მიკროპლატიან სონიკაცია შოტგან პროტეომიკაში – გამოყენების შენიშვნა

თოფის პროტეომიკა დამოკიდებულია ეფექტურ, რეპროდუცირებად ნიმუშის მომზადებაზე, რათა გადაიყვანოს რთული ბიოლოგიური მასალა LC-MS/MS-მზა პეპტიდებად. UIP400MTP მიკროფირფიტის სონიკატორი მხარს უჭერს ამ პროცესს მცირე მოცულობის ნიმუშების სტანდარტიზებული, პარალელური გაჟონვის საშუალებით, რაც ეხმარება ლაბორატორიებს გააუმჯობესონ შეფერხება, ექსტრაქცია და ხელახალი ხსნა მიკროფირფიტაზე დაფუძნებულ სამუშაო პროცესებში. განაცხადის ეს შენიშვნა აღწერს, თუ როგორ შეიძლება UIP400MTP ინტეგრირებული იყოს პროტეომური ნიმუშის მომზადებაში, გამოქვეყნებული უჯრედგარე-ვეზიკულის სამუშაო პროცესის გამოყენებით PLA2G12A/Th17 კვლევებიდან, როგორც ლაბორატორიულად გამოცდილი მაგალითი.

მიკროფირფიტის გაჟონვა უფრო რეპროდუცირებადი თოფის პროტეომიკისთვის

პროტეომიკის მკვლევარებისთვის, განმეორებადი ნიმუშის მომზადება გადამწყვეტია მაღალი ხარისხის LC-MS/MS მონაცემებისთვის. UIP400MTP მიკროფირფიტის სონიკატორი მხარს უჭერს სტანდარტიზებულ, პარალელურ გაჟღერებას ფირფიტაზე დაფუძნებულ და მცირე მოცულობის/მაღალი გამტარუნარიანობის სამუშაო პროცესებში.

ეს განსაკუთრებით სასარგებლოა ლაბორატორიებისთვის, რომლებიც მუშაობენ:

• ნიმუშების დიდი ნაკრები, რომლებიც საჭიროებენ თანმიმდევრულ დამუშავებას ბევრ ჭაბურღილში
• შეზღუდული შეყვანის მასალა, სადაც ნიმუშის დაკარგვა და ცვალებადობა უნდა შემცირდეს
• ლიპიდებით მდიდარი ნიმუშები, როგორიცაა უჯრედგარე ვეზიკულები
• რთული ბიოლოგიური პრეპარატები, რომლებიც საჭიროებენ ეფექტურ დარღვევას, ექსტრაქციას, ან ხელახალი ხსნა
• შედარებითი თოფის პროტეომიკა, სადაც აუცილებელია რეპროდუცირება პირობებში და რეპლიკაციებზე

საჭმლის მონელებამდე მიკროფირფიტის გაჟონვის ინტეგრირებით, მკვლევარებს შეუძლიათ გააუმჯობესონ ნიმუშის მზადყოფნა:

• ცილის ექსტრაქცია და ხელახლა ხსნადობა
• ტრიპსინ/ლის-C საჭმლის მონელება
• Nano-LC/MS/MS შეძენა
• რაოდენობრივი ქვედა დინების პროტეომიკის ანალიზი

 

გააფართოვეთ თქვენი პროტეომიკის ნიმუშის მომზადება თავდაჯერებულად!
შეიტყვეთ, თუ როგორ ეხმარება მიკროფირფიტის გაჟონვა ხელით ცვალებადობის შემცირებას, ნიმუშის დარღვევის გაუმჯობესებას და რთული ბიოლოგიური ნიმუშების მომზადებას საიმედო LC-MS/MS ანალიზისთვის.

Ინფორმაციის მოთხოვნა


ელფოსტის მისამართი (აუცილებელია)


პროდუქტი ან ინტერესის სფერო



ვეთანხმები კონფიდენციალურობის პოლიტიკას









Ინფორმაციის მოთხოვნა

მიკროფირფიტის გაჟონვას შეუძლია ისარგებლოს:

• პროტეომიკის ძირითადი საშუალებები
• ელექტრომობილების კვლევითი ლაბორატორიები
• იმუნოლოგიისა და უჯრედული ბიოლოგიის ლაბორატორიები
• მთარგმნელობითი კვლევითი ჯგუფები
• სიცოცხლის მეცნიერების გუნდები მასშტაბირება ერთი ნიმუშის მოსამზადებლად უფრო მაღალი გამტარუნარიანობის სამუშაო პროცესებზე

მაღალი გამტარუნარიანობის ნიმუშის მომზადება უჯრედგარე ვეზიკულების პროტეომის ანალიზისთვის

რა არის თოფის პროტეომიკა?

Shotgun proteomics has become a central analytical strategy for characterizing complex biological samples, from whole-cell lysates and tissue extracts to purified organelles, extracellular vesicles, and low-input clinical specimens. Its core strength lies in the coupling of protein digestion, high-resolution liquid chromatography-tandem mass spectrometry, and computational peptide-to-protein inference. However, the quality of the final proteome dataset is determined long before the sample reaches the mass spectrometer. Efficient sample disruption, protein solubilization, removal of interfering substances, reproducible enzymatic digestion, and robust peptide recovery are all decisive for depth of coverage and quantitative reliability.
პროტეომიკის მკვლევრებისთვის და სიცოცხლის მეცნიერებების ლაბორატორიებისთვის, რომლებიც მუშაობენ შეზღუდულ ან ძვირფას ნიმუშებთან, ნიმუშის მომზადება ხშირად ბოთლნეკია.

ექსტრაცელულარულ ვეზიკულებთან დაკავშირებული გამოწვევები პროტეომიკაში

უჯრედგარე ვეზიკულები (EVs), მაგალითად, წარმოადგენს განსაკუთრებით მომთხოვნ ნიმუშის კლასს. ისინი არიან მემბრანით შეკრული, ლიპიდებით მდიდარი, ნანომასშტაბიანი ნაწილაკებით, ცილის შედარებით დაბალი მოსავლიანობით და ლიპიდების, მარილების, სარეცხი საშუალებების, შრატის ცილების და სხვა მატრიცის კომპონენტების გადატანის მაღალი პოტენციალით. ამ მახასიათებლებმა შეიძლება ხელი შეუშალოს საჭმლის მონელების ეფექტურობას, ქრომატოგრაფიულ შესრულებას, ელექტროსპრეის სტაბილურობას და პეპტიდების იდენტიფიკაციას. ამიტომ ელექტრომობილების პროტეომიკისთვის მომზადების სამუშაო პროცესი უნდა იყოს საკმარისად ძლიერი, რათა დაარღვიოს ვეზიკულის სტრუქტურები და გაახსნას ცილის ტვირთი, ხოლო დარჩეს თავსებადი ქვედა დინების ფერმენტულ მონელებასთან და LC-MS/MS ანალიზთან.
ამ კონტექსტში, მიკროფირფიტებთან თავსებადი ულტრაბგერითი გთავაზობთ პრაქტიკულ მიდგომას განმეორებადი, პარალელიზებული ნიმუშის დამუშავებისთვის. Hielscher microplate sonicator მოდელები UIP400MTP (400 W) და UIP550MTP (550 W) განკუთვნილია ნიმუშების sonication in multiwell ფირფიტები და მცირე მოცულობის ჭურჭელი, მხარს უჭერს უფრო მაღალი გამტარუნარიანობის workflows, ვიდრე ჩვეულებრივი ერთჯერადი ზონდის sonicators. პროტეომიკის ლაბორატორიებისთვის ეს ფორმატი მიმზიდველია, რადგან მას შეუძლია შეამციროს პრაქტიკული ცვალებადობა, გააუმჯობესოს მრავალი ნიმუშის პარალელური დამუშავება და უფრო ბუნებრივად ინტეგრირდეს ფირფიტებზე დაფუძნებული ნიმუშის მომზადების მილსადენებში.

სამაგალითო სამუშაო პროცესი

ბოლოდროინდელი უჯრედგარე ვეზიკულის პროტეომიკის სამუშაო პროცესი PLA2G12A-ზე ორიენტირებულ Th17-უჯრედულ ბიოლოგიაში იძლევა სასარგებლო, ლაბორატორიულად გამოცდილ მაგალითს იმისა, თუ როგორ შეიძლება მიკროფირფიტის სონიკატორი UIP400MTP ჩაერთოს თოფის პროტეომიკის ნიმუშის მომზადებაში. ამ კვლევის სერიაში, ელექტრომობილების ნიმუშები დამუშავდა პროტეომის ანალიზისთვის მეთანოლის დამუშავების, UIP400MTP გაჟონვის, ცენტრიფუგაციის, გაშრობის, ტრიფსინის/ლის-C მონელების და ნანო ნაკადის LC-მაღალი გარჩევადობის ტანდემის MS-ის გამოყენებით. ბიოლოგიური ნაშრომი მოხსენებული იყო 2026 წელს მოჩიზუკი-ონომ და კოლეგებმა, სადაც პროტეომიკის ანალიზმა ხელი შეუწყო დაახასიათოს, თუ როგორ ცვლის PLA2G12A ელექტრომობილების ტვირთის ცილებს პათოგენური T-უჯრედების პასუხების კონტექსტში.

მრავალ ჭაბურღილის სონიკატორი UIP400MTP

რატომ მიკროფირფიტის გაჟონვა?
UIP400MTP საშუალებას სძენს სტანდარტიზებულ, პარალელურ სონიკაციას მცირე მოცულობის ნიმუშებში. ეს განსაკუთრებით გამოსადეგია მაშინ, როდესაც მნიშვნელოვანია გამეორებადობა, მცირე ნიმუშის მოცულობა და მრავალი ნიმუშის გამოტანობა.

ხარისხის კონტროლის შემოწმების სია

• დაადასტურეთ ყველა ნიმუშში ერთიანი EV პროტეინის ექვივალენტი შეყვანა.
• გამოიყენეთ შემთხვევითი ან გაწონასწორებული ნიმუშების დამუშავების განლაგებები.
• შეინარჩუნეთ მეტანოლის მოცულობა, სონიკაციის დრო, გაშრობის დრო და პეპტიდის დაშლის მოცულობა შეუცვლელი.
• მოათვალიერეთ პეპტიდის მოსავლიანობა და საერთო პროტეინის იდენტიფიკაციები.
• ჩამოწერეთ გამოტოვებული გაჭრის სიხშირე და პეპტიდის სიგრძის განაწილება.
• შეამოწმეთ ქრომატოგრაფიული პიკის ფორმა და შენარჩუნების დროის გამეორებადობა.
• შეიყვანეთ ცარიელი ნიმუშები მონიტორინგის მიზნით გადაცმობის გამოსავლენად.
• გამოიყენეთ შეკრული QC ნიმუშები დიდი კვლევებისათვის.
• შეფასეთ გამეორების ცვლადობის კოეფიციენტი.
• გამოიყენეთ PCA ან მსგავს მეთოდებს პარტიის ეფექტებისა ან გამორჩეული ნიმუშების დასადგენად.

პროტოკოლის რეკომენდაციები

როცა ეს სამუშაო პროცესი ქვეყნდება ან დოკუმენტდება, მიუთითეთ EV-ის შეყვანის რაოდენობა, ფირფიტის ფორმატიო, მეთანოლის მოცულობა, UIP400MTP-ის ამპლიტუდა და სონიკაციის დრო, ცენტრიფუგირების პირობები, სარეცხი მეთოდი, დიგესტირების ბუფერი, ენზიმის კონცენტრაცია, დიგესტირების დრო, აციდურობის პირობები, LC-MS/MS პლატფორმა, შეძენის რეჟიმი, პროგრამის ვერსია, მონაცემთა ბაზა, FDR-ის ზღვარი, ნორმალიზაციის მეთოდი და სტატისტიკური სამუშაო პროცესი.
ყველა Hielscher-ის მიკროფირფიტის სონიკატორი ავტომატურად ანიჭებს მნიშვნელოვან პროცესურ პარამეტრებს, როგორიცაა ამპლიტუდა, სონიკაციის ხანგრძლივობა და ტემპერატურა, დათარიღებითა და დროის მარკერით, როგორც CSV ფაილი ინტეგრირებულ SD კარტაზე. მონაცემთა პროტოკოლირება გამეორებადობისა და ხარისხის კონტროლისთვის არასდროს ყოფილა მარტივი!

კვლევა დეტალურად: EV თოფი პროტეომიკა PLA2G12A კვლევაში

P
ელექტრომობილების მომზადების სამუშაო პროცესში, Th17 უჯრედები კულტივირდა ეგზოსომით ამოწურული ნაყოფის მსხვილფეხა რქოსანი პირუტყვის შრატში. კულტურის სუპერნატანტები პირველად ცენტრიფუგირებული იქნა უჯრედების მოსაშორებლად, გაფილტრული იყო 0.22 მკმ ფილტრის მეშვეობით, კონცენტრირებული ულტრაფილტრაციით/ულტრაცენტრიფუგაციით, გარეცხილი, ხელახლა შეჩერებული PBS-ში და რაოდენობრივად განისაზღვრა BCA ცილის ანალიზით. ელექტრომობილების ამ ზედა დინების მომზადებამ უზრუნველყო, რომ ელექტრომობილების მასალის ცილის ექვივალენტური რაოდენობა შეიძლება განხორციელდეს პროტეომიკის სამუშაო პროცესში.
For shotgun proteomic analysis, the authors used EV samples corresponding to 5 µg protein equivalents. These samples were dried in PCR tubes, and 25 µL methanol was added. The samples were then sonicated for 3 minutes using the UIP400MTP microplate sonicator. Following sonication, the samples were centrifuged at 4°C for 20 minutes at 19,000 × g. After removal of 20 µL supernatant, the samples were centrifuged to dryness. Proteins were then dissolved by sonication in 4 µL trypsin/Lys-C solution at 100 ng/µL in 50 mM ammonium bicarbonate. Digestion was performed for 2 hours at 37°C with shaking at 300 rpm. The digest was acidified with 1 µL of 1.25% trifluoroacetic acid and submitted to nano-flow LC-high-resolution tandem mass spectrometry.
ეს სამუშაო პროცესი ხაზს უსვამს რამდენიმე სასარგებლო პრინციპს დაბალი შეყვანის ელექტრომობილების პროტეომიკისთვის. პირველ რიგში, შეყვანა ნორმალიზდა ცილის ეკვივალენტით, რაც მნიშვნელოვანია სხვადასხვა გენოტიპის ან მკურნალობის ელექტრომობილების შედარებისას. მეორეც, მეთანოლი გამოიყენებოდა გაჟონვამდე, მხარს უჭერდა შეფერხებას და ექსტრაქციას, ხოლო თავიდან აიცილა სარეცხი სისტემები, რამაც შეიძლება გაართულოს LC-MS/MS. მესამე, გაჟონვის ნაბიჯი იყო მოკლე და სტანდარტიზებული, რაც თავსებადია ნიმუშის პარალელურ დამუშავებასთან. მეოთხე, ტრიფსინის/ლიზ-C საჭმლის მონელება შესრულდა ძალიან მცირე მოცულობით, რაც ამცირებს განზავებას და მხარს უჭერდა პეპტიდების დაბალი შეყვანის აღდგენას. დაბოლოს, საჭმლის მონელებიდან მჟავიანობაზე და LC-MS/MS-ზე პირდაპირ გადასვლამ მინიმუმამდე დაიყვანა არასაჭირო დამუშავების ნაბიჯები.
ქვედა დინების LC-MS/MS მეთოდმა გამოიყენა ნანო-ნაკადის შებრუნებული ფაზის განცალკევება Q-Exactive HF Orbitrap მასის სპექტრომეტრით. ნიმუშები ხაფანგში იყო C18 წინასწარ სვეტზე, შემდეგ გამოყოფილი იყო 50 μm შიდა დიამეტრის ანალიტიკურ სვეტზე 200 ნლ/წთ და 40°C. გრადიენტი გადიოდა დაბალი ორგანული გამხსნელიდან 35% გამხსნელამდე B 60 წუთის განმავლობაში, რასაც მოჰყვა მაღალი ორგანული რეცხვა და ხელახალი წონასწორობა. გაფანტული სკლეროზის შეძენა განხორციელდა პოზიტიური იონური რეჟიმში მონაცემთა დამოუკიდებელი შეძენის გამოყენებით უფრო მაღალი ენერგიის შეჯახების დისოციაციით. DIA ნედლეული ფაილები გაანალიზდა DIA-NN 1.8-ის გამოყენებით სილიკოში პროგნოზირებული სპექტრული ბიბლიოთეკით.