Verbeter HPLC-analyse met betrouwbare monstervoorbereiding
Hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC) blijft een van de belangrijkste analytische technieken voor de identificatie en kwantificering van verbindingen in complexe matrices. Van farmaceutische kwaliteitscontrole tot milieumonitoring en voedingsmiddelenanalyse worden HPLC-methoden gewaardeerd om hun gevoeligheid, selectiviteit en reproduceerbaarheid. De betrouwbaarheid van chromatografische gegevens hangt echter sterk af van één cruciale stap: de monstervoorbereiding voor HPLC.
Onderzoek en routinematige monstervoorbereiding tonen aan dat extractie en monstervoorbereiding met behulp van sonicatie de efficiëntie, nauwkeurigheid en snelheid van HPLC-analyse aanzienlijk verbeteren. Door ultrasone energie te gebruiken om matrices open te breken en de overdracht van analyten naar oplosmiddelen te bevorderen, kunnen laboratoria hogere terugwinningspercentages, kortere extractietijden en beter reproduceerbare analyseresultaten verkrijgen.
Waarom monstervoorbereiding belangrijk is bij HPLC
In veel analytische werkprocessen bevat de monstermatrix – zoals plantaardig materiaal, biologisch weefsel, bodem of water – complexe mengsels van verbindingen die de chromatografische scheiding kunnen verstoren. Efficiënte monstervoorbereiding is daarom nodig om analyten te isoleren, storende stoffen te verwijderen en de doelverbindingen te concentreren voordat ze in het HPLC-systeem worden geïnjecteerd.
Traditionele extractietechnieken omvatten vaak langdurige procedures, grote hoeveelheden organische oplosmiddelen en meerdere zuiveringsstappen. Deze methoden kunnen variabiliteit introduceren, de operationele kosten verhogen en de totale analysetijd verlengen.
Ultrasone monstervoorbereiding biedt een effectief alternatief. Sonicatie brengt hoogfrequente akoestische energie in een vloeibaar medium, waardoor microscopische cavitatiebellen ontstaan. Wanneer deze bellen imploderen, genereren ze plaatselijke afschuifkrachten en micromengeffecten die vaste matrices openbreken en de massaoverdracht versnellen. Dit proces verbetert de extractie-efficiëntie aanzienlijk.
Sonicator UIP400MTP met hoge verwerkingscapaciteit met buisjesrek voor autosamplervials
Wetenschappelijk bewijs: sonicatie verbetert de analytische prestaties
Verschillende collegiaal getoetste studies hebben de voordelen van ultrasone extractie in werkprocessen voor HPLC aangetoond.
Zo werd in een methode die was ontwikkeld voor het monitoren van pesticideresiduen in watermonsters sonicatie gecombineerd met analyse met LC–MS/MS om de concentraties van het pesticide carbaryl te bepalen. Bij deze aanpak werden watermonsters vóór de chromatografische analyse onder ultrasone behandeling met acetonitril geëxtraheerd. De methode behaalde sterke analytische prestaties, waaronder terugwinningspercentages tussen 89,53% en 101,72%, waarmee de nauwkeurigheid en betrouwbaarheid van de ultrasone monstervoorbereidingsprocedure werden bevestigd.
De ultrasone extractiestap maakte een efficiënte overdracht van analyten vanuit de waterige matrix naar het organische oplosmiddel mogelijk, waardoor het oplosmiddelenverbruik afnam en uitgebreide zuiveringsprocedures overbodig werden. De gevalideerde analysemethode vertoonde uitstekende lineariteit, precisie en kwantificeringsgrenzen, wat de effectiviteit van sonicatie in moderne chromatografische werkprocessen onderstreept. (zie Roudani et al., 2018)
Een andere studie introduceerde ultrasoon ondersteunde matrixdispersie in de vaste fase (UA-MSPD) voor de bepaling van oleuropeïne in olijfbladeren met HPLC-analyse. Bij deze techniek werden plantenpoeder en sorbentmateriaal gemengd en vervolgens tijdens de elutiestap blootgesteld aan ultrasone golven. Het ultrageluid bevorderde de desorptie van analyten van het sorbentoppervlak en verbeterde tegelijkertijd de extractie uit de monstermatrix. (zie Rashidipour en Heydari, 2018)
De geoptimaliseerde ultrasone procedure leverde aanzienlijke analytische verbeteringen op, waaronder:
- Lineaire kalibratiecurven met R² = 0,9979
- Detectiegrenzen van slechts 0,03 µg mL⁻¹
- Terugwinningspercentages tussen 90,2% en 96,7%
Deze resultaten bevestigen dat ultrasoon ondersteunde extractie niet alleen de monstervoorbereiding versnelt, maar ook de extractieopbrengst verhoogt ten opzichte van klassieke technieken voor matrixdispersie in de vaste fase.
Sonicator UP200St met probe voor monstervoorbereiding voor HPLC
Belangrijkste voordelen van ultrasone monstervoorbereiding voor HPLC
Het toenemende gebruik van ultrasone extractie in analytische laboratoria wordt gestimuleerd door verschillende meetbare voordelen.
- Hogere extractie-efficiëntie
Akoestische cavitatie breekt vaste matrices af en verbetert het binnendringen van oplosmiddelen. Dit bevordert het vrijkomen van analyten en verhoogt de terugwinningspercentages, met name voor verbindingen die in sporenconcentraties aanwezig zijn in complexe monsters. - Kortere monstervoorbereidingstijd
Met ultrasone extractie kan de monstervoorbereiding vaak binnen enkele seconden of minuten worden voltooid. Zo werd met geoptimaliseerde ultrasone extractieparameters bij UA-MSPD een efficiënte terugwinning van analyten bereikt na ongeveer 30 seconden sonicatie, wat aantoont hoe sterk analytische werkprocessen kunnen worden versneld. - Lager oplosmiddelenverbruik
Omdat ultrageluid de massaoverdracht bevordert, zijn doorgaans kleinere hoeveelheden oplosmiddelen nodig. Minder oplosmiddelengebruik verbetert de duurzaamheid van het laboratorium en verlaagt de operationele kosten. - Verbeterde reproduceerbaarheid
Een uniforme verdeling van ultrasone energie zorgt voor een consistente ontsluiting en extractie van monsters bij herhalingen, wat leidt tot een betere precisie van analytische metingen. - Compatibiliteit met moderne chromatografische methoden
Ultrasone extractie kan eenvoudig worden geïntegreerd met systemen voor HPLC, UHPLC en LC-MS, waardoor deze geschikt is voor analytische omgevingen met een hoge verwerkingscapaciteit.
HPLC-chromatogram van fenolische verbindingen uit een ultrasoon geïsoleerd extract van bladeren van Annona muricata, verkregen met de sonicator UP400S.
(Studie en afbeelding: ©Nolasco-González et al., 2022)
Praktische sonicatieoplossingen voor monstervoorbereiding voor HPLC
Voor laboratoria die ultrasone extractie toepassen, bieden sonicators van Hielscher nauwkeurige controle over parameters zoals amplitude, tijd en pulsmodus. Daarom zijn laboratoriumsonicators van Hielscher bijzonder geschikt voor analytische laboratoria.
Kies de meest geschikte laboratoriumsonicator voor uw HPLC-monsters
| Sonicator-model | Voordelen voor HPLC | Meest geschikte toepassingen bij monstervoorbereiding voor HPLC |
| Sonicator VialTweeter voor meerdere buisjes |
• Gelijktijdige sonicatie van maximaal 10 afgesloten vials met identieke ultrasone energie • Steriel: geen kruisbesmetting doordat de monsters afgesloten blijven • Zeer goed reproduceerbare extractieomstandigheden tussen batches • Efficiënte cavitatie voor analytische monsters met een klein volume |
• Voorbereiding van milieu-, voedingsmiddelen- of farmaceutische monsters met een hoge verwerkingscapaciteit • Extractie van analyten in sporenconcentraties voorafgaand aan analyse met HPLC, UHPLC of LC-MS • Gestandaardiseerde werkprocessen die een identieke behandeling van meerdere monsters vereisen |
| Microplaatsonicator UIP400MTP |
• Contactloze sonicatie van volledige microplaten (formaten met 96 of 384 wells) • Uniforme verdeling van ultrasone energie over alle wells • Maakt automatisering en robotintegratie voor analytische werkprocessen mogelijk • Hoge verwerkingscapaciteit met nauwkeurige controle over amplitude en sonicatietijd |
• UHPLC-screeningsprocessen met een hoge verwerkingscapaciteit • Farmaceutische verbindingenbibliotheken en monstervoorbereiding voor metabolomica • Extractie in platen voor analytische procesketens met LC-MS of UHPLC |
| Laboratoriumsonicators met microtip (directe sonicatie) |
• Maximale ultrasone intensiteit voor efficiënte matrixontsluiting • Zeer snelle extractie van analyten uit vaste, viskeuze of heterogene monsters • Instelbare amplitude en pulsparameters voor geoptimaliseerde extractieomstandigheden • Hoge cavitatie-energie verbetert de terugwinning van analyten en de extractieopbrengst |
• Extractie uit moeilijke matrices zoals plantenweefsel, voedingsmiddelenmonsters of polymeren • Homogenisatie voorafgaand aan SPE, filtratie of vloeistof–vloeistofextractie • Methodeontwikkeling voor ultrasone monstervoorbereiding voor HPLC |
| CupHorn (“bad met hoge intensiteit” voor bekerglazen en buisjes) |
• Indirecte sonicatie voorkomt probecontaminatie • Uniform ultrasoon veld voor meerdere buisjes tegelijk • Ideaal voor steriele, gevaarlijke of vluchtige monsters die afgesloten moeten blijven • Vereenvoudigt de hantering met behoud van sterke cavitatie-energie |
• Parallelle extractie van meerdere HPLC-monsters in afgesloten centrifugebuisjes • Voorbereiding van biologische, farmaceutische of milieumonsters • Werkprocessen waarbij contaminatievrije indirecte sonicatie vereist is |
Wetenschappelijke relevantie voor de analytische chemie
Nu de analytische chemie zich ontwikkelt naar snellere en duurzamere laboratoriumpraktijken, is ultrasone monstervoorbereiding een krachtige faciliterende technologie geworden. Sonicatie ondersteunt de ontwikkeling van snelle analytische methoden met een lager oplosmiddelenverbruik, verbeterde extractie-efficiëntie en robuuste validatieparameters.
De groeiende hoeveelheid literatuur over ultrasone extractie toont aan dat monstervoorbereiding voor HPLC met behulp van sonicatie niet slechts een gemak is – het is een wetenschappelijk gevalideerde aanpak die de analytische prestaties verbetert. Door ultrasone extractie te combineren met moderne chromatografische technieken kunnen laboratoria analyten in sporenconcentraties betrouwbaar detecteren in steeds complexere monstermatrices.
HPLC-werkprocessen verbeterd door sonicatie
Door de voortdurende vooruitgang in analytische instrumentatie en technologieën voor monstervoorbereiding zal ultrasone extractie waarschijnlijk een nog grotere rol gaan spelen in chromatografische laboratoria. Het vermogen om werkprocessen te stroomlijnen, de gegevenskwaliteit te verbeteren en de milieubelasting te verminderen sluit goed aan bij de veranderende eisen van de moderne analytische wetenschap.
Voor analytisch chemici en industriële laboratoria die de monstervoorbereiding voor HPLC willen optimaliseren, biedt ultrasone extractie een bewezen, schaalbare en wetenschappelijk robuuste oplossing. Door sonicatie te integreren in routineprotocollen voor monstervoorbereiding kunnen laboratoria zowel de efficiëntie als de betrouwbaarheid van chromatografische analyse aanzienlijk verbeteren.
Ontwerp, productie en advies – kwaliteit uit Duitsland
Sonicators van Hielscher staan bekend om hun hoogste kwaliteits- en ontwerpnormen. Dankzij hun robuustheid en eenvoudige bediening kunnen onze sonicators probleemloos in industriële installaties worden geïntegreerd. Sonicators van Hielscher kunnen zware omstandigheden en veeleisende omgevingen gemakkelijk aan.
Hielscher Ultrasonics is een ISO-gecertificeerd bedrijf en legt bijzondere nadruk op sonicators met hoge prestaties, de modernste technologie en gebruiksvriendelijkheid. Uiteraard voldoen sonicators van Hielscher aan de CE-voorschriften en aan de eisen van UL, CSA en RoHs.
Literatuur / referenties
- M. Rashidipour and R. Heydari (2018): Ultrasonic-Assisted Matrix Solid-Phase Dispersion and High-Performance Liquid Chromatography as an Improved Methodology for Determination of Oleuropein from Olive Leaves. Analytical and Bioanalytical Chemistry Research 52, 2018. 307-316.
- Roudani, A.; Rachid, Mamouni; Nabil, Saffaj; Laknifli, A.; Gharby, Said; Noureddine, El Baraka; Bakka, Abdelhamid; Abdellah, Faouzi (2018): Method validation in the determination of Carbaryl pesticide in water samples using sonication and liquid chromatography-tandem mass spectrometry. JMES 8 (7), 2017. 2409-2420.
- Bimakr M., Ganjloo A., Zarringhalami S., Ansarian E. (2017): Ultrasound-assisted extraction of bioactive compounds from Malva sylvestris leaves and its comparison with agitated bed extraction technique. Food Science and Biotechnology 2017 Nov 30;26(6):1481-1490.
Veelgestelde vragen
Wat is HPLC?
Hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC) is een analytische scheidingstechniek die wordt gebruikt om componenten in een mengsel te identificeren, te kwantificeren en te zuiveren. Bij HPLC voert een vloeibare mobiele fase opgeloste analyten onder hoge druk door een kolom die met een stationaire fase is gepakt. Verschillen in de interacties tussen de analyten, de stationaire fase en de mobiele fase zorgen ervoor dat de verbindingen worden gescheiden terwijl ze door de kolom bewegen. Detectoren op basis van bijvoorbeeld UV-Vis, fluorescentie of massaspectrometrie meten de gescheiden verbindingen, waardoor nauwkeurige kwalitatieve en kwantitatieve analyse mogelijk is.
Welke soorten vloeistofchromatografie zijn er?
Vloeistofchromatografie kan worden ingedeeld op basis van het scheidingsmechanisme tussen de analyt, de stationaire fase en de mobiele fase. De meest voorkomende soorten zijn omgekeerde-fasechromatografie, waarbij een apolaire stationaire fase verbindingen scheidt op basis van hydrofobe interacties; normale-fasechromatografie, waarbij een polaire stationaire fase wordt gebruikt en verbindingen worden gescheiden op basis van polariteit; ionenuitwisselingschromatografie, waarbij geladen stationaire fasen analyten scheiden op basis van ionische interacties; en grootte-uitsluitingschromatografie, waarbij moleculen worden gescheiden op basis van hun hydrodynamische grootte en molecuulgewicht. Aanvullende gespecialiseerde methoden zijn onder andere affiniteitschromatografie en hydrofiele-interactiechromatografie (HILIC), die gericht zijn op specifieke moleculaire interacties of polaire verbindingen.
Welke vials worden gebruikt voor HPLC?
Bij HPLC-analyses worden doorgaans kleine glazen of polymeervials gebruikt die zijn ontworpen om voorbereide monsters te bevatten voordat deze in het chromatografische systeem worden geïnjecteerd. Het meest voorkomende formaat is de 2-mL-autosamplervial, die compatibel is met de meeste HPLC-autosamplers. Deze vials worden meestal gemaakt van borosilicaatglas om chemische bestendigheid en minimale interactie met oplosmiddelen en analyten te waarborgen. Afhankelijk van het monstertype kunnen vials voorzien zijn van inserts voor monsters met een klein volume, schroefdoppen of krimpsluitingen en septa van materialen zoals PTFE/silicone om de monsterintegriteit te behouden.
Wat zijn autosamplervials?
Autosamplervials zijn gespecialiseerde monsterhouders die zijn ontworpen voor geautomatiseerde injectiesystemen in HPLC- en UHPLC-instrumenten. Ze bevatten de voorbereide monsteroplossing en worden in de autosamplertray van het instrument geplaatst, waar het systeem automatisch een vastgesteld volume opneemt voor injectie in de chromatografische kolom. Autosamplervials worden met nauwkeurige afmetingen vervaardigd om compatibiliteit met gerobotiseerde monsterafnamenaalden te waarborgen en verdamping, contaminatie of adsorptie van het monster tot een minimum te beperken. Hun ontwerp maakt reproduceerbare analyse met een hoge verwerkingscapaciteit mogelijk in moderne chromatografische laboratoria.
Wat zijn de stappen bij HPLC?
Het gebruikelijke werkproces voor hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC) bestaat uit verschillende opeenvolgende stappen die een betrouwbare scheiding en detectie van analyten waarborgen.
- Eerst wordt het monster voorbereid om de analyt op te lossen, deeltjes te verwijderen en vaak doelverbindingen uit de monstermatrix te extraheren of te concentreren. Deze stap kan filtratie, verdunning of extractietechnieken omvatten, zoals ultrasone extractie, vastefase-extractie of vloeistof–vloeistofextractie.
- Vervolgens wordt het voorbereide monster in een HPLC-vial geplaatst en in de autosampler geladen. De autosampler injecteert een nauwkeurig volume van het monster in de stromende mobiele fase.
- Daarna wordt het geïnjecteerde monster tijdens de toevoer van de mobiele fase met een hogedrukpomp door het systeem getransporteerd. De mobiele fase voert de analyten met een gecontroleerd debiet door de chromatografische kolom.
- In de chromatografische kolom vindt de scheiding plaats. De kolom bevat een stationaire fase, doorgaans gepakte deeltjes met gedefinieerde chemische eigenschappen. Terwijl de analyten door de kolom bewegen, gaan ze verschillende interacties aan met de stationaire fase en de mobiele fase, waardoor ze op verschillende tijdstippen elueren.
- Na de scheiding passeren de verbindingen een detector, zoals een UV-Vis-, fluorescentie- of massaspectrometriedetector. De detector meet de aanwezigheid en concentratie van de eluerende verbindingen en zet het signaal om in elektronische gegevens.
- Tot slot worden gegevensverzameling en analyse uitgevoerd met chromatografiesoftware. Het systeem genereert een chromatogram waarin de pieken overeenkomen met afzonderlijke verbindingen. De retentietijden van de pieken helpen bij het identificeren van analyten, terwijl de piekoppervlakken of -hoogten een kwantitatieve bepaling van hun concentratie mogelijk maken.
Hielscher Ultrasonics produceert ultrasone homogenisatoren met hoge prestaties van laboratoriumformaat tot industrieel formaat.