अल्फा-सिंक्यूक्लिन विखंडन VialTweeter Sonicator का उपयोग कर
α-सिंक्यूक्लिन फाइब्रिल और रिबन को छोटे फाइब्रिल स्निपेट या यहां तक कि व्यक्तिगत प्रोटीन अणुओं को उत्पन्न करने के लिए वैज्ञानिक अनुसंधान में खंडित किया जाता है, जिसे विभिन्न प्रयोगात्मक तकनीकों का उपयोग करके अधिक आसानी से विश्लेषण किया जा सकता है। वायलट्वीटर सोनिकेटर कुशल और विश्वसनीय अल्फा-सिंक्यूक्लिन विखंडन के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किए जाने वाले अल्ट्रासोनिकेटर में से एक है।
अनुसंधान में α-सिंक्यूक्लिन
अल्फा-सिंक्यूक्लिन फाइब्रिल प्रोटीन समुच्चय हैं जो पार्किंसंस रोग और मनोभ्रंश के कुछ रूपों जैसे न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों से दृढ़ता से जुड़े होते हैं, जिसमें लेवी निकायों के साथ मनोभ्रंश भी शामिल है। अल्फा-सिंक्यूक्लिन फाइब्रिल पर केंद्रित अनुसंधान का उद्देश्य रोग की प्रगति में उनकी भूमिका को समझना और संभावित चिकित्सीय हस्तक्षेप विकसित करना है। अल्फा-सिंक्यूक्लिन फाइब्रिल को छोटे टुकड़ों में तोड़कर, शोधकर्ता उनकी विशिष्ट संरचनात्मक विशेषताओं की जांच कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, अल्फा-सिंक्यूक्लिन फाइब्रिल को खंडित करने से शोधकर्ताओं को प्रोटीन, लिपिड या छोटे अणुओं जैसे अन्य अणुओं के साथ उनकी बातचीत की जांच करने में सक्षम बनाता है। छोटे टुकड़ों का उत्पादन करके, इन अंतःक्रियात्मक भागीदारों के लिए बाध्यकारी साइटों और आत्मीयता की अधिक प्रभावी ढंग से जांच की जा सकती है। छोटे α-सिन फ्रिब्रिल्स और रिबन भी परिवर्तित विषाक्तता और जैव रासायनिक प्रभाव दिखा सकते हैं। इसलिए, एक विश्वसनीय और कुशल विखंडन तकनीक, जो एक त्वरित और सरल नमूना उपचार में प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम उत्पन्न करती है, महत्वपूर्ण है।
अल्ट्रासोनिक अल्फा-सिन विखंडन: वायलट्वीटर सोनिकेटर स्थापित अल्ट्रासोनिक नमूना प्रस्तुत करने की प्रणाली है जो बिल्कुल समान परिस्थितियों में एक साथ 10 शीशियों तक सोनीकेट करती है। प्रोग्राम करने योग्य सेटिंग्स एक ही प्रयोगों के सरल और त्वरित पुन: चलाने की अनुमति देती हैं, जो अल्फा-सिंक्यूक्लिन फाइब्रिल विखंडन में अत्यधिक विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम देती हैं।
VialTweeter sonicator कई अल्फा-सिंक्यूक्लिन नमूनों के एक साथ अल्ट्रासोनिक विखंडन के लिए।
α-Synuclein एक Sonicator के साथ नमूना तैयार
अल्फा-सिंक्यूक्लिन फाइब्रिल का अध्ययन करने के लिए एक दृष्टिकोण में सोनिकेशन जैसी तकनीकों का उपयोग करके उनके निष्कर्षण और विखंडन शामिल हैं। सोनिकेशन एक ऐसी प्रक्रिया है जो प्रोटीन समुच्चय को बाधित करने और तोड़ने के लिए उच्च-तीव्रता, कम आवृत्ति वाली अल्ट्रासाउंड तरंगों का उपयोग करती है, जिससे छोटे फाइब्रिल या व्यक्तिगत प्रोटीन अणुओं की रिहाई होती है। सोनिकेटर वायलट्वीटर इस उद्देश्य के लिए α-सिंक्यूक्लिन-संबंधित शोध अध्ययनों में आमतौर पर इस्तेमाल किया जाने वाला उपकरण है।
कई शोध अध्ययनों में अल्फा-सिंक्यूक्लिन फाइब्रिल सोनिकेशन के सटीक नमूना तैयारी प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है, जो कुशल और विश्वसनीय α-सिंक्यूक्लिन फाइब्रिल विखंडन के लिए हिल्स्चर वायलट्वीटर का उपयोग करते हैं। अल्ट्रासोनिक रूप से फाइब्रिल को खंडित करके, शोधकर्ता परिणामी उत्पादों का विश्लेषण कर सकते हैं और उनकी संरचना, विषाक्तता और अन्य अणुओं के साथ बातचीत की जांच कर सकते हैं। यह शोध न्यूरोडीजेनेरेशन अंतर्निहित तंत्र में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान करता है और संभावित रूप से नए चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान करता है। VialTweeter sonicator का उपयोग करके अच्छी तरह से स्थापित α-synuclein sonication प्रोटोकॉल विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणामों की अनुमति देते हैं।
ऊपरी चित्र: अखंडित अल्फा-सिंक्यूक्लिन फाइब्रिल
निचली छवियां: वायलट्वीटर सोनिकेटर के साथ अल्ट्रासोनिक रूप से खंडित अल्फा-सिंक्यूक्लिन फाइब्रिल
(अध्ययन और चित्र: ©डायरिक्स एट अल., 2022)
α-Synuclein Fibrils का अल्ट्रासोनिक विखंडन – प्रोटोकॉल
चूंकि कई शोधकर्ता एक समान α-सिंक्यूक्लिन फाइब्रिल टुकड़े का उत्पादन करने के लिए पसंदीदा विखंडन तकनीक के रूप में वायलट्वीटर सोनिकेटर का उपयोग करते हैं, इसलिए स्थापित प्रोटोकॉल आसानी से उपलब्ध हैं। नीचे आप कुछ अनुकरणीय विखंडन प्रोटोकॉल पा सकते हैं।
ClearTau बीज की तैयारी: ClearTau फाइब्रिल को dH2O में 10 माइक्रोन तक पतला किया गया था और VialTweeter के साथ sonicator UP200St का उपयोग करके 1 s ON 1 s ऑफ साइकिल इन-ट्यूब के साथ 50 s के लिए 70% आयाम पर sonicated किया गया था। बीजों को इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा विशेषता दी गई थी।
ThS प्रतिदीप्ति माप: ClearTau फाइब्रिल को dH2O में 2.5 माइक्रोन तक पतला किया गया था और VialTweeter के साथ UP200St का उपयोग करके 1 s ON 1 s ऑफ साइकिल इन-ट्यूब के साथ 50 s के लिए 70% आयाम पर sonicated किया गया था। 2.5 माइक्रोन पूर्ण लंबाई ताऊ 4 आर 2 एन मोनोमर एक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था। 100 μl प्रतिक्रिया के लिए, ThS (10 माइक्रोन) के 100 μl जोड़े गए, जो 1.25 माइक्रोन की अंतिम प्रोटीन सांद्रता प्रदान करते हैं। एकल-समय बिंदु ThS प्रतिदीप्ति को 445 एनएम पर उत्तेजना के साथ FLUOstar ओमेगा माइक्रोप्लेट रीडर में स्थापित 96 अच्छी तरह से स्पष्ट नीचे प्लेटों का उपयोग करके मापा गया था और 485 एनएम पर उत्सर्जन दर्ज किया गया था।
(सीएफ. लिमोरेंको एट अल., 2023)
सोनिकेशन का उपयोग करके यूनिफ़ॉर्म α-सिंक्यूक्लिन लंबाई: α-सिन फाइब्रिल और रिबन की लंबाई विषमता 75% आयाम, 0.5 एस दालों पर सेट एक वायलट्वीटर में 2-मिलीलीटर एप्पेंडोर्फ ट्यूबों में बर्फ पर 20 मिनट के लिए सोनिकेशन द्वारा कम की गई थी।
(सीएफ बूसेट एट अल।
मानव पुनः संयोजक मोनोमेरिक WT या S129A a-Syn और उनके द्वारा उत्पन्न फाइब्रिलर बहुरूपियों के साथ-साथ a-Syn 1-110 का गुणवत्ता नियंत्रण किया गया था। इसके बाद, फाइब्रिलर बहुरूपियों को वायलट्वीटर अल्ट्रासोनिकेटर में 2-एमएल एपेंडोर्फ ट्यूबों में 20 मिनट के लिए सोनिकेशन द्वारा खंडित किया गया था ताकि 42-52 एनएम के औसत आकार के साथ फाइब्रिलर कण उत्पन्न हो सकें जो एंडोसाइटोसिस के लिए उपयुक्त हैं।
(सीएफ. श्रीवास्तव एवं अन्य., 2020)
"पांच फाइब्रिलर α-सिन बहुरूपियों की विशेषता"। (ए) नकारात्मक रूप से सना हुआ α-सिन फाइब्रिलर पॉलीमॉर्फ फाइब्रिल, रिबन, फाइब्रिल -91, फाइब्रिल -65, और फाइब्रिल -110 से पहले (ऊपरी लेन) और वायलट्वीटर (निचली लेन) के साथ विखंडन के बाद ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ दिखाए जाते हैं। (बी) खंडित फाइब्रिलर बहुरूपियों का लंबाई वितरण दिखाया गया है। हिस्टोग्राम से प्राप्त फाइब्रिलर असेंबली की संख्या (एन) इंगित की गई है।
(अध्ययन और चित्र: श्रीवास्तव एवं अन्य, 2020)
α-सिन फाइब्रिल को एक वायलट्वीटर में 2 मिलीलीटर एपेंडोर्फ ट्यूबों में 20 मिनट के लिए सोनिकेशन द्वारा खंडित किया गया था ताकि औसत आकार 42-52 एनएम के साथ फाइब्रिलर कणों को उत्पन्न किया जा सके जैसा कि टीईएम विश्लेषण द्वारा मूल्यांकन किया गया था।
(सीएफ. नेग्रीनी एट अल., 2022)
पुन: निलंबित फाइब्रिल्स91 (पीबीएस में) को शीशी ट्वीटर सोनिकेटर का उपयोग करके 2 एमएल एपेंडॉर्फ ट्यूबों में 20 मिन के लिए सोनिकेशन द्वारा सेल संस्कृतियों के अलावा से पहले खंडित किया गया था, एलिकोटेड, तरल नाइट्रोजन में जमे हुए फ्लैश और -80 डिग्री सेल्सियस पर उपयोग तक संग्रहीत किया गया था।
(सीएफ. वझोज एट अल., 2021)
मल्टी-वेल प्लेटों में अल्फा-सिंक्यूक्लिन फाइब्रिल विखंडन के लिए सोनिकेटर UIP400MTP।
VialTweeter और α-Syn विखंडन के लिए लैब Sonicators
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Hielscher Ultrasonics एक आईएसओ प्रमाणित कंपनी है और अत्याधुनिक प्रौद्योगिकी और उपयोगकर्ता-मित्रता की विशेषता वाले उच्च प्रदर्शन अल्ट्रासोनिकेटर पर विशेष जोर देती है। बेशक, Hielscher sonicators CE अनुरूप हैं और उल, सीएसए और RoHs की आवश्यकताओं को पूरा करते हैं।
नीचे दी गई तालिका आपको हमारे प्रयोगशाला आकार के अल्ट्रासोनिकेटर की अनुमानित प्रसंस्करण क्षमता का संकेत देती है:
| अनुशंसित उपकरण | बैच वॉल्यूम | प्रवाह दर |
|---|---|---|
| UIP400MTP | मल्टी-वेल / माइक्रोटिटर प्लेट्स | एन.ए. |
| अल्ट्रासोनिक CupHorn | शीशियों या बीकर के लिए CupHorn | एन.ए. |
| जीडीमिनी2 | अल्ट्रासोनिक माइक्रो-फ्लो रिएक्टर | एन.ए. |
| वायलट्वीटर | 0.5 से 1.5mL | एन.ए. |
| यूपी100एच | 1 से 500mL | 10 से 200mL/मिनट |
| यूपी200एचटी, UP400St | 10 से 2000mL | 20 से 400mL/मिनट |
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वायलट्वीटर आमतौर पर पूर्व-विश्लेषणात्मक नमूना तैयार करने के चरण के रूप में अल्फा-सिंक्यूक्लिन फाइब्रिल को टुकड़ा करने के लिए उपयोग किया जाता है
साहित्य/सन्दर्भ
- Emil Dandanell Agerschou, Marie P. Schützmann, Nikolas Reppert, Michael M. Wördehoff, Hamed Shaykhalishahi, Alexander K. Buell, Wolfgang Hoyer (2021): β-Turn exchanges in the α-synuclein segment 44-TKEG-47 reveal high sequence fidelity requirements of amyloid fibril elongation. Biophysical Chemistry, Volume 269, 2021.
- Bousset, L., Pieri, L., Ruiz-Arlandis, G. et al. (2013): Structural and functional characterization of two alpha-synuclein strains. Nature Communications 4, 2575 (2013).
- Vajhøj, Charlott; Schmid, Benjamin; Alik, Ania; Melki, Ronald; Fog, Karina; Holst, Bjørn; Stummann, Tina (2021): Establishment of a human induced pluripotent stem cell neuronal model for identification of modulators of A53T α-synuclein levels and aggregation. PLOS ONE 16, 2021.
- Dieriks B.V.; Highet B.; Alik A.; Bellande T.; Stevenson T.J.; Low V.; Park T.I.; Correia J.; Schweder P.; Faull R.L.M.; Melki R.; Curtis M.A.; Dragunow M. (2022): Human pericytes degrade diverse α-synuclein aggregates. PLoS One, Nov 18;17(11), 2022.
- Amulya Nidhi Shrivastava, Luc Bousset, Marianne Renner, Virginie Redeker, Jimmy Savistchenko, Antoine Triller, Ronald Melki (2020): Differential Membrane Binding and Seeding of Distinct α-Synuclein Fibrillar Polymorphs. Biophysical Journal, Volume 118, Issue 6, 2020. 1301-1320.
- Negrini M, Tomasello G, Davidsson M, Fenyi A, Adant C, Hauser S, Espa E, Gubinelli F, Manfredsson FP, Melki R, Heuer A. (2022): Sequential or Simultaneous Injection of Preformed Fibrils and AAV Overexpression of Alpha-Synuclein Are Equipotent in Producing Relevant Pathology and Behavioral Deficits. Journal of Parkinsons Disease 12(4), 2022. 1133-1153.
- Limorenko G, Tatli M, Kolla R, Nazarov S, Weil MT, Schöndorf DC, Geist D, Reinhardt P, Ehrnhoefer DE, Stahlberg H, Gasparini L, Lashuel HA (2023): Fully co-factor-free ClearTau platform produces seeding-competent Tau fibrils for reconstructing pathological Tau aggregates. Nature Communications 4;14(1), July 2023.
Hielscher Ultrasonics से उच्च प्रदर्शन अल्ट्रासोनिक homogenizers बनाती है प्रयोगशाला तक औद्योगिक आकार।