მიკროპლატაზე სონიკაცია შოტგან პროტეომიკაში – გამოყენების შენიშვნა
შოტგან პროტეომიკა დამოკიდებულია ნიმუშების ეფექტურ, რეპროდუცირებად მომზადებაზე, რათა რთული ბიოლოგიური მასალა LC-MS/MS ანალიზისთვის მზა პეპტიდებად გარდაიქმნას. UIP400MTP მიკროფირფიტის სონიკატორი ამ პროცესს ხელს უწყობს მცირე მოცულობის ნიმუშების სტანდარტიზებული, პარალელური ულტრაბგერითი დამუშავებით, რაც ლაბორატორიებს მიკროფირფიტებზე დაფუძნებულ სამუშაო პროცესებში დაშლის, ექსტრაქციისა და ხელახალი გახსნის გაუმჯობესებაში ეხმარება. გამოყენების ეს აღწერა განმარტავს, თუ როგორ შეიძლება UIP400MTP-ის ინტეგრირება პროტეომული ნიმუშების მომზადებაში; ლაბორატორიულად გამოცდილი მაგალითის სახით გამოყენებულია PLA2G12A/Th17 კვლევებში გამოქვეყნებული უჯრედგარე ვეზიკულების დამუშავების პროცესი.
მიკროფირფიტების ულტრაბგერითი დამუშავება უფრო რეპროდუცირებადი შოტგან პროტეომიკისთვის
პროტეომიკის მკვლევრებისთვის ნიმუშების რეპროდუცირებადი მომზადება გადამწყვეტია მაღალი ხარისხის LC-MS/MS მონაცემების მისაღებად. UIP400MTP მიკროფირფიტის სონიკატორი უზრუნველყოფს სტანდარტიზებულ, პარალელურ ულტრაბგერით დამუშავებას ფირფიტებზე დაფუძნებულ და მცირე მოცულობის/მაღალი გამტარუნარიანობის სამუშაო პროცესებში.
ეს განსაკუთრებით სასარგებლოა ლაბორატორიებისთვის, რომლებიც მუშაობენ:
- ნიმუშების დიდ ნაკრებებთან, რომლებიც მრავალ ფოსოში ერთგვაროვან დამუშავებას საჭიროებს
- მცირე საწყისი რაოდენობის მასალასთან, რომლისთვისაც ნიმუშის დანაკარგი და ცვალებადობა მინიმუმამდე უნდა შემცირდეს
- ლიპიდებით მდიდარ ნიმუშებთან, როგორიცაა უჯრედგარე ვეზიკულები
- რთულ ბიოლოგიურ პრეპარატებთან, რომლებიც საჭიროებს ეფექტურ დაშლას, ექსტრაქციას ან ხელახლა გახსნას
- შედარებით შოტგან პროტეომიკაზე, სადაც სხვადასხვა პირობასა და განმეორებით ნიმუშს შორის რეპროდუცირებადობა აუცილებელია
ფერმენტულ დაშლამდე მიკროფირფიტებზე ულტრაბგერითი დამუშავების ინტეგრირებით მკვლევრებს შეუძლიათ გააუმჯობესონ ნიმუშების მზადყოფნა შემდეგი ეტაპებისთვის:
- ცილების ექსტრაქცია და ხელახლა გახსნა
- ტრიპსინით/Lys-C-ით ფერმენტული დაშლა
- Nano-LC/MS/MS მონაცემების მიღება
- შემდგომი რაოდენობრივი პროტეომული ანალიზი
შეიტყვეთ, როგორ ეხმარება მიკროფირფიტებზე ულტრაბგერითი დამუშავება ხელით დამუშავებით გამოწვეული ცვალებადობის შემცირებას, ნიმუშების დაშლის გაუმჯობესებასა და რთული ბიოლოგიური ნიმუშების მომზადებას საიმედო LC-MS/MS ანალიზისთვის.
მიკროფირფიტებზე ულტრაბგერითი დამუშავება შეიძლება სასარგებლო იყოს შემდეგი ჯგუფებისთვის:
- პროტეომიკის საერთო სარგებლობის ცენტრალური ლაბორატორიები
- უჯრედგარე ვეზიკულების კვლევითი ლაბორატორიები
- იმუნოლოგიისა და უჯრედული ბიოლოგიის ლაბორატორიები
- ტრანსლაციური კვლევის ჯგუფები
- სიცოცხლის მეცნიერებათა გუნდები, რომლებიც ცალკეული ნიმუშების მომზადებიდან უფრო მაღალი გამტარუნარიანობის სამუშაო პროცესებზე გადადიან
მაღალი გამტარუნარიანობის ნიმუშის მომზადება უჯრედგარე ვეზიკულების პროტეომის ანალიზისთვის
რა არის შოტგან პროტეომიკა?
შოტგან პროტეომიკა რთული ბიოლოგიური ნიმუშების დასახასიათებლად ერთ-ერთ ძირითად ანალიზურ სტრატეგიად იქცა; ასეთი ნიმუშები მოიცავს როგორც მთლიანი უჯრედების ლიზატებსა და ქსოვილის ექსტრაქტებს, ისე გასუფთავებულ ორგანელებს, უჯრედგარე ვეზიკულებსა და მცირე საწყისი რაოდენობის კლინიკურ ნიმუშებს. მისი მთავარი უპირატესობა ცილების ფერმენტული დაშლის, მაღალი გარჩევადობის თხევადი ქრომატოგრაფია–ტანდემური მას-სპექტრომეტრიისა და პეპტიდების საფუძველზე ცილების გამოთვლითი იდენტიფიკაციის გაერთიანებაა. თუმცა პროტეომის საბოლოო მონაცემთა ნაკრების ხარისხი განისაზღვრება გაცილებით ადრე, ვიდრე ნიმუში მას-სპექტრომეტრამდე მიაღწევს. ნიმუშის ეფექტური დაშლა, ცილების გახსნა, ხელშემშლელი ნივთიერებების მოცილება, რეპროდუცირებადი ფერმენტული დაშლა და პეპტიდების საიმედო მიღება გადამწყვეტია როგორც დაფარვის სიღრმისთვის, ისე რაოდენობრივი შედეგების სანდოობისთვის.
პროტეომიკის მკვლევრებისთვის და სიცოცხლის მეცნიერებათა ლაბორატორიებისთვის, რომლებიც შეზღუდული რაოდენობის ან ძვირფას ნიმუშებთან მუშაობენ, ნიმუშების მომზადება ხშირად შემაფერხებელი ეტაპია.
UIP400MTP უზრუნველყოფს ნიმუშის საიმედო მომზადებას და მარტივ ინტეგრაციას არსებულ ლაბორატორიულ სამუშაო პროცესებთან
ექსტრაცელულარულ ვეზიკულებთან დაკავშირებული გამოწვევები პროტეომიკაში
მაგალითად, უჯრედგარე ვეზიკულები (EVs) ნიმუშების განსაკუთრებით რთულად დასამუშავებელ კლასს წარმოადგენს. ეს არის მემბრანით შემოსაზღვრული, ლიპიდებით მდიდარი, ნანომასშტაბის ნაწილაკები, რომლებსაც ახასიათებს ცილის შედარებით დაბალი გამოსავლიანობა და ლიპიდების, მარილების, დეტერგენტების, შრატის ცილებისა და მატრიცის სხვა კომპონენტების თანაგადატანის მაღალი რისკი. ამ მახასიათებლებმა შეიძლება უარყოფითად იმოქმედოს ფერმენტული დაშლის ეფექტურობაზე, ქრომატოგრაფიულ მახასიათებლებზე, ელექტროსპრეის სტაბილურობასა და პეპტიდების იდენტიფიკაციაზე. ამიტომ EV პროტეომიკისთვის მომზადების პროცესი საკმარისად ეფექტური უნდა იყოს ვეზიკულური სტრუქტურების დასაშლელად და მათში არსებული ცილების გასახსნელად, ამასთან თავსებადი უნდა დარჩეს შემდგომ ფერმენტულ დაშლასა და LC-MS/MS ანალიზთან.
ამ კონტექსტში მიკროფირფიტებთან თავსებადი ულტრაბგერითი დამუშავება ნიმუშების რეპროდუცირებადი, პარალელური დამუშავების პრაქტიკულ მიდგომას წარმოადგენს. Hielscher-ის მიკროფირფიტის სონიკატორის მოდელები UIP400MTP (400 W) და UIP550MTP (550 W) განკუთვნილია მრავალფოსოიან ფირფიტებსა და მცირე მოცულობის ჭურჭელში მოთავსებული ნიმუშების ულტრაბგერითი დამუშავებისთვის და ჩვეულებრივ ერთზონდიან სონიკატორებთან შედარებით უფრო მაღალი გამტარუნარიანობის სამუშაო პროცესებს უზრუნველყოფს. პროტეომიკის ლაბორატორიებისთვის ეს ფორმატი მიმზიდველია, რადგან შეუძლია შეამციროს ხელით დამუშავებით გამოწვეული ცვალებადობა, გააუმჯობესოს მრავალი ნიმუშის პარალელური დამუშავება და უფრო ბუნებრივად ინტეგრირდეს ფირფიტებზე დაფუძნებულ ნიმუშების მომზადების პროცესებში.
სამაგალითო სამუშაო პროცესი
PLA2G12A-ით განპირობებული Th17 უჯრედების ბიოლოგიის ბოლოდროინდელ კვლევაში გამოყენებული უჯრედგარე ვეზიკულების პროტეომიკის სამუშაო პროცესი სასარგებლო, ლაბორატორიულად გამოცდილი მაგალითია იმისა, თუ როგორ შეიძლება მიკროფირფიტის სონიკატორის UIP400MTP ჩართვა შოტგან პროტეომიკისთვის ნიმუშების მომზადებაში. კვლევების ამ სერიაში EV ნიმუშები პროტეომის ანალიზისთვის მომზადდა მეთანოლით დამუშავების, UIP400MTP-ით ულტრაბგერითი დამუშავების, ცენტრიფუგირების, გაშრობის, ტრიპსინით/Lys-C-ით ფერმენტული დაშლისა და ნანონაკადური LC–მაღალი გარჩევადობის ტანდემური MS-ის გამოყენებით. ბიოლოგიური კვლევა 2026 წელს გამოაქვეყნეს Mochizuki-Ono-მ და კოლეგებმა; პროტეომულმა ანალიზმა ხელი შეუწყო იმის დახასიათებას, თუ როგორ ცვლის PLA2G12A EV-ში არსებულ ცილებს პათოგენური T-უჯრედული პასუხების კონტექსტში.
96-ფოსოიანი ფირფიტის სონიკატორი UIP400MTP ცილების მაღალი გამტარუნარიანობის ექსტრაქციისთვის
სონიკატორი: UIP400MTP მიკროფირფიტის სონიკატორი
საწყისი რაოდენობა: 5 µg EV-ის პროტეინის ექვივალენტი
ფერმენტული დაშლა: ტრიპსინი/Lys-C
ანალიზის მეთოდი: ნანო-LC-MS/MS / DIA პროტეომიკა
ნაბიჯ-ნაბიჯ ინსტრუქცია: UIP400MTP-ის დახმარებით EV ნიმუშის მომზადება შოტგან პროტეომიკისთვის
ეს სამუშაო პროცესი აღწერს მცირე საწყისი რაოდენობის უჯრედგარე ვეზიკულების (EV) ნიმუშების მომზადების მეთოდს შოტგან პროტეომიკისთვის UIP400MTP მიკროფირფიტის სონიკატორის გამოყენებით. იგი ეფუძნება გამოქვეყნებულ EV პროტეომიკის სამუშაო პროცესს, რომელშიც EV ნიმუშები ნორმალიზდებოდა, შრებოდა, მუშავდებოდა მეთანოლითა და ულტრაბგერით, ფერმენტულად იშლებოდა ტრიპსინით/Lys-C-ით, მჟავდებოდა და ანალიზდებოდა ნანო-LC-MS/MS-ით.
პროცედურა განკუთვნილია პროტეომიკის მკვლევრებისთვის და სიცოცხლის მეცნიერებათა ლაბორატორიებისთვის, რომლებიც EV-ს ან სხვა მცირე მოცულობის, ლიპიდებით მდიდარ ბიოლოგიურ ნიმუშებს ამზადებენ აღმავალი მიდგომის შოტგან პროტეომიკისთვის.
სამუშაო პროცესის მიმოხილვა
| ეტაპი | მიზანი | მთავარი შედეგი |
|---|---|---|
| EV-ს მომზადება | გამოყავით, გარეცხეთ და რაოდენობრივად განსაზღვრეთ EV ნიმუშები | EV-ის ნორმალიზებული საწყისი რაოდენობა |
| ნიმუშის გაშრობა | მოაცილეთ სითხე გამხსნელის დახმარებით დამუშავებამდე | გამშრალი EV მასალა |
| მეთანოლით დამუშავება | ლიპიდებით მდიდარი EV მასალის დაშლის ხელშეწყობა | მეთანოლით დასველებული ნიმუში |
| UIP400MTP სონიკაცია | დაშლის, ექსტრაქციისა და ჰომოგენიზაციის ხელშეწყობა | დამუშავებული EV ნიმუში |
| ფერმენტული დაშლა | EV ცილებისგან პეპტიდების წარმოქმნა | ტრიპსინით/Lys-C-ით დაშლის შედეგად მიღებული პეპტიდური ნარევი |
| LC-MS/MS ანალიზი | პეპტიდების განცალკევება, გამოვლენა და რაოდენობრივი განსაზღვრა | პროტეომიკის მონაცემთა ნაკრები |
| მონაცემთა ანალიზი | პეპტიდებისა და პროტეინების იდენტიფიკაცია და კვანტიფიკაცია | პროტეინის დონეზე შედეგები |
ნაბიჯ-ნაბიჯ პროტოკოლი
| ნაბიჯი | ინსტრუქცია | კრიტიკული პარამეტრები |
|---|---|---|
| 1 | მოამზადეთ გაწმენდილი უჯრედგარე ვეზიკულების ნიმუშები ლაბორატორიაში დამკვიდრებული გამოყოფის სამუშაო პროცესის გამოყენებით. | ამოიღეთ უჯრედები, ნამსხვრევები და ძირითადი დამაბინძურებლები პროტეომიკის მომზადებამდე. |
| 2 | რაოდენობრივად განსაზღვრეთ უჯრედგარე ვეზიკულებში ცილის შემცველობა, მაგალითად, BCA ანალიზით. | ყველა ნიმუშში საწყისი მასალის რაოდენობა ცილის თანაბარი ეკვივალენტის მიხედვით გაათანაბრეთ. |
| 3 | გადაიტანეთ 5 მკგ EV ცილის ექვივალენტი სუფთა PCR მილებში ან თავსებადი დაბალი მოცულობის მილებში. | თუ ნიმუშის დანაკარგი პრობლემას წარმოადგენს, გამოიყენეთ სინჯარები, რომელთა ზედაპირზეც ნიმუშის კომპონენტები ნაკლებად ადსორბირდება. |
| 4 | მთლიანად გააშრეთ უჯრედგარე ვეზიკულების ნიმუშები. | მოერიდეთ გადახურებას; დაადასტურეთ, რომ ხილული სითხე არ რჩება. |
| 5 | თითოეულ გამხმარ EV ნიმუშს დაამატეთ 25 µL მეთანოლი. | დარწმუნდით, რომ გამხმარი მასალა სრულად დასველებულია. |
| 6 | ნიმუშები 3 წუთის განმავლობაში დაამუშავეთ ულტრაბგერით UIP400MTP მიკროფირფიტის სონიკატორის გამოყენებით. | ყველა ნიმუშისთვის გამოიყენეთ ულტრაბგერითი დამუშავების ერთნაირი პარამეტრები და განლაგების ერთნაირი პრინციპი. |
| 7 | ულტრაბგერით დამუშავებული ნიმუშები დააცენტრიფუგირეთ 19,000 × g-ზე 20 წუთის განმავლობაში 4°C-ზე. | ცენტრიფუგირების შემდეგ არ შეარხიოთ ნალექი ან უხსნადი მასალა. |
| 8 | ფრთხილად მოაცილეთ სუპერნატანტის 20 µL. | გამოიყენეთ თანმიმდევრული პიპეტირების ტექნიკა ყველა ნიმუშში. |
| 9 | მთლიანად გააშრეთ ნიმუშის დარჩენილი მასალა. | პირდაპირ გადადით ფერმენტულ დაშლაზე ან შეინახეთ მხოლოდ ვალიდირებული პირობების დაცვით. |
| 10 | დაამატეთ 4 µL ტრიპსინის/Lys-C-ის ხსნარი, რომლის კონცენტრაციაა 100 ng/µL 50 mM ამონიუმის ბიკარბონატში. | მოამზადეთ ფერმენტის ახალი ხსნარი ან გამოიყენეთ სათანადოდ შენახული ალიკვოტები. |
| 11 | ხანმოკლედ დაამუშავეთ ულტრაბგერით, რათა გამხმარი ცილოვანი მასალა ფერმენტული დაშლის ხსნარში გაიხსნას. | ულტრაბგერითი დამუშავების შემდეგ მთელი სითხე სინჯარის ფსკერზე შეაგროვეთ. |
| 12 | ფერმენტული დაშლა ჩაატარეთ 2 საათის განმავლობაში 37°C-ზე, 300 rpm სიჩქარით შენჯღრევის პირობებში. | აორთქლების თავიდან ასაცილებლად თავსახურები მჭიდროდ დახურული შეინარჩუნეთ. |
| 13 | ფერმენტული დაშლის პროდუქტის დასამჟავებლად დაამატეთ 1 µL 1.25% TFA. | დამჟავება აჩერებს ფერმენტულ დაშლას და ამზადებს პეპტიდებს LC-MS/MS ანალიზისთვის. |
| 14 | ფერმენტული დაშლის პროდუქტი გადაიტანეთ LC-MS-თან თავსებად ფლაკონებში ან ფირფიტებში. | მოერიდეთ უხსნადი ნამსხვრევების გადაცემას. |
| 15 | ჩაატარეთ ანალიზი nano-LC-MS/MS მეთოდით. | გამოიყენეთ ინექციის ერთნაირი მოცულობა, LC გრადიენტი და MS მონაცემთა შეგროვების პარამეტრები. |
| 16 | საჭიროებისამებრ დაამუშავეთ დაუმუშავებელი მონაცემები DIA, DDA ან მიზნობრივი პროტეომიკის პროგრამული უზრუნველყოფის გამოყენებით. | გამოიყენეთ შესაფერისი მონაცემთა ბაზა, ფერმენტის სპეციფიკა, მოდიფიკაციის პარამეტრები და FDR ზღურბლები. |
(შდრ. მოჩიზუკი-ონო და სხვები, 2026)
მრავალფოსოიანი ფირფიტის სონიკატორი UIP400MTP
რატომ მიკროფირფიტაში ულტრაბგერითი დამუშავება?
UIP400MTP მცირე მოცულობის ნიმუშების სტანდარტიზებული, პარალელური ულტრაბგერითი დამუშავების საშუალებას იძლევა. ეს გამოსადეგია მაშინ, როდესაც მნიშვნელოვანია გამეორებადობა, საწყისი ნიმუშის მცირე რაოდენობა და მრავალი ნიმუშის დამუშავების წარმადობა.
გამოიყენეთ ნებისმიერი სტანდარტული მიკროპლატა! მაღალი გამტარუნარიანობის ნიმუშების მომზადება UIP400MTP-ით.
მითითებულ EV პროტეომიკის სამუშაო პროცესში გამოყენებული იყო ცილის 5 µg-ის ეკვივალენტური საწყისი EV მასალა, 25 µL მეთანოლი, UIP400MTP-ით ულტრაბგერითი დამუშავება 3 წუთის განმავლობაში, ტრიპსინით/Lys-C-ით დაშლა, TFA-ით დამჟავება და nano-LC-MS/MS ანალიზი.
რეკომენდებული LC-MS/MS და მონაცემთა ანალიზის ნაბიჯები
ფერმენტული დაშლისა და დამჟავების შემდეგ ნიმუშები შეიძლება გაანალიზდეს ნანონაკადური შებრუნებულფაზიანი LC-ით, რომელიც დაკავშირებულია მაღალი გარჩევადობის ტანდემურ მასსპექტრომეტრიასთან. გამოქვეყნებულ სამუშაო პროცესში პეპტიდები განცალკევდა nano-LC სისტემაზე და გაანალიზდა Orbitrap მასსპექტრომეტრზე მონაცემებისგან დამოუკიდებელი შეგროვების რეჟიმში.
| ეტაპი | რეკომენდაცია | მიზანი |
|---|---|---|
| ნიმუშის დატვირთვა | გამოიყენეთ C18 დამჭერი სვეტი ან პეპტიდების ჩატვირთვის ეკვივალენტური სისტემა. | კონცენტრირებს პეპტიდებს და აშორებს უაღრესად პოლარულ დამაბინძურებლებს. |
| პეპტიდების გამოყოფა | გამოიყენეთ ნანო-ნაკადის შებრუნებული ფაზის LC. | აუმჯობესებს პეპტიდების გამოყოფას და MS მგრძნობელობას. |
| MS მონაცემთა შეგროვება | გამოიყენეთ DIA, DDA, ან მიზანმიმართული MS კვლევის დიზაინის მიხედვით. | წარმოქმნის პეპტიდის დონის სპექტრულ მონაცემებს. |
| მონაცემთა ბაზის ძებნა | გამოიყენეთ სახეობების შესაბამისი საცნობარო მონაცემთა ბაზა. | ხელს უწყობს პეპტიდებისა და ცილების იდენტიფიკაციას. |
| FDR კონტროლი | გამოიყენეთ პეპტიდებისა და ცილების დონეზე ცრუ აღმოჩენების წილის ზღვრები. | აკონტროლებს იდენტიფიკაციის სანდოობას. |
| კვანტიფიკაცია | ექსპორტზე გაიტანეთ პეპტიდების, პრეკურსორებისა და ცილების რაოდენობრივი შემცველობის ცხრილები. | ჯგუფებს შორის სტატისტიკური შედარების საშუალებას იძლევა. |
ხარისხის კონტროლის შემოწმების სია
- დაადასტურეთ, რომ ყველა ნიმუშში საწყისი EV მასალის რაოდენობა ცილის თანაბარ ეკვივალენტს შეესაბამება.
- გამოიყენეთ შემთხვევითი ან გაწონასწორებული ნიმუშების დამუშავების განლაგებები.
- შეინარჩუნეთ მეთანოლის მოცულობა, ულტრაბგერითი დამუშავების დრო, გაშრობის დრო და ფერმენტული დაშლის მოცულობა ერთნაირი.
- აკონტროლეთ პეპტიდების გამოსავლიანობა და იდენტიფიცირებული ცილების საერთო რაოდენობა.
- შეამოწმეთ გამოტოვებული გახლეჩის ადგილების სიხშირე და პეპტიდების სიგრძის განაწილება.
- შეამოწმეთ ქრომატოგრაფიული პიკის ფორმა და შეკავების დროის გამეორებადობა.
- ჩართეთ ბლანკური ნიმუშები ნიმუშებს შორის ნარჩენი მასალის გადატანის მონიტორინგისთვის.
- უფრო მასშტაბური კვლევებისთვის გამოიყენეთ გაერთიანებული QC ნიმუშები.
- შეაფასეთ განმეორებითი გაზომვების ვარიაციის კოეფიციენტი.
- გამოიყენეთ PCA ან მსგავსი მეთოდები პარტიის ეფექტების ან მკვეთრად განსხვავებული ნიმუშების გამოსავლენად.
პროტოკოლის რეკომენდაციები
ამ სამუშაო პროცესის გამოქვეყნებისას ან დოკუმენტირებისას მიუთითეთ საწყისი EV მასალის რაოდენობა, ფირფიტის ფორმატი, მეთანოლის მოცულობა, UIP400MTP-ის ამპლიტუდა და ულტრაბგერითი დამუშავების დრო, ცენტრიფუგირების პირობები, გაშრობის მეთოდი, ფერმენტული დაშლის ბუფერი, ფერმენტის კონცენტრაცია, ფერმენტული დაშლის დრო, დამჟავების პირობები, LC-MS/MS პლატფორმა, მონაცემთა შეგროვების რეჟიმი, პროგრამული უზრუნველყოფის ვერსია, მონაცემთა ბაზა, FDR ზღვარი, ნორმალიზაციის მეთოდი და სტატისტიკური დამუშავების პროცესი.
Hielscher-ის ყველა მიკროფირფიტის სონიკატორი ავტომატურად აღრიცხავს პროცესის მნიშვნელოვან პარამეტრებს, როგორიცაა ამპლიტუდა, ულტრაბგერითი დამუშავების ხანგრძლივობა და ტემპერატურა, თარიღისა და დროის ნიშნულით, CVS ფაილის სახით ინტეგრირებულ SD ბარათზე. გამეორებადობისა და ხარისხის კონტროლისთვის მონაცემთა აღრიცხვა არასდროს ყოფილა ასეთი მარტივი!
DIA პროტეომიკისთვის ყველა ნიმუშში გამოიყენეთ მონაცემთა შეგროვების ერთნაირი პარამეტრები და, სადაც შესაძლებელია, ჩართეთ გაერთიანებული QC ნიმუშები. აკონტროლეთ პრეკურსორების რაოდენობა, შეკავების დროის სტაბილურობა და განმეორებით გაზომვებს შორის ცვალებადობა.
ეს სამუშაო პროცესი EV პროტეომიკის ლაბორატორიულად გამოცდილი მაგალითია. სხვა ტიპის ნიმუშებისთვის სრულმასშტაბიან კვლევაზე გადასვლამდე ოპტიმიზაცია გაუკეთეთ საწყისი მასალის რაოდენობას, გამხსნელის გამოყენების პირობებს, ულტრაბგერითი დამუშავების დროს, ფერმენტული დაშლის მოცულობასა და LC-MS/MS ინექციის სტრატეგიას.
კვლევა დეტალურად: EV-ის შოტგან პროტეომიკა PLA2G12A-ს კვლევაში
P
EV-ის მომზადების სამუშაო პროცესში Th17 უჯრედები კულტივირდებოდა საკვებ არეში, რომელიც შეიცავდა ეგზოსომებისგან გაწმენდილ ხბოს ფეტალურ შრატს. კულტურის სუპერნატანტები თავდაპირველად დააცენტრიფუგირეს უჯრედების მოსაცილებლად, გაფილტრეს 0.22 µm ფილტრით, დააკონცენტრირეს ულტრაფილტრაციით/ულტრაცენტრიფუგირებით, გარეცხეს, ხელახლა შეასუსპენზირეს PBS-ში და რაოდენობრივად შეაფასეს BCA ცილის ანალიზით. EV-ის წინასწარი მომზადების ამ ეტაპმა უზრუნველყო პროტეომიკის სამუშაო პროცესში ცილის განსაზღვრული ეკვივალენტური რაოდენობის შესაბამისი EV მასალის გამოყენება.
Shotgun პროტეომული ანალიზისთვის ავტორებმა გამოიყენეს EV ნიმუშები, რომლებიც ცილის 5 µg-ის ეკვივალენტს შეესაბამებოდა. ეს ნიმუშები გააშრეს PCR სინჯარებში და დაამატეს 25 µL მეთანოლი. შემდეგ ნიმუშები 3 წუთის განმავლობაში დაამუშავეს ულტრაბგერით UIP400MTP მიკროფირფიტის სონიკატორის გამოყენებით. ულტრაბგერითი დამუშავების შემდეგ ნიმუშები დააცენტრიფუგირეს 4°C-ზე 20 წუთის განმავლობაში 19,000 × g-ზე. სუპერნატანტის 20 µL-ის მოცილების შემდეგ ნიმუშები ცენტრიფუგირებით გააშრეს. შემდეგ ცილები ულტრაბგერითი დამუშავებით გახსნეს ტრიპსინის/Lys-C-ის 4 µL ხსნარში, რომლის კონცენტრაცია იყო 100 ng/µL 50 mM ამონიუმის ბიკარბონატში. ფერმენტული დაშლა ჩატარდა 2 საათის განმავლობაში 37°C-ზე, 300 rpm სიჩქარით შენჯღრევის პირობებში. ფერმენტული დაშლის პროდუქტი დაამჟავეს 1 µL 1.25% ტრიფტორძმარმჟავით და გააანალიზეს ნანონაკადური LC-ით, რომელიც დაკავშირებული იყო მაღალი გარჩევადობის ტანდემურ მასსპექტრომეტრიასთან.
ეს სამუშაო პროცესი წარმოაჩენს რამდენიმე სასარგებლო პრინციპს საწყისი მასალის მცირე რაოდენობით EV პროტეომიკისთვის. პირველი, საწყისი მასალის რაოდენობა ცილის ეკვივალენტის მიხედვით ნორმალიზდა, რაც მნიშვნელოვანია სხვადასხვა გენოტიპის ან სხვადასხვა დამუშავების შედეგად მიღებული EV-ების შედარებისას. მეორე, მეთანოლი გამოიყენეს ულტრაბგერით დამუშავებამდე, რაც ხელს უწყობდა სტრუქტურების დარღვევასა და ექსტრაქციას და ამავდროულად თავიდან აცილებდა დეტერგენტული სისტემების გამოყენებას, რომლებმაც შეიძლება გაართულოს LC-MS/MS ანალიზი. მესამე, ულტრაბგერითი დამუშავების ეტაპი იყო ხანმოკლე და სტანდარტიზებული, რაც თავსებადია ნიმუშების პარალელურ დამუშავებასთან. მეოთხე, ტრიპსინით/Lys-C-ით დაშლა ჩატარდა ძალიან მცირე მოცულობაში, რაც ამცირებდა განზავებას და ხელს უწყობდა პეპტიდების მიღებას საწყისი მასალის მცირე რაოდენობიდან. დაბოლოს, ფერმენტული დაშლიდან დამჟავებასა და LC-MS/MS ანალიზზე უშუალო გადასვლამ მინიმუმამდე დაიყვანა ზედმეტი მანიპულაციები.
შემდგომი LC-MS/MS მეთოდი იყენებდა ნანონაკადურ შებრუნებულფაზიან დაყოფას, რომელიც დაკავშირებული იყო Q-Exactive HF Orbitrap მას-სპექტრომეტრთან. ნიმუშები კონცენტრირდებოდა C18 წინასწარ სვეტზე, შემდეგ კი იყოფოდა 50 µm შიდა დიამეტრის ანალიზურ სვეტზე, 200 nL/min ნაკადის სიჩქარით და 40°C ტემპერატურაზე. 60 წუთის განმავლობაში გრადიენტი იცვლებოდა ორგანული გამხსნელის დაბალი შემცველობიდან 35% გამხსნელ B-მდე, რასაც მოჰყვებოდა ორგანული გამხსნელის მაღალი შემცველობით რეცხვა და ხელახალი გაწონასწორება. MS მონაცემების რეგისტრაცია ხდებოდა დადებითი იონების რეჟიმში, მონაცემებისგან დამოუკიდებელი რეგისტრაციისა და მაღალი ენერგიის შეჯახებითი დისოციაციის გამოყენებით. DIA-ის ნედლი ფაილები გაანალიზდა DIA-NN 1.8-ის გამოყენებით, კომპიუტერულად პროგნოზირებული სპექტრული ბიბლიოთეკის საფუძველზე.
მაღალი გამტარუნარიანობის ცილის ექსტრაქცია 96-ფოსოიანი ფირფიტის სონიკატორი UIP400MTP
ხშირად დასმული შეკითხვები
ვისთვის არის ყველაზე სასარგებლო მიკროფირფიტის სონიკაცია შოთგან პროტეომიკაში?
მიკროფირფიტის სონიკაცია განსაკუთრებით სასარგებლოა პროტეომიკის ლაბორატორიებისთვის, რომლებიც მრავალ ნიმუშს პარალელურად ამუშავებენ, მათ შორის საერთო სარგებლობის კვლევითი ცენტრებისთვის, პროტეომის კვლევითი ჯგუფებისთვის, იმუნოლოგიის ლაბორატორიებისთვის, ტრანსლაციური კვლევების გუნდებისთვის და სიცოცხლის შემსწავლელი მეცნიერებების ლაბორატორიებისთვის, რომლებიც უფრო მაღალი წარმადობის LC-MS/MS სამუშაო პროცესებზე გადადიან. ის განსაკუთრებით მნიშვნელოვანია, როდესაც სხვადასხვა ნიმუშის დამუშავების შედეგების რეპროდუცირებადობა კრიტიკულია.
რატომ გამოვიყენოთ UIP400MTP ჩვეულებრივი ზონდის სონიკატორის ნაცვლად?
ჩვეულებრივი ზონდიანი სონიკატორი, როგორც წესი, ნიმუშებს სათითაოდ ამუშავებს და ნიმუშებს შორის ნივთიერებების გადატანის შესამცირებლად საგულდაგულო გაწმენდას საჭიროებს. მიკროფირფიტის სონიკატორების მოდელები UIP400MTP და UIP550MTP უზრუნველყოფენ პარალელურ სონიკაციას ფირფიტაზე დაფუძნებულ ან მცირე მოცულობის ფორმატში, რაც ხელს უწყობს ხელით დამუშავების შემცირებას, ერთგვაროვნების გაუმჯობესებას და მრავალი ნიმუშის მომზადების გამარტივებას. მათი ინტეგრაცია ავტომატიზებულ სამუშაო პროცესებშიც მარტივია.
რა ეტაპზე გამოიყენება სონიკაცია შოთგან პროტეომიკის სამუშაო პროცესში?
სონიკაცია ჩვეულებრივ გამოიყენება ნიმუშის მომზადების ეტაპზე, ფერმენტულ დაშლამდე. მას შეუძლია ხელი შეუწყოს სტრუქტურების დარღვევას, ექსტრაქციას, ჰომოგენიზაციასა და ხელახალ გახსნას ტრიპსინით, Lys-C-ით ან ტრიპსინისა და Lys-C-ის ნარევით ფერმენტულ დაშლამდე.
გარდა ამისა, სონიკაცია შეიძლება გამოყენებულ იქნეს დაშლის დროსაც, რათა მნიშვნელოვნად დააჩქაროს ცილების ფერმენტული დაშლა. აღმოაჩინეთ სონიკაციის გამოყენებით ცილების მაღალი წარმადობით დაშლის შესაძლებლობები სწრაფი პროტეომიკური სამუშაო პროცესისთვის!
სასარგებლოა თუ არა მიკროფირფიტის სონიკაცია უჯრედგარე ვეზიკულების პროტეომიკისთვის?
დიახ. უჯრედგარე ვეზიკულები ლიპიდებით მდიდარი, მემბრანით შემოსაზღვრული ნაწილაკებია, რომელთა რეპროდუცირებადი დამუშავება შეიძლება რთული იყოს. მითითებულ PLA2G12A კვლევებში EV ნიმუშები მუშავდებოდა მეთანოლით, შემდეგ UIP400MTP-ით სონიკაციით, შრებოდა, იშლებოდა ტრიპსინით/Lys-C-ით და ანალიზდებოდა ნანო-LC/MS/MS-ით.
რომელი ტიპის ნიმუშებისთვის შეიძლება იყოს სასარგებლო მიკროფირფიტის სონიკაცია?
მიკროფირფიტის სონიკაცია შეიძლება სასარგებლო იყოს უჯრედული ლიზატებისთვის, ორგანელების ფრაქციებისთვის, იმუნოპრეციპიტატებისთვის, ცილის აგრეგატებისთვის, მემბრანებით მდიდარი ნიმუშებისთვის, უჯრედგარე ვეზიკულებისა და სხვა მცირე მოცულობის ბიოლოგიური პრეპარატებისთვის. თითოეული ტიპის ნიმუშისთვის უნდა ოპტიმიზირდეს სონიკაციის ინტენსივობა და ხანგრძლივობა, გამხსნელის გამოყენების პირობები, საწყისი მასალის რაოდენობა და დაშლის სტრატეგია.
ანაცვლებს თუ არა სონიკაცია ფერმენტულ დაშლას?
არა. სონიკაცია ხელს უწყობს ნიმუშის დაშლისთვის მომზადებას სტრუქტურების დარღვევის, ექსტრაქციის ან ხელახალი გახსნის გაუმჯობესებით. აღმავალი მიდგომის შოთგან პროტეომიკისთვის პეპტიდების მისაღებად პროტეოლიზური დაშლა კვლავ აუცილებელია.
წაიკითხეთ მეტი პროტეომიკის სამუშაო პროცესებში ულტრაბგერით ხელშეწყობილი ცილების დაშლის შესახებ!
თავსებადია თუ არა UIP400MTP მცირე საწყისი რაოდენობის ნიმუშების პროტეომიკასთან?
დიახ, მიკროფირფიტის ფორმატი კარგად შეეფერება მცირე მოცულობის სამუშაო პროცესებს, რომლებშიც მნიშვნელოვანია ნიმუშის შენარჩუნება და ერთგვაროვანი დამუშავება. გამოქვეყნებულ EV სამუშაო პროცესში პროტეომიკური ანალიზისთვის მომზადება ჩატარდა EV-ის ისეთი საწყისი რაოდენობით, რომელიც 5 µg ცილის ეკვივალენტს შეესაბამებოდა.
შეუძლია თუ არა მიკროფირფიტის სონიკაციას რეპროდუცირებადობის გაუმჯობესება?
Hielscher-ის სონიკატორები ხელს უწყობენ რეპროდუცირებადობას მრავალ ნიმუშზე სონიკაციის სტანდარტიზებული პირობების გამოყენებით. თუმცა პროტეომიკის საერთო რეპროდუცირებადობაზე სხვა ფაქტორებიც მოქმედებს, როგორიცაა უჯრედების ან EV-ის იზოლაცია, საწყისი მასალის რაოდენობის ნორმალიზაცია, დაშლის ეფექტიანობა, LC-MS/MS-ის სტაბილურობა, მონაცემთა დამუშავება და სტატისტიკური ანალიზი.
შეუძლია თუ არა მიკროფირფიტის სონიკაციას ცილების იდენტიფიკაციის სიღრმის გაუმჯობესება?
მან შეიძლება ხელი შეუწყოს იდენტიფიკაციის სიღრმის გაუმჯობესებას, როდესაც ნიმუშის სტრუქტურების დარღვევა ან ხელახალი გახსნა შემზღუდველი ფაქტორია. ეფექტი დამოკიდებულია ნიმუშის ტიპზე, ცილის ქიმიურ თვისებებზე, გასუფთავების სტრატეგიაზე, დაშლის პირობებსა და LC-MS/MS მეთოდის ეფექტიანობაზე.
რა უნდა ოპტიმიზირდეს სტანდარტულად ამ სამუშაო პროცესის გამოყენებამდე?
ძირითადი პარამეტრები მოიცავს საწყისი ნიმუშის რაოდენობას, ბუფერის ან გამხსნელის შემადგენლობას, ფირფიტის ფორმატს, ულტრაბგერის ამპლიტუდასა და ხანგრძლივობას, გაშრობის პირობებს, დაშლისთვის გამოყენებული ხსნარის მოცულობას, ფერმენტის კონცენტრაციას, ინკუბაციის დროსა და LC-MS/MS-ში შესაყვანი ნიმუშის რაოდენობას. სრული ექსპერიმენტული სერიისთვის სამუშაო პროცესის გამოყენებამდე რეკომენდებულია საპილოტე გამოცდა.
შესაძლებელია ამ სამუშაო პროცესის გამოყენება DIA პროტეომიკასთან?
დიახ. მითითებულ EV სამუშაო პროცესში გამოყენებული იყო მონაცემებისგან დამოუკიდებელი რეგისტრაცია, რასაც მოჰყვებოდა DIA-NN ანალიზი. მიკროფირფიტის სონიკაცია ნიმუშის წინასწარი მომზადების პროცესის ნაწილია და შეიძლება ინტეგრირდეს DIA, DDA ან მიზნობრივი პროტეომიკის მეთოდებთან.
ხარისხის კონტროლის რომელ მაჩვენებლებს უნდა გაეწიოს მონიტორინგი?
რეკომენდებული QC მაჩვენებლები მოიცავს პეპტიდების გამოსავლიანობას, იდენტიფიცირებული პეპტიდებისა და ცილოვანი ჯგუფების რაოდენობას, გამოტოვებული გახლეჩის სიხშირეს, პეპტიდების სიგრძის განაწილებას, ქრომატოგრაფიული პიკების ფორმას, შეკავების დროის სტაბილურობას, განმეორებითი ნიმუშების ვარიაციის კოეფიციენტს, ნიმუშებს შორის ნივთიერებების გადატანასა და ბიოლოგიური ჯგუფების გამიჯვნას PCA-ით ან მსგავსი მეთოდებით.
რა არის მიკროფირფიტის სონიკატორების მოდელების UIP400MTP ან UIP550MTP პროტეომიკისთვის ნიმუშების მომზადებაში ინტეგრირების მთავარი უპირატესობა?
მთავარი უპირატესობაა მცირე მოცულობის ნიმუშების სტანდარტიზებული, პარალელური დამუშავება. ეს ეხმარება ლაბორატორიებს, შეამცირონ ხელით მუშაობით გამოწვეული ცვალებადობა და რთული ბიოლოგიური ნიმუშები უფრო ერთგვაროვნად მოამზადონ დაშლისთვის, LC-MS/MS მონაცემების რეგისტრაციისა და რაოდენობრივი პროტეომიკური ანალიზისთვის.
Hielscher-ის მიკროფირფიტის სონიკატორები შეიძლება შეუფერხებლად ინტეგრირდეს ავტომატიზებულ სამუშაო პროცესებში.
ლიტერატურა / წყაროები
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet UIP550MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- Mochizuki-Ono C., Taketomi Y., Irie A., Kano K. et al. (2026): PLA2G12A-driven extracellular vesicle-lipid signaling amplifies pathogenic T cell responses in inflammatory diseases. Cell Reports 45, 2026.
- Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
- Lischnig A., Bergqvist M., Ochiya T., Lässer C. (2023): Corrigendum for “Quantitative Proteomics Identifies Proteins Enriched in Large and Small Extracellular Vesicles”. Molecular & Cellular Proteomics, 22; 2023.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.
Hielscher Ultrasonics აწარმოებს მაღალი წარმადობის ულტრაბგერით ჰომოგენიზატორებს ლაბორატორიული ზომიდან სამრეწველო ზომამდე.