Nagy áteresztőképességű mintaelőkészítés mitokondriális diagnosztikához
A mitokondriális diagnosztikát a kutatásban és a klinikákban különböző technikákkal, például szekvenálással, PCR-rel és biokémiai vizsgálatokkal végzik. Ezeket a módszereket a DNS-mutációk azonosítására és a mitokondriális funkció mérésére használják. A szekvenálás segít a genetikai mutációk kimutatásában, míg a PCR számszerűsítheti a specifikus DNS-szekvenciákat. A biokémiai vizsgálatok a mitokondriális fehérjék és enzimek funkcionalitását értékelik.
A mitokondriális betegségek diagnosztikája különösen nehéz e betegségek kifejezett klinikai variabilitása, valamint két különböző öröklött genom: a mitokondriális DNS (mtDNS) és a nukleáris genom közötti összetett kölcsönhatás miatt.
DNS extrakció és fragmentáció szonikálással
Az izomszövetből történő DNS-kivonás különösen hasznos, ha szövetspecifikus változásokat gyanítanak az mtDNS-ben. Ezek a változások magukban foglalhatják az mtDNS delécióját krónikus progresszív külső ophthalmoplegiában (CPEO), az mtDNS pontmutációit mitokondriális myopathiákban vagy az mtDNS kimerülését Alpers-szindrómában. Az izomszövetből kivont DNS-t ezután különféle genetikai vizsgálatokhoz lehet használni, például Southern blot és hosszú távú PCR deléciókhoz, valós idejű PCR-hez a kimerüléshez vagy pontmutációk szekvenálásához.
Az ultrahangos kezelést intenzív ultrahanghullámok alkalmazásával alkalmazzák a mitokondriális diagnosztika számos alkalmazásában. A sejtek lizálására használják intracelluláris tartalmak, például mitokondriumok és DNS kivonására, DNS-ek, például mtDNS és nDNS nyírására szekvenálás céljából, valamint minták homogenizálására.
UIP400MTP lemezes szonikátor nagy áteresztőképességű mintaelőkészítéshez egyenletesen szonikálja a mintákat több lyukú és 96 lyukú lemezeken
Hogyan lehet izolálni a mitokondriumokat a sejtekből és szövetekből
A mitokondriális izolálás két alapvető lépésből áll: a sejtek megzavarása, hogy felszabadítsák tartalmukat, és differenciális centrifugálás alkalmazása a mitokondriális frakciók szétválasztására és visszanyerésére.
szonikáció
A Hielscher szonikátorok kompatibilisek a standard lízispufferekkel és készletekkel, így alkalmasak a mitokondriumok izolálására. A szonikáció két fő célt szolgál:
- Sejtlízis: Az ultrahangos hullámok megzavarják a sejtmembránokat, felszabadítva az intracelluláris tartalmat.
- Mitokondriális zavar: A szonikálás egy következő lépésben megszakíthatja a mitokondriumokat, hogy felszabadítsa a mitokondriális fehérjéket vagy a mitokondriális DNS-t.
- mtDNS fragmentáció: A szonikálás megbízható technika a mitokondriális DNS nyírására szekvenáláshoz.
A többlyukú lemezes szonikátor UIP400MTP lehetővé teszi a mitokondriális minták nagy áteresztőképességű mintaelőkészítését. A differenciális centrifugálással együtt az ultrahangos kezelés növeli a mitokondriális izoláció hatékonyságát, biztosítva az intakt mitokondriumok magas hozamát, amelyek alkalmasak különböző downstream alkalmazásokra.
Hielscher UIP400MTP többlyukú lemezes szonikátor Bármilyen szabványos lemezzel működik
A többlyukú lemezes szonikátor számos előnyt UIP400MTP kínál a nagy áteresztőképességű mintaelőkészítéshez, pl. mitokondriális diagnosztikában.
UIP400MTP Multiwell Plate Sonicator nagy áteresztőképességű mintaelőkészítéshez biomarker diagnosztikában.
Példaértékű utasítások az ultrahangos mtDNS fragmentációhoz
Előkészítés és extrahálás:
- A C57BL/6 egereket méhnyakficammal ölték meg.
- A májat gyorsan kivonták és jéghideg, steril PBS-ben mosták.
Mitokondriumok izolálása:
- A mitokondriumokat egy 2 ml-es Dounce szövetdarálóval és egy mitokondrium-izolációs készlettel izoláltuk a szövetekhez.
- Kezdeti centrifugálás 700× g-n és 3000× g-on.
- Végezzen két további mosási lépést a C pufferrel.
DNS-izolálás:
- Az első centrifugálásból származó pelletet 700× g-on nukleáris DNS (nDNS) izolálására használtuk.
- A DNS-t spinoszlopok segítségével izoláltuk.
- A mitokondriális DNS-t (mtDNS) izolált mitokondriumokból vonták ki.
- A nukleáris DNS-t (nDNS) nyers nukleáris kivonatokból vonták ki, mindkettőt egérmájszövetből.
DNS-fragmentáció:
- A DNS-t jégen töredezték egy 30 kHz / 50-W ultrahangos szonikátorral UP50H, 0,5 mm-es mikro-csúcs sonotrode 14 μm-en 2 × 30 másodpercig.
Fragmentáció vizualizációja és számszerűsítése:
- Az ultrahangosítás utáni töredezettséget 1% -os agarózgélen vizualizáltuk SYBR biztonságos DNS-festékkel.
- Az mtDNS és az nDNS relatív abundanciáját qPCR segítségével határoztuk meg.
(vö. Mariero et al., 2019)
A nagy áteresztőképességű mintaelőkészítéshez a többlyukú lemezes szonikátor UIP400MTP megkönnyíti a nagy mintaszámok előkészítését standard 96 lyukú, több lyukú és mikrotiter lemezekben.
Tudjon meg többet a nagy áteresztőképességű minta-előkészítés előnyeiről a UIP400MTP használatával!
Tippek az optimális mitokondriumok izolálásához szonikálással:
- Hőmérséklet-szabályozás: Minden lépést 0 °C és 4 °C közötti hőmérséklet-tartományban kell végrehajtani. Ez kritikus fontosságú a mitokondriumok integritásának és funkcionalitásának fenntartásához.
- Hatékonyság és sebesség: Dolgozzon gyorsan, és csak az adott alkalmazáshoz szükséges mértékben tisztítsa meg a mitokondriumokat. A túlzott manipuláció a mitokondriális tartalom jelentős csökkenéséhez vezethet.
- A szuszpenziók hígítása: Tartsa fenn a sejt- és sejtszervi szuszpenziók alacsony koncentrációját az izolálási folyamat során. Ez segít minimalizálni a csapdázás és az agglutináció kockázatát, ezáltal javítva az izolált mitokondriumok tisztaságát.
- Minta térfogata: Válasszon több kis léptékű készítményt, nem pedig egyetlen nagyot. Ez a megközelítés általában jobb hozamot eredményez, mivel a skálázás nem növeli arányosan a visszanyerhető mitokondriumok mennyiségét. A többlyukú lemezes szonikátor UIP400MTP megkönnyíti a sejtek gyors és megbízható lízisét a mitokondriumok izolálásához, valamint a fehérje kivonását a mitokondriumokból.
Ezek az iránymutatások hatékonyabbá teszik az ultrahangos lízissel és centrifugálással történő izolálási folyamatot, kiváló minőségű mitokondriális készítményeket eredményezve, amelyek alkalmasak a későbbi alkalmazásokra.
Hielscher szonikátorok – Németországban gyártott minőség
A Hielscher ultrahangos készülékek jól ismertek a legmagasabb minőségi és tervezési szabványokról. A robusztusság és a könnyű kezelhetőség lehetővé teszi ultrahangos készülékeink zökkenőmentes integrálását ipari létesítményekbe. A durva körülmények és az igényes környezetek könnyen kezelhetők Hielscher ultrasonicators.
Hielscher Ultrasonics egy ISO tanúsítvánnyal rendelkező cég, és különös hangsúlyt fektet a nagy teljesítményű ultrasonicatorokra, amelyek a legmodernebb technológiát és felhasználóbarátságot mutatják. Természetesen a Hielscher ultrasonicators CE-kompatibilis és megfelel az UL, CSA és RoHs követelményeinek.
96-lyukú lemezes szonikátor UIP400MTP mikrotiter és multiwell lemezek ultrahangos kezelésére
Irodalom / Hivatkozások
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- UIP400MTP-Multi-well-Plate-Sonicator-Infographic
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
Gyakran ismételt kérdések a mitokondriumokról és a mitokondriális diagnosztikáról
Mik azok a mitokondriumok?
A mitokondriumok membránhoz kötött organellák, amelyek a legtöbb eukarióta szervezet sejtjeiben találhatók. A sejt erőműveiként ismertek, mert energiát termelnek adenozin-trifoszfát (ATP) formájában a celluláris légzés folyamatán keresztül. Ezenkívül a mitokondriumok saját DNS-sel rendelkeznek, és kulcsszerepet játszanak más sejtfolyamatokban, beleértve a sejtciklus szabályozását és a sejthalált.
Mi különbözteti meg az mtDNS-t a genomi DNS-től?
A mitokondriális DNS (mtDNS) számos kulcsfontosságú módon különbözik a genomi DNS-től (gDNS). Az MtDNS a mitokondriumokban található, körkörös és anyai úton öröklődik, míg a gDNS a sejtmagban található, lineáris, és mindkét szülőtől öröklődik. Az MtDNS sokkal kisebb, csak 37 gént kódol, míg a gDNS körülbelül 20 000-25 000 gént tartalmaz. Az MtDNS sejtenként több kópiában van jelen, magasabb mutációs rátával rendelkezik, és elsősorban a mitokondriális funkcióban részt vevő fehérjéket kódolja. Ezzel szemben a gDNS tipikusan diploid, alacsonyabb mutációs rátával rendelkezik, és a szervezet fejlődéséhez és működéséhez szükséges gének széles skáláját kódolja. Ezenkívül az mtDNS transzkripció és transzláció a mitokondriumokban történik, míg a gDNS transzkripció a magban, a transzláció pedig a citoplazmában történik. Ezek a különbségek tükrözik eltérő szerepüket és evolúciós eredetüket.
Mi az a sejtmentes kivonat?
A sejtmentes kivonat olyan oldat, amely tartalmazza a lizált sejtek tartalmát, beleértve a fehérjéket, nukleinsavakat és más sejtkomponenseket, de ép sejtmembránok nélkül. Ezt a kivonatot biokémiai és molekuláris biológiai kutatásokban használják a sejtfolyamatok in vitro tanulmányozására, lehetővé téve a kutatók számára, hogy elemezzék az élő sejteken kívüli reakciókat és mechanizmusokat.
Milyen szerepet játszanak a PCR-tesztek a mitokondriális diagnosztikában?
A PCR-tesztek kritikus szerepet játszanak a mitokondriális diagnosztikában azáltal, hogy lehetővé teszik a mitokondriális DNS (mtDNS) mutációinak, delécióinak vagy kópiaszám-változásainak kimutatását. Lehetővé teszik specifikus mtDNS-régiók amplifikációját a mitokondriális rendellenességekkel kapcsolatos patogén variánsok azonosítására. A PCR-alapú technikákat, például a kvantitatív PCR-t (qPCR) és a nagy hatótávolságú PCR-t az mtDNS integritásának, a heteroplazmiaszinteknek és az mtDNS kimerülésének felmérésére is használják, alapvető betekintést nyújtva a mitokondriális működésbe és a betegségbe.
Ismerje meg, hogyan könnyíti meg a UIP400MTP Microplate Sonicator a PCR teszteket és vizsgálatokat!
Mi a differenciális centrifugálás?
A differenciális centrifugálás széles körben alkalmazott technika a sejtek frakcionálására és mitokondriális izolálására. Ez a módszer elválasztja a sejtszerkezeteket üledékképződési együtthatójuk alapján, amely mind a sűrűségtől, mind az alaktól függ. Az eljárás során különböző szintű centrifugális erőt alkalmaznak a meghatározott sűrűségű pufferolt sóoldatokban lévő mintákra. A hasonló ülepítési együtthatóval rendelkező szerkezetek egyidejűleg leülepednek a gyűjtőcső alján, lehetővé téve azok visszanyerését.
Hogyan használják a differenciális centrifugálást a mitokondriumok izolálására?
A differenciális centrifugálás lehetővé teszi a kutatók számára, hogy hatékonyan elválasszák a mitokondriális frakciókat más sejtkomponensektől. A mitokondriumok izolálása több centrifugálási lépést és az izolátum későbbi visszanyerését foglalja magában.
Kezdeti centrifugálás: Alkalmazzon alacsony centrifugális erőt a nagy cellás törmelék és magok üledékére.
További centrifugálások: Fokozatosan növeljük a centrifugális erőt a mitokondriumokkal dúsított pelletfrakciókhoz. Minden centrifugálási lépés eltávolítja a fokozatosan magasabb ülepítési együtthatóval rendelkező szerkezeteket.
Frakció helyreállítása: Minden centrifugálás után összegyűjtik a pelletet, és a felülúszót nagyobb g-erőknek vetik alá a következő frakció elkülönítése érdekében. Ezt addig ismételjük, amíg a mitokondriumok kívánt tisztaságát el nem érik.