მაღალი ინტენსივობის სონიკაციის გამოყენება საფუარების უჯრედთა დაშლაში მიკროლედებში
მიკრობიოლოგებს და სიცოცხლის მეცნიერებების მკვლევარებს, რომლებიც მუშაობენ saccharomyces cerevisiae, პიჩია პასტორისი / Komagataella phaffiiდა სხვა საფუარის სისტემებს იციან გამოწვევა: საფუარის უჯრედები ძლიერი არიან, ხელმოწერილი დაშლა ძნელია და მექანიკური ნიმუშის დაყოფა სწრაფად ხდება ბოთლნეკი, როდესაც ბევრი შტამი, კლონი, კულტივირების პირობები ან ექსპრესიის კონსტრუქცია უნდა შეისწავლოთ.
მაღალი გამტარუნარიანობის საფუარის ლიზისი მიკრობიოლოგიის, მოლეკულური ბიოლოგიისა და ცილის ანალიტიკისთვის
Hielscher microplate sonicators, როგორიცაა UIP400MTP (400 W) და UIP550MTP (550 W) უზრუნველყოფს მაღალი გამტარუნარიანობის გადაწყვეტას მექანიკური საფუარის უჯრედების ლიზისისთვის პირდაპირ მიკროფირფიტებში. იმის ნაცვლად, რომ ნიმუშები სათითაოდ დაამუშავოთ ზონდით, მთელი მიკროფირფიტები შეიძლება გაჟღერდეს ერთგვაროვან პირობებში. ეს ხდის ულტრაბგერითი საფუარის ლიზისს უფრო სწრაფს, უფრო რეპროდუცირებადს და აადვილებს ინტეგრირებას თანამედროვე მიკრობიოლოგიაში, ცილის ექსპრესიაში, ფერმენტების სკრინინგში და ომიკის სამუშაო პროცესებში.
გჭირდებათ რეკომბინანტური პროტეინების გამოშვების P. pastoris–დან, საფურის ლიზატების მომზადება ფერმენტის ანალიზისთვის, S. cerevisiae–ის დესტრუქცია პროტეინების ანალიზისთვის, ან რამდენიმე საფურის კლონის პარალელური შემოწმება, Hielscher–ის მიკროტალღის სონიკატორები უზრუნველყოფენ ძლიერს კავიტაციაზე დაფუძნებულ უჯრედების დაქუცმაცებას ზუსტი პროცესის კონტროლით.
გჭირდებათ გამეორებადი ლიზისი S. cerevisiae, P. pastoris, ან სხვა საფურის შტამების მიკრულ ფენებში? გაგვიზიარეთ თქვენი ფენის ფორმატი, ნიმუშის მოცულობა, უჯრედების სიმკვრივე და მიზანი ანალიტისთვის. ჩვენ დაგეხმარებით განსაზღვროთ შესაბამისი სონიკაციის პარამეტრები თქვენი UIP400MTP ან UIP550MTP სამუშაო პროცესისთვის.
Hielscher–ის მრავალშახტიანი ფენის სონიკატორი საფურის ლიზისთვის – ნიმუშის მომზადება მაღალგამტარულ რეჟიმში
რატომ სჭირდება საფურის უჯრედებს ეფექტური მექანიკური ლიზისი
საფუარის უჯრედების ლიზირება უფრო რთულია, ვიდრე მრავალი ბაქტერიული ან ძუძუმწოვრების უჯრედი, რადგან ისინი დაცულია ხისტი უჯრედის კედლით, რომელიც შედგება ძირითადად პოლისაქარიდების, გლუკანების, მანოპროტეინებისა და ქიტინისგან. ეს უჯრედის კედელი უზრუნველყოფს მექანიკურ სტაბილურობას, მაგრამ ის ასევე ზღუდავს უჯრედშიდა ცილების, ნუკლეინის მჟავების, მეტაბოლიტების და ფერმენტების გამოყოფას.
საფუარის ლიზისის ჩვეულებრივი მეთოდები მოიცავს მძივების ცემას, ფერმენტულ მონელებას, გაყინვა-დათბობის ციკლებს, ქიმიურ ლიზისს და ზონდის ტიპის გაჟონვას. ეს მეთოდები შეიძლება იყოს ეფექტური, მაგრამ მათ ასევე აქვთ შეზღუდვები. მძივების ცემამ შეიძლება შემოიტანოს ნამსხვრევები და გათბობა, ფერმენტულმა მონელებამ შეიძლება დაამატოს ღირებულება და ცვალებადობა, ხოლო ერთი ნიმუშის ზონდის გაჟონვა შრომატევადია, როდესაც ნიმუშის დიდი რაოდენობა უნდა დამუშავდეს.
მაღალსიხშირიანი, კონცენტრირებული ულტრაბგერითი კავიტაცია აჭარბებს ამ შეზღუდვებს, ახორციელებს მექანიკური დაძაბვის ძლიერი ძალების, წნევის ცვალებადობისა და მიკროკნილების გამოყენებით საფუარის სუსპენზიაზე. შედეგია უჯრედის კედლებისა და მემბრანების სწრაფი რღვევის, უჯრედშიგა კომპონენტების გაორმაგებული გამოშვების და ძალიან გამეორებადი ნიმუშების მომზადება ფირფიტის ფორმატში.
მაიკროპლატის სონიკაცია პარალელური საფუარის ნიმუშების მომზადებისთვის
Hielscher UIP400MTP და UIP550MTP შექმნილია მაიკროპლატების, მულტიველის ფირფიტების, PCR ფირფიტების ერთგვაროვანი სონიკაციისთვის და შესაბამისი ნიმუშების რაკებისთვის. განსხვავებით პრობის სონიკაციისაგან, ნიმუშებს არ სჭირდებათ ინდივიდუალურად მუშავება. მთელი ფირფიტა ექოდება კონტროლირებად ულტრაბგერით ენერგიას, რაც სამუშაო პროცესს იდეალურს ხდის პარალელური ნიმუშების დამუშავებისთვის.
ეს განსაკუთრებით სასარგებლოა:
- სკრინინგი S. cerevisiae მუტანტები ან გამოხატვის შტამები
- ლიზისი P. pastoris / K. phaffii კლონები რეკომბინანტული ცილის ექსპრესიის შემდეგ
- საფუარის ლიზატების მომზადება ფერმენტების ანალიზისთვის
- ცილის ექსტრაქცია SDS-PAGE-ისთვის, Western Blot, ELISA, LC-MS / MS ან აქტივობის ტესტირება
- უჯრედშიდა მეტაბოლიტების გამოყოფა მეტაბოლომიკისთვის
- დნმ-ისა და რნმ-ის ნიმუშის მომზადება შესაბამისი ქვედა დინების გაწმენდის შემდეგ
- ლიზისის ბუფერების, დანამატების და მოპოვების პირობების მაღალი გამტარუნარიანობის ოპტიმიზაცია
როგორ არღვევს ულტრაბგერითი კავიტაცია საფუარის უჯრედებს
გაჟონვის დროს, ფოკუსირებული მაღალი სიმძლავრის ულტრაბგერითი წარმოქმნის ალტერნატიულ შეკუმშვას და იშვიათობის ციკლებს თხევად ნიმუშში. საკმარისი ინტენსივობით, წნევის ეს რყევები ქმნის აკუსტიკური კავიტაციას. კავიტაციის ბუშტები ქმნიან, რხევად და იშლება, წარმოქმნიან ლოკალიზებულ ათვლის ძალებს, მიკროჯეტებს, ტურბულენტობას და ძლიერ წნევის გრადიენტებს.
საფუარის სუსპენზიებში ეს მექანიკური ეფექტები ასუსტებს და ანადგურებს უჯრედის კედელს და უჯრედის მემბრანას. უჯრედშიდა ცილები, ფერმენტები, ნუკლეინის მჟავები და მეტაბოლიტები გამოიყოფა ლიზისის ბუფერში. ვინაიდან პროცესი მექანიკურია, ის შეიძლება გამოყენებულ იქნას სხვადასხვა ბუფერულ სისტემასთან და შეიძლება გაერთიანდეს პროტეაზას ინჰიბიტორებთან, შემცირების აგენტებთან, სარეცხი საშუალებებთან, მარილებთან ან რბილი ფერმენტულ წინასწარ დამუშავებასთან.
ზოგადი პროტოკოლი: საფუარის უჯრედების ლიზისი მიკროფირფიტებში
შემდეგი პროტოკოლი უზრუნველყოფს საფუარის ლიზისის პრაქტიკულ საწყის წერტილს Hielscher UIP400MTP ან UIP550MTP მიკროფირფიტის სონიკატორის გამოყენებით. პარამეტრების ოპტიმიზირებული უნდა იყოს საფუარის შტამის, უჯრედის სიმკვრივის, სამიზნე მოლეკულის, ბუფერული შემადგენლობის, ფირფიტის ტიპისა და ქვედა დინების ანალიზის მიხედვით.
1. მოსავლის აღება და გარეცხვა საფუარის უჯრედები
მოყვანეთ Saccharomyces, Pichia, Hansenula, Debaryomyces ან სხვა საფუარის შტამი სასურველ კულტურის პირობებში. უჯრედების მოსავლის აღება ცენტრიფუგაციით და ამოიღეთ კულტურის საშუალება. გარეცხეთ მარცვლები ცივი გამოხდილი წყლით, PBS-ით ან შერჩეული ლიზისის ბუფერით, რათა ამოიღოთ ნარჩენი საშუალო კომპონენტები, რამაც შეიძლება ხელი შეუშალოს ქვედა დინების ანალიზს.
ცილის მოპოვებისთვის შეინახეთ ნიმუშები ცივი და სწრაფად იმუშავეთ. თუ პროტეაზები შემაშფოთებელია, წინასწარ გააცივეთ ყველა ბუფერი და სახარჯო მასალა.
2. ხელახლა შეაჩერეთ უჯრედის მარცვლები
შეაჩერეთ საფუარის მარცვლები შესაფერის ცივი ლიზისის ბუფერში. ცილის ეფექტური გამოთავისუფლებისთვის, უჯრედების მაღალი სიმკვრივე ხშირად ხელსაყრელია. როგორც ამოსავალი წერტილი, გამოიყენეთ დაახლოებით 10-20% w / v სველი უჯრედის მარცვლები ან მკვრივი სუსპენზია, რომელიც შეესაბამება OD600 > 10, რაც დამოკიდებულია ანალიზზე.
ტიპიური საფუარის ცილის ლიზისის ბუფერი შეიძლება შეიცავდეს:
- ბუფერული სისტემა, როგორიცაა Tris-HCl, ფოსფატის ბუფერი ან HEPES
- მარილი, როგორიცაა NaCl ან KCl
- პროტეაზას ინჰიბიტორი კოქტეილი
- სურვილისამებრ შემცირების აგენტი, როგორიცაა DTT ან β-მერკაპტოეთანოლი
- სურვილისამებრ სარეცხი საშუალება, როგორიცაა Triton X-100, NP-40, SDS ან CHAPS, რაც დამოკიდებულია ქვედა დინების თავსებადობაზე
- სურვილისამებრ ფოსფატაზას ინჰიბიტორები ფოსფორილაციის კვლევებისთვის
რთული საფუარის შტამებისთვის ან ძალიან ნაზი ცილის ექსტრაქციისთვის, მოკლე წინასწარი მკურნალობა Zymolyase, Litticase ან სხვა უჯრედის კედლის საჭმლის მომნელებელი ფერმენტის გამოყენება შესაძლებელია გაჟონვის წინ. ეს ფერმენტული წინასწარი დამუშავება არჩევითია, მაგრამ შეიძლება გააუმჯობესოს ლიზისის ეფექტურობა ან შეამციროს საჭირო ულტრაბგერითი ინტენსივობა.
3. გადაიტანეთ ნიმუშები შესაფერის მიკროფირფიტაში
გაანაწილეთ საფუარის სუსპენზია სონიკასთან თავსებად მიკროფირფიტაში. მრგვალი ფსკერის ფირფიტები ხშირად სასურველია, რადგან ისინი აუმჯობესებენ ნიმუშების შეგროვებას და ამცირებენ მკვდარ ზონებს. გამოიყენეთ ნიმუშის თანაბარი მოცულობა ჭაბურღილებში განმეორებადობის გასაუმჯობესებლად.
დალუქეთ ფირფიტა შესაფერისი დალუქვის ხალიჩით ან ფირით, რათა თავიდან აიცილოთ აორთქლება, აეროზოლის წარმოქმნა და ჯვარედინი დაბინძურება. დარწმუნდით, რომ ბეჭედი თავსებადია არჩეულ ტემპერატურასთან და გაჟონვის პირობებთან.
ტიპიური სამუშაო მოცულობები დამოკიდებულია ფირფიტის ფორმატსა და გამოყენებაზე. საერთო ფორმატებში შედის 96 ჭაბურღილის ფირფიტები, ღრმა ჭაბურღილის ფირფიტები, PCR ფირფიტები ან შესაფერისი მილის თაროები.
4. დააყენეთ გაგრილება
საფუარის ლიზისი მოითხოვს მაღალ ულტრაბგერით ინტენსივობას, ხოლო მექანიკური დარღვევა წარმოქმნის სითბოს. ამიტომ ტემპერატურის კონტროლი გადამწყვეტია, განსაკუთრებით ცილის, ფერმენტის, რნმ-ის ან ფოსფორილაციის ანალიზისთვის.
გამოიყენეთ შესაბამისი გაგრილების სტრატეგია, როგორიცაა:
- წინასწარ გაცივებული ლიზისის ბუფერი
- წინასწარ გაცივებული მიკროფირფიტები
- გაგრილების პაუზები გაჟონვის ინტერვალებს შორის
- გაჟონვის პლატფორმის გარე გაგრილება, სადაც ეს შესაძლებელია
მიზანია ნიმუშის საკმარისად ცივი შენარჩუნება, რათა თავიდან იქნას აცილებული ცილის დენატურაცია, ფერმენტის ინაქტივაცია, რნმ-ის დეგრადაცია და სითბოთი გამოწვეული ნიმუშის ცვალებადობა.
5. Sonicate the Yeast Suspension
მოათავსეთ დალუქული ფირფიტა Hielscher UIP400MTP ან UIP550MTP მიკროფირფიტის სონიკატორში და შეარჩიეთ იმპულსური გაჟონვის პროგრამა. პულსირება რეკომენდირებულია, რადგან ის საშუალებას იძლევა მექანიკური დარღვევა ON ფაზების დროს და სითბოს გაფრქვევა OFF ფაზების დროს.
როგორც საფუარის უჯრედების ლიზისის საწყისი წერტილი:
| პარამეტრი | რეკომენდებული საწყისი დიაპაზონი | მიზანი |
|---|---|---|
| დიაპაზონი | 60-100% | მაღალი კავიტაციის ინტენსივობა ძლიერი საფუარის უჯრედებისთვის |
| პულსის რეჟიმი | 10-30 წმ ჩართვა / 30-60 წმ გამორთვა | ეფექტური ლიზისი კონტროლირებადი სითბოს დაგროვებით |
| კუმულაციური დროულად | 5-15 წთ | დაარეგულირეთ დაძაბულობის, სიმკვრივისა და სამიზნე მოლეკულის მიხედვით |
| ტემპერატურა | შეინახეთ ნიმუშები ცივი | დაიცავით ცილები, ფერმენტები, რნმ და მეტაბოლიტები |
| ფირფიტის დალუქვა | რეკომენდებული | ხელს უშლის აორთქლებას, აეროზოლის წარმოქმნას და ჯვარედინი დაბინძურებას |
უაღრესად მდგრადი საფუარის სუსპენზიებისთვის, მკვრივი P. pastoris ბიომასა ან რთული რეკომბინანტული ცილის ექსტრაქცია, გაზრდის კუმულაციურ დროულად ეტაპობრივად. სითბოს მგრძნობიარე ცილების ან ფერმენტების ანალიზისთვის გამოიყენეთ უფრო მოკლე იმპულსები, უფრო გრძელი გაგრილების პაუზები და დაბალი საწყისი ამპლიტუდა.
მაღალი გამტარუნარიანობის საფუარის ლიზისი მრავალჭაბურღილის ფირფიტებში UIP400MTP
6. განმარტეთ ლიზატი
სონიკაციის შემდეგ, ცენტრიფუგირეთ მიკროფლეთა ან გადაიტანეთ ნიმუშები ტრიბებში ცენტრიფუგაციისთვის. უჯრედის ნაგავები მოცილეთ შესაფერისი სიჩქარით და ტემპერატურით ცენტრიფუგაციით. დააგროვეთ სუპერნატანტი შემდგომი ანალიზისთვის.
გამოყენების მიხედვით, ლიზატი შეიძლება გამოყენებულ იქნას:
- ცილების რაოდენობრივი განსაზღვრა
- ენზიმის აქტივობის ანალიზისთვის
- SDS-PAGE და ვესტერნ ბლოტინგისთვის
- ELISA და იმუნო ანალიზებისთვის
- LC-MS/MS პროტეომიკა
- მეტაბოლიტების ანალიზი
- დნმ-ის ან რნმ-ის გაწმენდა
7. მეთოდის ოპტიმიზაცია და დოკუმენტირება
რეპროდუცირებადი საფუარის ლიზისისთვის, დააფიქსირეთ ყველა შესაბამისი პარამეტრი, მათ შორის დაძაბულობა, კულტურის მდგომარეობა, OD600, სველი უჯრედის მასა, ბუფერული შემადგენლობა, ფირფიტის ტიპი, ნიმუშის მოცულობა, ამპლიტუდა, პულსის ციკლი, კუმულაციური დროულად, გაგრილების მეთოდი და საბოლოო ნიმუშის ტემპერატურა.
თუ Hielscher sonicator აღჭურვილია მონაცემთა ავტომატური ჩაწერით, პროცესის მონაცემები შეიძლება გამოყენებულ იქნას დოკუმენტაციისთვის, მეთოდის შემუშავება, მასშტაბირება და ხარისხის კონტროლი.
ოპტიმიზაციის რჩევები საფუარის ლიზისისთვის
ცილის მაქსიმალური გამოთავისუფლებისთვის გამოიყენეთ მკვრივი საფუარის სუსპენზიები, მაღალი ულტრაბგერითი ინტენსივობა და საკმარისი კუმულაციური დროულად. მგრძნობიარე ცილებისთვის, შეამცირეთ ამპლიტუდა, გაახანგრძლივეთ გაგრილების პაუზები და შეინახეთ ფირფიტა ცივი მთელი სირბილის განმავლობაში.
თუ ლიზისი არასრულია, გაზარდეთ გაჟონვის დრო ეტაპობრივად, შეამოწმეთ ფერმენტული წინასწარი დამუშავება, შეამცირეთ ნიმუშის სიბლანტე ან გააუმჯობესეთ ბუფერი. თუ ცილები დეგრადირდება ან კარგავს აქტივობას, აუმჯობესებს გაგრილებას, ამცირებს ON ინტერვალებს, დაამატეთ ინჰიბიტორები და შეამოწმეთ, რომ სარეცხი სისტემა თავსებადია სამიზნე ცილასთან.
რადგან გულარტყმის ტიპები მნიშვნელოვნად განსხვავდებიან უჯრედის გარსის სტრუქტურაში, ზრდის ფაზაში, გამოხატვის სისტემაში და ბიომასის სიმკვრივეში, რეკომენდებულია მოკლე ოპტიმიზაციის მატრიცა. მაგალითად, შეამოწმეთ სამი ამპლიტუდა, ორი პულსის ციკლი და ორი მთლიან ON-ბარი, შემდეგ შეფასეთ ლიზის ეფექტურობა და پروტეინის სიმტკიცე.
როცა თქვენ ამუშავებთ რამდენიმე ასაი პლატას ან ატარებთ მაღალი გამავლობის გულარტყმის სკრინინგს, ჰილსჩერი დაგეხმარებათ სწორი მიკროპლატელური სონიკატორის არჩევაში და მყარი ლიზის პროტოკოლის განვითარებაში. დაუკავშირდით ჩვენთვის თქვენი გულარტყმის ტიპით, სამუშაო პროცესით და გამავლობის მოთხოვნილებებით!
ჰილსჩერის მიკროპლატელური სონიკატორების უპირატესობები გულარტყმის ლიზისთვის
Hielscher microplate sonicators იდეალურია ლაბორატორიებისთვის, რომლებსაც სჭირდებათ განმეორებადი ლიზისი ბევრ ნიმუშში. ისინი აღმოფხვრის ზონდის გაჟონვის ნელ ერთჯერადად დამუშავებას და ამცირებენ ცვალებადობას, რომელიც გამოწვეულია ზონდის ხელით პოზიციონირებით, ჩაძირვის სიღრმით და ნიმუშიდან ნიმუშის დამუშავების განსხვავებებით.
ძირითადი უპირატესობები მოიცავს:
- მაღალი გამტარუნარიანობის დამუშავება: გაჟღენთილი მრავალი საფუარის ნიმუში პარალელურად მიკროფირფიტებში ან თავსებადი ნიმუშის თაროებში.
- განმეორებადი პირობები: ყველა ჭურჭელში ერთსა და იმავე სონიკაციის პირობები ერთგვარი, შედარებადი ლიზის შედეგისთვის.
- არ არის ზონდის ჯვარედინი დაბინძურება: ნიმუშები დალუქული რჩება გაჟონვის დროს, გადატანისა და დასუფთავების ნაბიჯების შემცირება.
- ვარგისია ძლიერი უჯრედებისთვის: მაღალი ინტენსივობის ულტრაბგერითი მხარს უჭერს საფუარის უჯრედების კედლების დარღვევას.
- ეფექტური სამუშაო პროცესი: იდეალურია შტამების, კლონების, გამოხატვის პირობებისა და ლიზისის ბუფერების სკრინინგისთვის.
- ეფექტური სამუშაო პროცესი: პროგრამირებადი პარამეტრები, ავტომატური მონაცემების ლოგირება და ლაბორატორიული ავტომატიზაციისთვის შესაფერისი.
საფუარის ბიოტექნოლოგიასა და სიცოცხლის მეცნიერებათა კვლევებში გამოყენება
მიკროწნილებებში ულტრასონიკური საფუარის ლიზისი მხარს უჭერს მრავალ კვლევით და სკრინინგულ სამუშაო პროცესებს. რეკომბინანტული პროტეინის ექსპრესიაში, P. pastoris-ის და S. cerevisiae-ს კლონები შეიძლება პარალელურად დაშლას მიეღოს, რათა შეადაროთ ექსპრესიის დონეები ან ენისიმის აქტივობა. სისტემური ბიოლოგიასა და ომიკის სფეროში სტანდარტიზებული ლიზისი აუმჯობესებს პირობებს შორის შედარებადობას. მიკრობიოლოგიაში, სონიკაცია უზრუნველყოფს ლიზატის სწრაფ მომზადებას რამდენიმე შტამიდან, საშუალო პირობებიდან ან სტრესული მკურნალობებიდან.
ტიპიური გამოყენების სფეროები მოიცავს:
- საფუარის ცილის ექსტრაქცია
- რეკომბინანტული ცილის სკრინინგი
- ფერმენტის აქტივობის სკრინინგი
- კლონის შერჩევა ტრანსფორმაციის შემდეგ
- დუღილის ოპტიმიზაცია
- პროტეომიკის ნიმუშის მომზადება
- მეტაბოლომიკის ნიმუშის მომზადება
- უჯრედის კედლის დარღვევის კვლევები
- მაღალი გამტარუნარიანობის მიკრობიოლოგიური ანალიზები
საიმედო საფუარის ლიზისი იწყება კონტროლირებადი Sonication
სადგური საფუარის ლიზის შეუძლებელია, როდესაც ნიმუშების რაოდენობა იზრდება, მაგრამ Hielscher-ის მიკროპლატფორმის სონიკატორები პროცესს სწრაფს, სუფთას და უფრო გამეორებადს ხდის. UIP400MTP და UIP550MTP საშუალებას აძლევს მკვლევრებს პროცესში ჩაატარონ სრული ფირფიტები განსაზღვრულ ულტრაბგერითი პირობებში, რაც აუმჯობესებს გამავალი მონაცემების რაოდენობას და ამცირებს მექანიკურ მოპყრობას.
მიკრობიოლოგებისთვის, მოლეკულური ბიოლოგებისთვის, პროტეინის მეცნიერთათვის და ბიოტექნოლოგიური ლაბორატორიებისთვის, მიკროპლატფორმის სონიკაცია ეფექტური და გამეორებადი საშუალებაა სელულის შიგა საფუარის კომპონენტების გასათავისუფლებლად.
ხშირად დაუსმული კითხვები შაქრობის სელების ლიზისის შესახებ მიკროპლატიანი სონიკაციის გამოყენებით
შაქრობის სელები შეიძლება იქნას დაშლილი სონიკაციით?
კი. შაქრობის სელები, როგორიცაა Saccharomyces cerevisiae და Pichia pastoris, შეიძლება დაშლილი იქნას მაღალი ინტენსივობის სონიკაციით. ულტრასონიკური კავიტაცია წარმოშობს ძლიერ მექანიკურ ქაროსმასებულ ძალებს, რომლებიც შლის შაქრობის სელის კედელს და მემბრანას, გამოყოფს პროტეინებს, ენზიმებს, ნუკლეინის მჟავებს და მეტაბოლიტებს.
რატომ არის შაქრობის სელების დაშლა უფრო რთული, ვიდრე ბაქტერიული სელების?
შაქრობის სელებს აქვთ სქელი და მექანიკურად რეზისტენტული სელის კედელი, რომელიც ძირითადად შედგება გლუკანებისგან, მანნოპროტეინებისგან და ქიტინისგან. ეს მყარად სტრუქტურა შაქრობს უფრო რთულს ხდის დაშლას, ვიდრე მრავალი ბაქტერიული ან ძუძუმწოვრიანი სელი. ამიტომ, შაქრობის სელის ლიზა ჩვეულებრივ მოითხოვს უფრო მაღალ ინტენსივობას, უფრო ხანგრძლივ პროცესირებას ან პარალელურად ენზიმური წინასწარი მკურნალობის გამოყენებას.
რომელი Hielscher-ს სონიკატორებია შესაფერისი საფუვრის ლიზისთვის მიკროტაქტებში?
Hielscher UIP400MTP და UIP550MTP შესაფერისია მაღალი წარმადობის საფუვრის ლიზისთვის მიკროტაქტებში. UIP400MTP იდეალურია რუტინული პარალელური ნიმუშების მომზადებისთვის, ხოლო UIP550MTP უზრუნველყოფს მეტ ულტრასონიკურ ძალას მოთხოვნადი ლიზის სამუშაოებისთვის, სიმკვრივით სქელი სუსპენზიებისთვის და მტკიცე საფუვრის ჯიშებისთვის.
შეიძლება Pichia pastoris-ი ლიზირდეს მიკროტაქტის სონიკატორში?
კი. Pichia pastoris, რომელიც ასევე ცნობილია როგორც Komagataella phaffii, შეიძლება ლიზირდეს მაღალი ინტენსივობის მიკროტაქტის სონიკაციის გამოყენებით. რადგან P. pastoris ქმნის სიმკვრივით სქელ ბიომასას და აქვს მტკიცე უჯრედის კედელი, რეკომენდებულია ამპლიტუდის, პულსის ციკლის, გაგრილების და საერთო სონიკაციის დროის ოპტიმიზაცია.
რა არის ტიპიური სონიკაციის პარამეტრები საფუვრის ლიზისთვის?
სასარგებლო საწყისი დიაპაზონია 50–80% ამპლიტუდა, პულსური ოპერაცია, როგორიცაა 10–30 წამი ჩართული და 30–60 წამი გამორთული, და 5–15 წუთი კუმულატიური ჩართული დრო. ზუსტი პარამეტრები დამოკიდებულია საფუარის ჯერზე, უჯრედების სიმჭიდროვე, ნიმუშის მოცულობაზე, პლეიტის ტიპზე, ბუფერზე და მიზნობრივ მოლეკულაზე.
რატომ უნდა შესრულდეს საფუარის ლიზის პულსური რეჟიმით?
პულსური რეჟიმი ამცირებს სონიკაციის დროს სითბოს აკუმულაციას. ჩართული ეტაპის განმავლობაში ულტრაიისაფერი კავალაცია ანგრევს უჯრედებს. გამორთული ეტაპის დროს ნიმუში შეგიძლიათ გაგრილდეს. ეს მნიშვნელოვანია, რადგან ზედმეტი სითბო შეუძლია პროტეინების დენატურაცია, ნივთიერებათა აქტივობის შემცირება, RNA-ის degrade და გამრავლების შესაძლებლობის ზიანი მოვიდეს.
გათვალისწინებულია ენისპროცესული წინასწარი მკურნალობა საფუარის უჯრედების სონიკაციამდე?
ფერმენტული წინასწარი დამუშავება ყოველთვის არ არის საჭირო, მაგრამ მას შეუძლია გააუმჯობესოს ლიზისის ეფექტურობა. ფერმენტები, როგორიცაა Zymolyase ან Lyticase, ნაწილობრივ ითვისებენ საფუარის უჯრედის კედელს და შეუძლიათ შეამცირონ ულტრაბგერითი ინტენსივობა ან სრული ლიზისისთვის საჭირო დრო. ეს შეიძლება სასარგებლო იყოს მგრძნობიარე ცილებისთვის ან რთული შტამებისთვის.
როგორ შეიძლება თავიდან იქნას აცილებული გადახურება საფუარის გაჟონვის დროს?
გამოიყენეთ წინასწარ გაცივებული ბუფერები, პულსის რეჟიმი, გაგრილების პაუზები და გაცივებული ფირფიტის დაყენება. შეინახეთ მიკროფირფიტა დალუქული და აკონტროლეთ ტემპერატურა, სადაც ეს შესაძლებელია. მგრძნობიარე ცილებისთვის გამოიყენეთ უფრო მოკლე ON ინტერვალები, უფრო გრძელი გამორთვის ინტერვალები და დაამუშავეთ ნიმუშები ცივ პირობებში.
შეუძლია თუ არა მიკროფირფიტის გაჟონვას ჩაანაცვლოს მძივების ცემა საფუარის ლიზისისთვის?
ბევრ სამუშაო პროცესში, დიახ. მიკრობარტელობის სონიკაცია կարող არის შეცვალოს ბურთების ცეკვა, როცა საჭიროა სუფთა, გამეორებადი და პარალელური ლიზისი. ეს არ საჭიროებს ბურთების მოპყრობას, ამცირებს მოხმარების სირთულეს და აჩქარებს ავტომატიზაციას. თუმცა, თითოეული აპლიკაცია უნდა შეფასდეს ლიზის მოგების, პროტეინის მთლიანობის და ტესტის წარმადობის შედარებით.
მიკრობარტელობის სონიკაცია შესაფერისია საფურთხეველზე პროტეინის ასაღებად?
დიახ. მიკრობარტელობის სონიკაცია კარგად გამოგადგებათ საფურთხევის პროტეინის ასაღებად, განსაკუთრებით მაშინ, როცა უნდა შედარებულ იქნას მრავალი კლონი ან კულტურის პირობები. პროტეაზის ინჰიბიტორები, ცივი ბუფერები და კონტროლირებული პულსის პარამეტრები ეხმარება პროტეინის ხარისხის შემონარჩუნებაში.
შეიძლება იგივე მეთოდი გამოყენებულ იქნას DNA-ს, RNA-ს და პროტეინის მოსაპოვებლად?
შეგვიძლია იგივე ძირითადი სონიკაციის პრინციპის გამოყენება, მაგრამ ბუფერი და პროცესის პირობები უნდა იყოს ადაპტირებული მიზნობრივ მოლეკულაზე. ცილების სამუშაო პროცესები მოითხოვს პროტეაზის ინჰიბიციას და ტემპერატურის კონტროლს. RNA სამუშაო პროცესები მოითხოვს RNase-თავისუფალ გავლენას და ძლიერ გაგრილებას. DNA სამუშაო პროცესები შესაძლოა მოითხოვდნენ სხვადასხვა ლიზის და ატკევების პირობებს, დამოკიდებულია იმაზე, გსურთ თუ არა მთლიან გენომური DNA ან ფრაგმენტირებული DNA.
რომელი ტიპის თეფში უნდა იქნას გამოყენებული საფუარის ლიზისთვის?
გამოიყენეთ სონიკაციაზე თავსებადი მიკროთეფში ან ღრმა ჭრილებით თეფში შესაბამისი სეალებით. გრძელი-სარჭიანი თეფშები ხშირად სასარგებლოა წვენის მოსავლელად. თეფშმა უნდა გაუძლოს არჩეულ სონიკაციის პირობებს, ნიმუშის ტემპერატურას და ცენტრიფუგის ეტაპებს.
როგორ დავადგინოთ, ლიზა საფუარზე დასრულებულია თუ არა?
ლიზის ეფექტურობა შეიძლება გამოიკვლიოთ მიკროსკოპის, პროტეინის მოსავლიანობის, ფერმენტის აქტიურობის, სიბრძნის შემცირების, SDS-PAGE ანალიზის, DNA/RNA მოსავლიანობის ან ცნობილ ლიზის მეთოდთან შედარებით. მეთოდის განვითარებისათვის, შეაფასეთ ორივე – მიღებული მოლეკულის მოსავლიანობა და ხარისხი.
UIP400MTP ან UIP550MTP: რომელი მიკროფირფიტის სონიკატორი უნდა აირჩიოთ?
UIP400MTP არის ძლიერი მიკროფირფიტის სონიკატორი რუტინული მაღალი გამტარუნარიანობის ნიმუშის მომზადებისთვის, მათ შორის საფუარის ლიზისის, ცილის ექსტრაქციის, დნმ-ის გაპარსვა, ბიოფილმის გამოყოფა და ანალიზის მომზადება. ის შესაფერისია ლაბორატორიებისთვის, რომლებსაც სჭირდებათ განმეორებადი გაჟონვა სტანდარტული ფირფიტის ფორმატებში.
UIP550MTP უზრუნველყოფს უფრო მაღალ ულტრასონიკურ სიმძლავრეს და რეკომენდებულია, როდესაც უფრო მოთხოვნადი აპლიკაციები საჭიროებს ძლიერ აკუსტიკურ ინტენსივობას, მოკლე დამუშავების დროებს, უფრო დიდ ნიმუშების ტვირთს ან უფრო მდგრად განადგურების პირობებს. საფუარის ლიზისისთვის UIP550MTP განსაკუთრებით გამოსადეგია სიმკვრივის ბიომასისთვის, რთული შტამებისთვის, უფრო დიდი სამუშაო მოცულობებისთვის და მაღალი გამტარუნარიანობის ექსპრესიასთან დაკავშირებულ სკრინინგისთვის.
შეგვიძლია მიკროპლეიტის სონიკაციის საშუალებით საფუარის ლიზის ავტომატიზაცია?
დიახ. მიკროპატერებზე დაფუძნებული სონის მეთოდი კარგად შეესაბამება ავტომატიზებულ ლაბორატორიულ სამუშაო პროცესებს, რადგან ნიმუშები რჩებიან ფირფიტის ფორმატში. ეს ხელს უწყობს პიპეტირების სისტემებთან, ფირფიტის სახელმძღვანელო სამუშაოებთან, ცენტრიფუგირებასთან, ანალიზის მომზადებასთან და მაღალი გამტარუნარიანობის შესწავლასთან ინტეგრაციას.
ლიტერატურა / ლიტერატურა
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet UIP550MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics 2024.
