Estas bolhas expandem-se e colapsam devido às ondas ultrassónicas, criando forças mecânicas e microcorrentes na suspensão.
6. Sonoporação: As forças mecânicas e as microcorrentes geradas pela cavitação criam temporariamente poros e orifícios nas membranas das células vegetais. O material genético presente na suspensão pode entrar nas células vegetais através destes poros.
7. Incubação: Após o tratamento de sonoporação, incube as células vegetais para permitir que recuperem e estabilizem as suas membranas. Este é um passo crucial para garantir a sobrevivência celular e uma transferência de genes bem-sucedida.

Transferência de genes através de Agrobacterium ou lipossomas

Existem duas formas comuns de transfetar células vegetais. Utilizam Agrobacterium, um género de bactérias Gram-negativas, ou lipossomas como transportadores do material genético.

• Sonoporação mediada por Agrobacterium: Agrobacterium tumefaciens é uma bactéria frequentemente utilizada na engenharia genética de plantas. Neste método, o DNA plasmídico que contém o gene pretendido é introduzido em Agrobacterium, que é depois misturada com células vegetais. A suspensão celular é submetida a sonoporação utilizando um sonicador de sonda. A energia ultrassónica potencia a transferência do material genético de Agrobacterium para as células vegetais. Este método é amplamente utilizado para a modificação genética de plantas.
• Sonoporação mediada por lipossomas: Os lipossomas são vesículas à base de lípidos que podem transportar material genético. Neste método, os lipossomas carregados com DNA plasmídico ou outros ácidos nucleicos são misturados com células vegetais. Utiliza-se a sonoporação com um sonicador de sonda para facilitar a captação dos lipossomas pelas células vegetais. Os ultrassons rompem as bicamadas lipídicas dos lipossomas, libertando o material genético para as células vegetais. Esta abordagem é útil para estudos de expressão génica transitória em células vegetais.

Benefícios cientificamente comprovados da transformação mediada por Agrobacterium assistida por sonicação (SAAT)

A transformação mediada por Agrobacterium assistida por sonicação (SAAT) foi aplicada a numerosas espécies vegetais. Um tratamento ultrassónico breve e relativamente suave de culturas de células vegetais provoca sonoporação, que permite subsequentemente uma penetração profunda de Agrobacterium como transportador de genes. Abaixo pode ler exemplos de estudos que demonstram os efeitos benéficos da SAAT.

Transformação de ashwagandha assistida por ultrassons

Para melhorar a eficiência da transformação em W. somnifera (conhecida como ashwagandha ou cereja-de-inverno), Dehdashti e colegas (2016) investigaram a utilização de acetosiringona (AS) e sonicação.
A acetosiringona (AS) foi adicionada em três fases: cultura líquida de Agrobacterium, infeção por Agrobacterium e cocultura de explantes com Agrobacterium. Verificou-se que a adição de 75 μM AS à cultura líquida de Agrobacterium era ótima para a indução dos genes vir.
A aplicação adicional de sonicação (SAAT) resultou na expressão génica mais elevada. Verificou-se que a expressão do gene gusA em raízes pilosas era a melhor quando as folhas e os ápices dos rebentos eram sonicados durante 10 e 20s, respetivamente. A eficiência da transformação do protocolo melhorado foi de 66,5 e 59,5% no caso dos explantes de folhas e de ápices dos rebentos, respetivamente. Em comparação com outros protocolos, verificou-se que a eficiência da transformação deste protocolo melhorado era 2,5 vezes superior para as folhas e 3,7 vezes superior para os ápices dos rebentos. As análises por Southern blot confirmaram 1–2 cópias do transgene gusA nas linhas W1-W4, enquanto foram detetadas 1–4 cópias do transgene na linha W5 gerada pelo protocolo melhorado.

Efeito da duração da transformação mediada por Agrobacterium assistida por sonicação (SAAT) na frequência de transformação de explantes de folhas (a) e de ápices dos rebentos (b) de W. somnifera
(estudo e gráfico: © Dehdashti et al., 2016)

Transformação do algodão assistida por ultrassons

Hussain et al. (2007) demonstram os efeitos benéficos da transformação do algodão assistida por sonicação. A cavitação acústica causada por ultrassons de baixa frequência cria microlesões à superfície e abaixo da superfície do tecido vegetal (sonoporação) e permite que Agrobacterium penetre mais profundamente e percorra completamente todo o tecido vegetal. Esta forma de lesão aumenta a probabilidade de infetar células vegetais situadas em zonas mais profundas do tecido. Para avaliar a eficiência da transformação por SAAT, mediu-se a expressão do gene GUS. O sistema repórter GUS é um sistema de genes repórter particularmente útil em biologia molecular vegetal e microbiologia. Ao ajustar vários parâmetros da SAAT, a expressão transitória de GUS no algodão, utilizando embriões maduros como explantes, aumentou significativamente. O GUS foi detetado pela primeira vez 24h após a incubação dos explantes e, às 48h, a expressão de GUS era muito intensa, o que serviu como um indicador útil da transformação bem-sucedida do explante de algodão após a transformação mediada por Agrobacterium assistida por sonicação (SAAT). Na comparação de várias técnicas de transformação (nomeadamente biolística, Agro, BAAT e SAAT), a transformação mediada por Agrobacterium assistida por sonicação (SAAT) apresentou, de longe, os melhores resultados de transformação.

Escolha do procedimento de transformação com base na expressão transitória de GUS. A transformação mediada por Agrobacterium assistida por sonicação (SAAT) apresenta uma expressão transitória significativamente mais elevada.
(estudo e gráfico: © Hussain et al., 2007)

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