საფუარის უჯრედების ლიზა მიკროპლატებში მაღალი ინტენსივობის ულტრაბგერითი დამუშავების გამოყენებით

მიკრობიოლოგები და სიცოცხლის მეცნიერების მკვლევრები, რომლებიც მუშაობენ Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris / Komagataella phaffii, და საფუარის სხვა სისტემებზე, იცნობენ ამ გამოწვევას: საფუარის უჯრედები მდგრადია, განმეორებადი შედეგების მქონე ლიზის მიღწევა შეიძლება რთული იყოს, ხოლო ნიმუშების ხელით დაშლა სწრაფად იქცევა შემაფერხებელ ფაქტორად, როდესაც საჭიროა მრავალი შტამის, კლონის, კულტივირების პირობის ან ექსპრესიის კონსტრუქციის სკრინინგი.

საფუარის მაღალი გამტარუნარიანობის ლიზისი მიკრობიოლოგიისთვის, მოლეკულური ბიოლოგიისა და ცილების ანალიზისთვის

Hielscher-ის მიკროპლატების სონიკატორები, როგორიცაა UIP400MTP (400 W) და UIP550MTP (550 W), უზრუნველყოფენ საფუარის უჯრედების მექანიკური ლიზისის მაღალი გამტარუნარიანობის გადაწყვეტას უშუალოდ მიკროპლატებში. ნიმუშების ზონდით სათითაოდ დამუშავების ნაცვლად, შესაძლებელია მთელი მიკროპლატების ულტრაბგერითი დამუშავება ერთგვაროვან პირობებში. ეს საფუარის ულტრაბგერით ლიზისს უფრო სწრაფს, განმეორებადს და თანამედროვე მიკრობიოლოგიის, ცილების ექსპრესიის, ფერმენტული სკრინინგისა და ომიკის სამუშაო პროცესებში უფრო მარტივად ინტეგრირებადს ხდის.
თუ თქვენ გჭირდებათ რეკომბინანტური ცილების გამოთავისუფლება P. pastoris-დან, საფუარის ლიზატების მომზადება ფერმენტული ანალიზებისთვის, S. cerevisiae-ს უჯრედების დაშლა ცილების ანალიზისთვის ან საფუარის ათეულობით კლონის პარალელური სკრინინგი, Hielscher-ის მიკროპლატების სონიკატორები უზრუნველყოფენ კავიტაციაზე დაფუძნებულ უჯრედების ძლიერ დაშლას პროცესის ზუსტი კონტროლით.

რატომ სჭირდება საფუარის უჯრედებს ეფექტური მექანიკური ლიზა

საფუარის უჯრედები უფრო რთულია ლიზისთვის ვიდრე ბევრი ბაქტერიული ან ძუძუმწოვრის უჯრედი, რადგან ისინი დაცულია მკაცრი უჯრედის კედლით, რომელიც ძირითადად შედგება პოლისაქარიდების, გლუკანების, მანოპროტეინების და ქიტინისგან. ეს უჯრედის კედელი უზრუნველყოფს მექანიკურ მდგრადობას, მაგრამ ასევე ზღუდავს უჯრედშიდა ცილების, ნუკლეინის მჟავების, მეტაბოლიტების და ფერმენტების გამოთავისუფლებას.
საფუარის ლიზისის ტრადიციული მეთოდები მოიცავს ბურთულებით მექანიკურ დაშლას, ფერმენტულ დაშლას, გაყინვა-გალღობის ციკლებს, ქიმიურ ლიზისსა და ზონდით ულტრაბგერით დამუშავებას. ეს მეთოდები შეიძლება ეფექტური იყოს, თუმცა მათ შეზღუდვებიც აქვთ. ბურთულებით მექანიკურმა დაშლამ შეიძლება გამოიწვიოს ნამსხვრევების მოხვედრა ნიმუშში და მისი გაცხელება, ფერმენტულმა დაშლამ შეიძლება გაზარდოს ხარჯები და შედეგების ცვალებადობა, ხოლო ნიმუშების ზონდით სათითაოდ ულტრაბგერითი დამუშავება დიდ დროს მოითხოვს, როდესაც დასამუშავებელია ნიმუშების დიდი რაოდენობა.
მაღალი ინტენსივობის ფოკუსირებული ულტრაბგერითი კავიტაცია ამ შეზღუდვებს გადალახავს საფუარის სუსპენზიაზე ძლიერი მექანიკური ძვრის ძალების, წნევის რყევებისა და მიკრონაკადების ზემოქმედებით. შედეგად მიიღწევა უჯრედის კედლებისა და მემბრანების სწრაფი დაშლა, უჯრედშიდა კომპონენტების გაუმჯობესებული გამოთავისუფლება და ნიმუშების მომზადების მაღალი განმეორებადობა პლატის ფორმატში.

 

მიკროპლატური ულტრაბგერითი დამუშავება პარალელური საფუარის ნიმუშების მომზადებისთვის

Hielscher UIP400MTP და UIP550MTP შექმნილია მიკროპლატების, მრავალფოსოიანი პლატების, PCR პლატებისა და ნიმუშების შესაბამისი სადგამების ერთგვაროვანი ულტრაბგერითი დამუშავებისთვის. ზონდით ულტრაბგერითი დამუშავებისგან განსხვავებით, ნიმუშების ინდივიდუალური დამუშავება საჭირო არ არის. მთელი პლატა ექვემდებარება კონტროლირებადი ულტრაბგერითი ენერგიის ზემოქმედებას, რაც ამ სამუშაო პროცესს განსაკუთრებით შესაფერისს ხდის ნიმუშების პარალელური დამუშავებისთვის.

ეს განსაკუთრებით სასარგებლოა:

• სკრინინგი S. cerevisiae მუტანტების ან ექსპრესიის შტამების
• ლიზა P. pastoris / K. phaffii კლონების რეკომბინანტური ცილის ექსპრესიის შემდეგ
• საფუარის ლიზატების მომზადება ფერმენტული ანალიზებისთვის
• ცილის ექსტრაქცია SDS-PAGE, Western blot, ELISA, LC-MS/MS ან აქტივობის ტესტირებისთვის
• უჯრედშიდა მეტაბოლიტების გამოთავისუფლება მეტაბოლომიკისთვის
• DNA და RNA ნიმუშების მომზადება შესაბამისი შემდგომი გასუფთავების შემდეგ
• ლიზისის ბუფერების, დანამატებისა და ექსტრაქციის პირობების მაღალი გამტარუნარიანობის ოპტიმიზაცია

როგორ არღვევს ულტრაბგერითი კავიტაცია საფუარის უჯრედებს

ულტრაბგერითი დამუშავების დროს ფოკუსირებული მაღალი სიმძლავრის ულტრაბგერა თხევად ნიმუშში შეკუმშვისა და გაიშვიათების მონაცვლე ციკლებს წარმოქმნის. საკმარისი ინტენსივობის პირობებში წნევის ეს რყევები აკუსტიკურ კავიტაციას იწვევს. კავიტაციის ბუშტუკები წარმოიქმნება, ირხევა და კოლაფსირდება, რაც წარმოქმნის ლოკალურ ძვრის ძალებს, მიკროჭავლებს, ტურბულენტობასა და წნევის ძლიერ გრადიენტებს.
საფუარის სუსპენზიებში ეს მექანიკური ეფექტები ასუსტებს და არღვევს უჯრედის კედელსა და უჯრედის მემბრანას. უჯრედშიდა ცილები, ფერმენტები, ნუკლეინის მჟავები და მეტაბოლიტები გამოიყოფა ლიზისის ბუფერში. რადგან პროცესი მექანიკურია, მისი გამოყენება შესაძლებელია მრავალ სხვადასხვა ბუფერულ სისტემასთან ერთად და მისი შეთავსება შეიძლება პროტეაზის ინჰიბიტორებთან, აღმდგენ ნივთიერებებთან, დეტერგენტებთან, მარილებთან ან მსუბუქ ფერმენტულ წინასწარ დამუშავებასთან.

ზოგადი პროტოკოლი: საფუარის უჯრედების ლიზისი მიკროპლატებში

ქვემოთ მოცემული პროტოკოლი გთავაზობთ პრაქტიკულ საწყის წერტილს საფუარის ლიზისთვის Hielscher UIP400MTP ან UIP550MTP მიკროპლატის სონიკატორის გამოყენებით. პარამეტრები უნდა ოპტიმიზირდეს საფუარის შტამის, უჯრედების სიმკვრივის, მიზნობრივი მოლეკულის, ბუფერის შემადგენლობის, პლატის ტიპისა და შემდგომი ანალიზის შესაბამისად.

1. საფუარის უჯრედების შეგროვება და გარეცხვა

გაზარდეთ Saccharomyces, Pichia, Hansenula, Debaryomyces ან საფუარის სხვა შტამი სასურველი კულტივირების პირობებში. შეაგროვეთ უჯრედები ცენტრიფუგირებით და მოაცილეთ საკვები არე. გარეცხეთ ნალექი ცივი დისტილირებული წყლით, PBS-ით ან შერჩეული ლიზისის ბუფერით, რათა მოაცილოთ საკვები არის ნარჩენი კომპონენტები, რომლებმაც შეიძლება ხელი შეუშალოს შემდგომ ანალიზს.
ცილების ექსტრაქციისთვის, შეინარჩუნეთ ნიმუშები ცივი და იმუშავეთ სწრაფად. თუ პროტეაზები საფრთხეს წარმოადგენს, წინასწარ გააცივეთ ყველა ბუფერი და სახარჯო მასალები.

2. უჯრედული ნალექის რესუსპენდირება

რესუსპენდირეთ საფუარის ნალექი შესაბამის ცივ ლიზისის ბუფერში. ცილების ეფექტური გამოთავისუფლებისთვის უჯრედების მაღალი სიმკვრივე ხშირად ხელსაყრელია. საწყის ეტაპზე გამოიყენეთ დაახლოებით 10–20% w/v სველი უჯრედული ნალექი ან მკვრივი სუსპენზია, რომელიც შეესაბამება OD₆₀₀ > 10, ანალიზის შესაბამისად.

ტიპიური საფუარის ცილის ლიზის ბუფერი შეიძლება შეიცავდეს:

• ბუფერული სისტემა, როგორიცაა Tris-HCl, ფოსფატის ბუფერი ან HEPES
• მარილი, როგორიცაა NaCl ან KCl
• პროტეაზის ინჰიბიტორების კოქტეილი
• სურვილისამებრ აღმდგენი ნივთიერება, როგორიცაა DTT ან β-მერკაპტოეთანოლი
• სურვილისამებრ დეტერგენტი, როგორიცაა Triton X-100, NP-40, SDS ან CHAPS, შემდგომი თავსებადობის შესაბამისად
• სურვილისამებრ ფოსფატაზის ინჰიბიტორები ფოსფორილირების კვლევებისთვის

ძნელად დასაშლელი საფუარის შტამების შემთხვევაში ან ცილების ძალიან ნაზი ექსტრაქციისთვის ულტრაბგერით დამუშავებამდე შეიძლება ჩატარდეს ხანმოკლე წინასწარი დამუშავება Zymolyase-ით, Lyticase-ით ან უჯრედის კედლის დამშლელი სხვა ფერმენტით. ეს ფერმენტული წინასწარი დამუშავება აუცილებელი არ არის, თუმცა შეიძლება გაზარდოს ლიზისის ეფექტურობა ან შეამციროს ულტრაბგერის საჭირო ინტენსივობა.

3. ნიმუშების გადატანა შესაბამის მიკროპლატაში

გადაანაწილეთ საფუარის სუსპენზია ულტრაბგერით დამუშავებასთან თავსებად მიკროპლატაში. ხშირად უპირატესობა ენიჭება მრგვალძირიან პლატებს, რადგან ისინი აუმჯობესებენ ნიმუშის შეგროვებას და ამცირებენ მკვდარ ზონებს. განმეორებადობის გასაუმჯობესებლად ყველა ფოსოში გამოიყენეთ ნიმუშის თანაბარი მოცულობა.
ჰერმეტულად დახურეთ პლატა შესაბამისი დამხურავი საფენით ან ფირით აორთქლების, აეროზოლის წარმოქმნისა და ჯვარედინი კონტამინაციის თავიდან ასაცილებლად. დარწმუნდით, რომ დამხურავი მასალა თავსებადია შერჩეულ ტემპერატურასა და ულტრაბგერითი დამუშავების პირობებთან.
ტიპიური სამუშაო მოცულობები დამოკიდებულია პლატის ფორმატსა და გამოყენებაზე. გავრცელებული ფორმატები მოიცავს 96-ფოსოიან პლატებს, ღრმაფოსოიან პლატებს, PCR პლატებს ან სინჯარების შესაბამის სადგამებს.

4. გაგრილების დაყენება

საფუარის ლიზი მოითხოვს მაღალ ულტრაბგერით ინტენსივობას, და მექანიკური დანგრევა წარმოქმნის სითბოს. ტემპერატურის კონტროლი ამიტომ კრიტიკულია, განსაკუთრებით ცილების, ფერმენტების, RNA-ს ან ფოსფორილირების ანალიზისთვის.

გამოიყენეთ შესაბამისი გაგრილების სტრატეგია, როგორიცაა:

• წინასწარ გაგრილებული ლიზის ბუფერი
• წინასწარ გაგრილებული მიკროპლატები
• გაგრილების პაუზები ულტრაბგერითი დამუშავების ინტერვალებს შორის
• ულტრაბგერითი დამუშავების პლატფორმის გარე გაგრილება, სადაც შესაძლებელია

მიზანია შეინარჩუნოს ნიმუში საკმარისად ცივი, რათა თავიდან იქნას აცილებული ცილების დენატურაცია, ფერმენტების ინაქტივაცია, RNA-ს დეგრადაცია და სითბოთი გამოწვეული ნიმუშის ვარიაციულობა.

5. საფუარის სუსპენზიის ულტრაბგერითი დამუშავება

მოათავსეთ ჰერმეტულად დახურული პლატა Hielscher UIP400MTP ან UIP550MTP მიკროპლატების სონიკატორში და აირჩიეთ იმპულსური ულტრაბგერითი დამუშავების პროგრამა. იმპულსური რეჟიმი რეკომენდებულია, რადგან ის უზრუნველყოფს მექანიკურ დაშლას ჩართვის (ON) ფაზების დროს და სითბოს გაფანტვას გამორთვის (OFF) ფაზების დროს.
საფუარის უჯრედების ლიზისის საწყისი პარამეტრები:

ძალიან მდგრადი საფუარის სუსპენზიების, P. pastoris-ის მკვრივი ბიომასის ან რეკომბინანტური ცილების რთული ექსტრაქციის შემთხვევაში, ეტაპობრივად გაზარდეთ ჯამური ჩართვის დრო. თბომგრძნობიარე ცილებისთვის ან ფერმენტული აქტივობის ტესტებისთვის გამოიყენეთ უფრო მოკლე იმპულსები, უფრო ხანგრძლივი გაცივების პაუზები და უფრო დაბალი საწყისი ამპლიტუდა.

საფუარის მაღალი გამტარუნარიანობის ლიზი მრავალფოსოიან პლატებში UIP400MTP-ის გამოყენებით

6. ლიზატის გასუფთავება

ულტრაბგერითი დამუშავების შემდეგ ცენტრიფუგირეთ მიკროპლატა ან გადაიტანეთ ნიმუშები სინჯარებში ცენტრიფუგირებისთვის. მოაცილეთ უჯრედული ნამსხვრევები ცენტრიფუგირების გზით შესაბამისი სიჩქარითა და ტემპერატურით. შეაგროვეთ ზედა ფენა (სუპერნატანტი) შემდგომი ანალიზისთვის.

გამოყენების მიზნიდან გამომდინარე, ლიზატი შეიძლება გამოყენებულ იქნას შემდეგი მიზნებისთვის:

• ცილების რაოდენობრივი განსაზღვრა
• ფერმენტული აქტივობის ტესტები
• SDS-PAGE და ვესტერნ ბლოტინგი
• ELISA და იმუნოანალიზები
• LC-MS/MS პროტეომიკა
• მეტაბოლიტების ანალიზი
• დნმ-ის ან რნმ-ის გასუფთავება

7. მეთოდის ოპტიმიზაცია და დოკუმენტირება

საფუარის ლიზის განმეორებადობისთვის დააფიქსირეთ ყველა შესაბამისი პარამეტრი, მათ შორის შტამი, კულტივირების პირობები, OD₆₀₀, სველი უჯრედული მასა, ბუფერის შემადგენლობა, პლატის ტიპი, ნიმუშის მოცულობა, ამპლიტუდა, იმპულსური ციკლი, ჯამური ჩართვის დრო, გაცივების მეთოდი და ნიმუშის საბოლოო ტემპერატურა.
თუ Hielscher-ის სონიკატორი აღჭურვილია მონაცემთა ავტომატური ჩაწერის ფუნქციით, პროცესის მონაცემები შეიძლება გამოყენებულ იქნას დოკუმენტირებისთვის, მეთოდის შემუშავებისთვის, მასშტაბირებისთვის და ხარისხის კონტროლისთვის.

ოპტიმიზაციის რჩევები საფუარის ლიზისთვის

ცილების მაქსიმალური გამოყოფისთვის გამოიყენეთ საფუარის მკვრივი სუსპენზიები, მაღალი ულტრაბგერითი ინტენსივობა და საკმარისი ჯამური ჩართვის დრო. მგრძნობიარე ცილებისთვის შეამცირეთ ამპლიტუდა, გაზარდეთ გაცივების პაუზები და შეინარჩუნეთ პლატა გრილად მთელი პროცესის განმავლობაში.
თუ ლიზი არასრულია, ეტაპობრივად გაზარდეთ ულტრაბგერითი დამუშავების დრო, სცადეთ ფერმენტული წინასწარი დამუშავება, შეამცირეთ ნიმუშის სიბლანტე ან გააუმჯობესეთ ბუფერი. თუ ცილები იშლება ან კარგავს აქტივობას, გააუმჯობესეთ გაცივება, შეამცირეთ ჩართვის ინტერვალები, დაამატეთ ინჰიბიტორები და დარწმუნდით, რომ დეტერგენტული სისტემა თავსებადია სამიზნე ცილასთან.
რადგან საფუარის შტამები მნიშვნელოვნად განსხვავდება უჯრედის კედლის სტრუქტურით, ზრდის ფაზით, ექსპრესიის სისტემით და ბიომასის სიმკვრივით, რეკომენდებულია მოკლე ოპტიმიზაციის მატრიცა. მაგალითად, სცადეთ სამი ამპლიტუდა, ორი იმპულსური ციკლი და ორი ჯამური ჩართვის დრო, შემდეგ კი შეაფასეთ ლიზის ეფექტურობა და ცილების მთლიანობა.

Hielscher-ის მიკროპლატის სონიკატორების უპირატესობები საფუარის ლიზისთვის

Hielscher-ის მიკროპლატის სონიკატორები იდეალურია ლაბორატორიებისთვის, რომლებსაც მრავალ ნიმუშში განმეორებადი ლიზის შედეგები სჭირდებათ. ისინი გამორიცხავენ ზონდით ულტრაბგერითი დამუშავებისას ნიმუშების ნელ, სათითაოდ დამუშავებას და ამცირებენ ცვალებადობას, რომელიც გამოწვეულია ზონდის ხელით განლაგებით, ჩაძირვის სიღრმითა და ნიმუშების დამუშავების განსხვავებებით.

ძირითადი უპირატესობები მოიცავს:

• მაღალი გამტარუნარიანობის დამუშავება: ულტრაბგერით დაამუშავეთ საფუარის მრავალი ნიმუში პარალელურად მიკროპლატებში ან ნიმუშების თავსებად შტატივებში.
• განმეორებადი პირობები: ულტრაბგერითი დამუშავების ერთნაირი პირობები ყველა ფოსოში ლიზის ერთგვაროვანი, შედარებადი შედეგებისთვის.
• ზონდით გამოწვეული ჯვარედინი კონტამინაციის არარსებობა: ნიმუშები რჩება დახშული ულტრაბგერითი დამუშავების დროს, რაც ამცირებს გადატანას და გასუფთავების ეტაპებს.
• მდგრადი უჯრედებისთვის შესაფერისი: მაღალი ინტენსივობის ულტრაბგერა ხელს უწყობს საფუარის უჯრედების კედლების დესტრუქციას.
• ეფექტური სამუშაო პროცესი: იდეალურია შტამების, კლონების, ექსპრესიის პირობებისა და ლიზის ბუფერების სკრინინგისთვის.
• ეფექტური სამუშაო პროცესი: პროგრამირებადი პარამეტრები, ავტომატური მონაცემთა ჩაწერა და შესაფერისი ლაბორატორიული ავტომატიზაციისთვის.

გამოყენება საფუარის ბიოტექნოლოგიასა და სიცოცხლის მეცნიერების კვლევებში

საფუარის ულტრაბგერითი ლიზა მიკროპლატებში უზრუნველყოფს მრავალ კვლევით და სკრინინგ სამუშაო პროცესს. რეკომბინანტული ცილის ექსპრესიისას, P. pastoris და S. cerevisiae კლონები შეიძლება პარალელურად დაილიზოს ექსპრესიის დონეების ან ფერმენტული აქტივობის შესადარებლად. სისტემურ ბიოლოგიასა და ომიკაში, სტანდარტიზებული ლიზა აუმჯობესებს შედარებადობას პირობებს შორის. მიკრობიოლოგიაში, ულტრაბგერითი დამუშავება ხელს უწყობს ლიზატების სწრაფ მომზადებას მრავალი შტამიდან, საკვები გარემოს პირობებიდან ან სტრესული ზემოქმედებიდან.
ტიპიური გამოყენების სფეროები მოიცავს:

• საფუარის ცილის ექსტრაქცია
• რეკომბინანტული ცილის სკრინინგი
• ფერმენტული აქტივობის სკრინინგი
• კლონის შერჩევა ტრანსფორმაციის შემდეგ
• ფერმენტაციის ოპტიმიზაცია
• პროტეომიკის ნიმუშების მომზადება
• მეტაბოლომიკის ნიმუშების მომზადება
• უჯრედის კედლის დისრუფციის კვლევები
• მაღალი გამტარუნარიანობის მიკრობიოლოგიური ანალიზები

საიმედო საფუარის ლიზა იწყება კონტროლირებადი ულტრაბგერითი დამუშავებით

საფუარის ლიზა შეიძლება გახდეს რთული, როდესაც ნიმუშების რაოდენობა იზრდება, მაგრამ Hielscher-ის მიკროპლატის სონიკატორები პროცესს უფრო სწრაფს, სუფთასა და განმეორებადს ხდიან. UIP400MTP და UIP550MTP მკვლევრებს საშუალებას აძლევს, დაამუშაონ მთლიანი პლატები განსაზღვრულ ულტრაბგერით პირობებში, რაც ზრდის გამტარუნარიანობას და ამცირებს ხელით მუშაობას.
მიკრობიოლოგებისთვის, მოლეკულური ბიოლოგებისთვის, ცილების მკვლევრებისა და ბიოტექნოლოგიური ლაბორატორიებისთვის მიკროპლატის ულტრაბგერითი დამუშავება მძლავრი ინსტრუმენტია საფუარის უჯრედშიდა კომპონენტების ეფექტურად და განმეორებადად გამოსათავისუფლებლად.

ლიტერატურა / რეფერენსები

• FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
• FactSheet UIP550MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
• Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
• Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics 2024.