Vacinas virais baseadas em cultura celular – Rompimento celular eficiente por sonicação

Perguntas frequentes sobre a ruptura celular por ultrassons para a produção de vacinas à base de vírus

O que é a disrupção celular por ultrassons?

A ruptura celular por ultrassons utiliza ultrassons de alta intensidade, normalmente na gama de 20 a 30 kHz, para romper as membranas celulares e libertar o material intracelular. As ondas de ultrassons de alta potência criam bolhas de cavitação no líquido. Quando estas bolhas colapsam, geram intensas forças de cisalhamento locais e microcorrentes que rompem mecanicamente as células e promovem a transferência de massa entre o interior da célula e o meio circundante. Na produção de vacinas, este processo é utilizado para lisar culturas celulares infectadas por vírus e para libertar partículas virais intracelulares e associadas à membrana para a colheita.

Por que razão se recorre à sonicação em vez da lise química ou enzimática para a recolha de vírus?

A sonicação funciona com forças puramente mecânicas. Não são necessários detergentes, lisozima, proteinase K ou outros reagentes de lise que possam alterar o lisado, interferir com a purificação posterior ou que tenham de ser removidos antes do processamento subsequente. Os reagentes químicos requerem normalmente uma preparação demorada em várias etapas para evitar a inibição de ensaios subsequentes e de outras etapas de pós-processamento. A lise enzimática requer longos tempos de incubação e, frequentemente, produz resultados não reprodutíveis. A lise ultrassónica também combina as etapas de ressuspensão, ruptura e extração numa única operação contínua. Quando o seu processo requer uma etapa assistida por detergente ou enzima, a sonicação intensifica-a em vez de a substituir: a cavitação enfraquece as membranas e melhora a exposição uniforme de todas as células ao reagente.

Em que medida a sonicação se compara aos métodos de homogeneização mecânica?

Os sonicadores do tipo sonda transferem a energia ultrassónica de forma direta e eficiente, uma vez que o sonotrodo está em contacto direto com a amostra. As técnicas de homogeneização de acionamento mecânico resultam frequentemente numa menor eficiência na transferência de energia. O processamento ultrassónico não requer esferas de moagem consumíveis nem vedantes rotativos no fluxo do produto, nem bicos ou câmaras que possam entupir-se com massa celular viscosa, nem contaminação cruzada entre lotes.

A sonicação pode danificar o vírus ou o antigénio?

Esta é a principal tarefa de otimização e é controlável. Ao ajustar os parâmetros do processamento ultrassónico, os efeitos da sonicação podem ser controlados com precisão: uma amplitude baixa e uma sonicação curta produzem efeitos muito suaves, enquanto amplitudes elevadas, pressão elevada e uma duração de sonicação mais longa resultam num processamento intenso. Uma vez que a intensidade pode ser ajustada exatamente à amostra biológica, evita-se o processamento excessivo, a degradação e a perda de rendimento. Na prática, a amplitude, o tempo de permanência e o número de passagens são definidos para o mínimo necessário para atingir a taxa de disrupção pretendida, com monitorização contínua da temperatura e arrefecimento.

O tratamento por ultrassons reduz a viscosidade da colheita?

Sim. As colheitas densas, com elevada densidade celular, são viscosas e difíceis de bombear devido ao ADN da célula hospedeira libertado e não fragmentado. O tratamento ultrassónico corta e fragmenta o ADN e o ARN, solubiliza a massa celular e desaglomera os resíduos celulares. O resultado é uma suspensão homogénea e bombeável que facilita de forma mais eficiente os processos de clarificação, centrifugação e cromatografia. A fragmentação do ADN e do ARN por sonicação controlada é uma aplicação laboratorial bem estabelecida da mesma tecnologia.

Posso executar o processo em modo contínuo em linha?

Sim. Os sonicadores da Hielscher foram concebidos para um funcionamento contínuo 24 horas por dia, 7 dias por semana, em ambientes industriais e podem ser configurados com células de fluxo e reatores para sonicação contínua em linha, circuitos de recirculação ou integração em plataformas de produção e linhas de processamento. São possíveis tanto a operação de passagem única como a de múltiplas passagens.

Como é que passo da fase de laboratório para a produção?

De forma linear, com base na energia de entrada mensurável. Todos os resultados de sonicação obtidos com um homogeneizador ultrassónico da Hielscher podem ser ampliados linearmente para rendimentos mais elevados na produção industrial; os parâmetros de sonicação desenvolvidos com um sonicador de bancada podem ser transferidos diretamente para sistemas maiores da Hielscher. O critério de aumento de escala é a entrada de energia específica por volume, juntamente com a amplitude, o tempo de residência e a temperatura. A consultoria de processos da Hielscher inclui recomendações para a otimização de parâmetros (amplitude, energia específica E/V, tempo de residência, temperatura e controlo de pressão) associadas à entrada de energia mensurável.

A disrupção celular por ultrassons é adequada para a produção em salas limpas e de acordo com as boas práticas de fabrico (GMP)?

Os ultrassonificadores da Hielscher podem ser facilmente instalados em laboratórios de sala limpa e instalações de produção. As caixas são fabricadas em plástico antibacteriano ou aço inoxidável. Todas as peças em contacto com o fluido, tais como sonotrodos e células de fluxo, são fabricadas em titânio ou aço inoxidável e podem ser submetidas a autoclavagem. Estão disponíveis reatores especiais com células de fluxo que cumprem requisitos avançados de CIP (limpeza no local) e SIP (esterilização no local). O transdutor da série industrial UIP possui classificação IP64 e pode ser instalado em ambientes exigentes, enquanto o gerador é colocado remotamente. Uma vez que os sonicadores da Hielscher convertem energia elétrica em oscilação mecânica com uma eficiência muito elevada, de aproximadamente 80–90%, desde a tomada elétrica até ao líquido, o transdutor pode ser integrado em caixas fechadas sem aberturas de ventilação, não sendo necessário qualquer arrefecimento forçado, como ar comprimido ou água. Isto também significa que nenhum meio de arrefecimento entra em contacto com o processo. A documentação automática do processo apoia a rastreabilidade e a reprodutibilidade na produção regulamentada.

A sonicação também pode inativar o vírus para uma vacina inativada?

Sim. O ultrassom de alta potência é utilizado na inativação de agentes patogénicos, tais como bactérias e vírus. Com a dose e a intensidade adequadas de sonicação, as células e os micróbios podem ser tratados de acordo com o objetivo do processo, pelo que a mesma plataforma permite tanto a lise para colheita como a inativação. A combinação de sonicação e calor, conhecida como termo-sonicação, oferece uma taxa de esterilização mais rápida com intensidade térmica e duração significativamente reduzidas, o que é vantajoso para preservar compostos sensíveis ao calor, tais como proteínas e antigénios. A inativação por ultrassons é geralmente utilizada em combinação com métodos químicos de inativação já estabelecidos, e a cinética completa da inativação deve ser validada para cada vírus específico.

É possível utilizar o mesmo sistema nas etapas de formulação após a colheita?

Sim. A mesma plataforma permite a dispersão de antigénios em suspensões, polímeros ou encapsulamentos lipossomais, a desaglomeração e distribuição uniforme de antigénios e adjuvantes à base de alumínio, como o Alhydrogel™, a formulação de vacinas em lipossomas e nanopartículas lipídicas sólidas com controlo preciso do tamanho do veículo, e a etapa de desgaseificação antes do enchimento em frascos ou seringas.