Nagy áteresztőképességű minta-előkészítés mitokondriális diagnosztikához
A kutatásban és a klinikai gyakorlatban a mitokondriális diagnosztikát különféle technikákkal végzik, például szekvenálással, PCR-rel és biokémiai vizsgálatokkal. Ezeket a módszereket a DNS-mutációk azonosítására és a mitokondriális működés mérésére használják. A szekvenálás segít a genetikai mutációk kimutatásában, míg a PCR-rel meghatározott DNS-szekvenciák mennyisége határozható meg. A biokémiai vizsgálatok a mitokondriális fehérjék és enzimek működőképességét értékelik.
A mitokondriális betegségek diagnosztizálása különösen nehéz e betegségek kifejezett klinikai változatossága, valamint két eltérően öröklődő genom, a mitokondriális DNS (mtDNA) és a sejtmagi genom közötti összetett kölcsönhatás miatt.
DNS-kivonás és -fragmentálás ultrahangos kezeléssel
Az izomszövetből történő DNS-kivonás különösen hasznos, ha az mtDNA szövetspecifikus változásai gyaníthatók. E változások közé tartozhatnak az mtDNA deléciói krónikus progresszív külső oftalmoplégiában (CPEO), az mtDNA pontmutációi mitokondriális miopátiákban, illetve az mtDNA mennyiségének csökkenése Alpers-szindrómában. Az izomszövetből kivont DNS ezután különféle genetikai vizsgálatokhoz használható, például Southern-blothoz és hosszú szakaszokat amplifikáló PCR-hez a deléciók vizsgálatára, valós idejű PCR-hez a mennyiségcsökkenés vizsgálatára, illetve szekvenáláshoz a pontmutációk vizsgálatára.
Az intenzív ultrahanghullámokat alkalmazó ultrahangos kezelést a mitokondriális diagnosztikában többféle célra használják. Alkalmazzák a sejtek lízisére az intracelluláris tartalom, például a mitokondriumok és a DNS kinyeréséhez, a DNS, például az mtDNA és az nDNA nyírással történő fragmentálására szekvenáláshoz, valamint a minták homogenizálására.
UIP400MTP lemezes ultrahangos kezelőberendezés nagy áteresztőképességű minta-előkészítéshez egyenletesen kezeli ultrahanggal a mintákat többlyukú és 96 lyukú lemezekben
Hogyan izolálhatók mitokondriumok sejtekből és szövetekből?
A mitokondriumok izolálása két alapvető lépésből áll: a sejtek feltárásából tartalmuk felszabadításához, valamint differenciális centrifugálás alkalmazásából a mitokondriális frakciók elkülönítéséhez és kinyeréséhez.
Ultrahangos kezelés
A Hielscher ultrahangos kezelőberendezések kompatibilisek a szokásos lízispufferekkel és készletekkel, így alkalmasak a mitokondriumok izolálására. Az ultrahangos kezelés két fő célt szolgál:
- Sejtlízis: Az ultrahanghullámok megbontják a sejtmembránokat, felszabadítva az intracelluláris tartalmat.
- Mitokondriumok feltárása: Az ultrahangos kezelés egy későbbi lépésben feltárhatja a mitokondriumokat, felszabadítva a mitokondriális fehérjéket vagy a mitokondriális DNS-t.
- Az mtDNA fragmentálása: Az ultrahangos kezelés megbízható technika a mitokondriális DNS nyírással történő fragmentálására szekvenáláshoz.
Az UIP400MTP többlyukú lemezes ultrahangos kezelőberendezés lehetővé teszi a mitokondriális minták nagy áteresztőképességű előkészítését. Differenciális centrifugálással együtt alkalmazva az ultrahangos kezelés növeli a mitokondriumok izolálásának hatékonyságát, és nagy hozamban biztosít ép mitokondriumokat, amelyek különféle további alkalmazásokhoz használhatók.
Hielscher UIP400MTP többlyukú lemezes ultrahangos kezelőberendezés bármilyen szabványos lemezzel használható
Az UIP400MTP többlyukú lemezes ultrahangos kezelőberendezés számos előnyt kínál a nagy áteresztőképességű minta-előkészítéshez, például a mitokondriális diagnosztikában.
UIP400MTP többlyukú lemezes ultrahangos kezelőberendezés nagy áteresztőképességű minta-előkészítéshez a biomarker-diagnosztikában.
Példa az mtDNA ultrahangos fragmentálásának menetére
Előkészítés és kivonás:
- A C57BL/6 egereket a nyakcsigolyák diszlokációjával ölték le.
- A májakat gyorsan eltávolították, és jéghideg, steril PBS-ben mosták.
Mitokondriumok izolálása:
- A mitokondriumokat 2-mL térfogatú Dounce szövethomogenizátor és szövetekhez való mitokondriumizoláló készlet segítségével izolálták.
- Kezdeti centrifugálás 700× g és 3 000× g mellett.
- Végezzen két további mosási lépést C pufferrel.
DNS izolálása:
- Az első, 700× g mellett végzett centrifugálásból származó üledéket a sejtmagi DNS (nDNA) izolálására használták.
- A DNS-t centrifugálható oszlopokkal izolálták.
- A mitokondriális DNS-t (mtDNA) izolált mitokondriumokból vonták ki.
- A sejtmagi DNS-t (nDNA) nyers sejtmagi kivonatokból vonták ki; mindkét DNS egérmájszövetből származott.
DNS fragmentálása:
- A DNS-t jégen fragmentálták egy 30-kHz/50-W paraméterű UP50H ultrahangos kezelőberendezéssel, 0,5-mm méretű mikrohegyű szonotróda használatával, 14 μm mellett, 2 × 30 másodpercig.
A fragmentálás vizualizálása és mennyiségi meghatározása:
- Az ultrahangos kezelés utáni fragmentálást 1% agarózgélen, SYBR safe DNS-festékkel tették láthatóvá.
- Az mtDNA és az nDNA relatív mennyiségét qPCR-rel határozták meg.
(cf. Mariero et al., 2019)
A nagy áteresztőképességű minta-előkészítéshez az UIP400MTP többlyukú lemezes ultrahangos kezelőberendezés megkönnyíti nagyszámú minta előkészítését szabványos 96 lyukú, többlyukú és mikrotiterlemezekben.
Olvasson többet az UIP400MTP berendezéssel végzett nagy áteresztőképességű minta-előkészítés előnyeiről!
Tippek a mitokondriumok optimális izolálásához ultrahangos kezeléssel:
- Hőmérséklet-szabályozás: Minden lépést a 0°C és 4°C közötti hőmérséklet-tartományban végezzen. Ez kulcsfontosságú a mitokondriumok épségének és működőképességének megőrzéséhez.
- Hatékonyság és gyorsaság: Dolgozzon gyorsan, és a mitokondriumokat csak az adott alkalmazáshoz szükséges mértékben tisztítsa. A túlzott kezelés a mitokondriális tartalom jelentős veszteségéhez vezethet.
- Szuszpenziók hígítása: Az izolálási folyamat során végig tartsa alacsonyan a sejt- és sejtorganellum-szuszpenziók koncentrációját. Ez segít minimalizálni a csapdába esés és az agglutináció kockázatát, ezáltal javítva az izolált mitokondriumok tisztaságát.
- Mintatérfogat: Egyetlen nagy léptékű előkészítés helyett válasszon több kis léptékű előkészítést. Ez a megközelítés általában jobb hozamot eredményez, mivel a léptéknövelés nem növeli arányosan a kinyerhető mitokondriumok mennyiségét. Az UIP400MTP többlyukú lemezes ultrahangos kezelőberendezés megkönnyíti a sejtek gyors és megbízható lízisét a mitokondriumok izolálásához, valamint a fehérjék kinyerését a mitokondriumokból.
Ezek az útmutatások hatékonyabbá teszik az ultrahangos lízist és centrifugálást alkalmazó izolálási folyamatot, így kiváló minőségű, további alkalmazásokhoz használható mitokondriális preparátumok nyerhetők.
Hielscher ultrahangos kezelőberendezések – Németországban készült minőség
A Hielscher ultrahangos kezelőberendezések a legmagasabb minőségi és tervezési követelmények teljesítéséről ismertek. A robusztus felépítés és az egyszerű kezelés lehetővé teszi ultrahangos kezelőberendezéseink zökkenőmentes integrálását az ipari létesítményekbe. A Hielscher ultrahangos kezelőberendezések könnyedén megbirkóznak a zord körülményekkel és a nagy igénybevételt jelentő környezetekkel.
A Hielscher Ultrasonics ISO-tanúsítvánnyal rendelkező vállalat, amely különös hangsúlyt fektet a nagy teljesítményű, korszerű technológiát és felhasználóbarát kezelést kínáló ultrahangos kezelőberendezésekre. A Hielscher ultrahangos kezelőberendezések természetesen megfelelnek a CE-előírásoknak, valamint az UL, CSA és RoHs követelményeinek.
UIP400MTP 96 lyukú lemezes ultrahangos kezelőberendezés mikrotiterlemezek és többlyukú lemezek ultrahangos kezeléséhez
Szakirodalom / Hivatkozások
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- UIP400MTP-Multi-well-Plate-Sonicator-Infographic
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
Gyakran ismételt kérdések a mitokondriumokról és a mitokondriális diagnosztikáról
Mik a mitokondriumok?
A mitokondriumok membránnal határolt sejtorganellumok, amelyek a legtöbb eukarióta szervezet sejtjeiben megtalálhatók. A sejtek erőműveiként ismertek, mert a sejtlégzés folyamata révén adenozin-trifoszfát (ATP) formájában termelnek energiát. Emellett a mitokondriumok saját DNS-sel rendelkeznek, és kulcsszerepet játszanak más sejtszintű folyamatokban is, többek között a sejtciklus és a sejthalál szabályozásában.
Miben különbözik az mtDNA a genomi DNS-től?
A mitokondriális DNS (mtDNA) több lényeges szempontból különbözik a genomi DNS-től (gDNA). Az mtDNA a mitokondriumokban található, kör alakú és anyai ágon öröklődik, míg a gDNA a sejtmagban található, lineáris és mindkét szülőtől öröklődik. Az mtDNA sokkal kisebb, mindössze 37 gént kódol, míg a gDNA körülbelül 20 000–25 000 gént tartalmaz. Az mtDNA sejtenként több példányban van jelen, mutációs rátája magasabb, és elsősorban a mitokondriális működésben részt vevő fehérjéket kódolja. Ezzel szemben a gDNA általában diploid, mutációs rátája alacsonyabb, és a szervezet fejlődéséhez és működéséhez szükséges gének széles körét kódolja. Emellett az mtDNA transzkripciója és transzlációja a mitokondriumokon belül zajlik, míg a gDNA transzkripciója a sejtmagban, transzlációja pedig a citoplazmában történik. Ezek a különbségek eltérő szerepüket és evolúciós eredetüket tükrözik.
Mi a sejtmentes kivonat?
A sejtmentes kivonat olyan oldat, amely a lizált sejtek tartalmát, többek között fehérjéket, nukleinsavakat és más sejtalkotókat tartalmaz, ép sejtmembránok nélkül. Ezt a kivonatot biokémiai és molekuláris biológiai kutatásokban használják a sejtszintű folyamatok in vitro vizsgálatára, lehetővé téve a kutatók számára a reakciók és mechanizmusok elemzését az élő sejteken kívül.
Milyen szerepet játszanak a PCR-vizsgálatok a mitokondriális diagnosztikában?
A PCR-vizsgálatok kulcsfontosságú szerepet játszanak a mitokondriális diagnosztikában, mivel lehetővé teszik a mitokondriális DNS (mtDNA) mutációinak, delécióinak és kópiaszám-változásainak kimutatását. Lehetővé teszik meghatározott mtDNA-régiók amplifikálását a mitokondriális rendellenességekkel összefüggő patogén variánsok azonosításához. A PCR-alapú technikákat, például a kvantitatív PCR-t (qPCR) és a hosszú szakaszokat amplifikáló PCR-t az mtDNA épségének, a heteroplazmia szintjének és az mtDNA mennyiségcsökkenésének értékelésére is használják, alapvető információkat szolgáltatva a mitokondriális működésről és betegségekről.
Tudja meg, hogyan könnyíti meg az UIP400MTP mikrolemezes ultrahangos kezelőberendezés a PCR-teszteket és -vizsgálatokat!
Mi a differenciális centrifugálás?
A differenciális centrifugálás széles körben alkalmazott technika a sejtek frakcionálására és a mitokondriumok izolálására. Ez a módszer a sejtszerkezeteket szedimentációs együtthatójuk alapján választja el, amely a sűrűségtől és az alaktól egyaránt függ. A folyamat során különböző nagyságú centrifugális erőt alkalmaznak a meghatározott sűrűségű, pufferelt sóoldatokban lévő mintákra. A hasonló szedimentációs együtthatójú struktúrák egy időben ülepednek le a gyűjtőcső aljára, lehetővé téve kinyerésüket.
Hogyan használják a differenciális centrifugálást a mitokondriumok izolálására?
A differenciális centrifugálás lehetővé teszi a kutatók számára a mitokondriális frakciók hatékony elkülönítését más sejtalkotóktól. A mitokondriumok izolálása több centrifugálási lépést és az izolátum ezt követő kinyerését foglalja magában.
Kezdeti centrifugálás: Alkalmazzon kis centrifugális erőt a nagy sejttörmelékek és sejtmagok ülepítésére.
További centrifugálások: Növelje lépésenként a centrifugális erőt, hogy a mitokondriumokban dúsított frakciók üledéket képezzenek. Minden centrifugálási lépés fokozatosan magasabb szedimentációs együtthatójú struktúrákat távolít el.
Frakciók kinyerése: Minden centrifugálás után összegyűjtik az üledéket, a felülúszót pedig nagyobb g-erőknek teszik ki a következő frakció izolálásához. Ezt addig ismétlik, amíg el nem érik a mitokondriumok kívánt tisztaságát.