VialTweeter सोनिकेटर का उपयोग करके अल्फा-सिन्यूक्लिन का खंडन
वैज्ञानिक अनुसंधान में α-सिन्यूक्लिन फ़ाइब्रिलों और रिबनों का खंडन करके फ़ाइब्रिलों के छोटे टुकड़े या यहाँ तक कि अलग-अलग प्रोटीन अणु भी प्राप्त किए जाते हैं, जिनका विभिन्न प्रायोगिक तकनीकों से अधिक आसानी से विश्लेषण किया जा सकता है। VialTweeter सोनिकेटर अल्फा-सिन्यूक्लिन के कुशल और विश्वसनीय खंडन के लिए सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले अल्ट्रासोनिकेटरों में से एक है।
अनुसंधान में α-सिन्यूक्लिन
अल्फा-सिन्यूक्लिन फ़ाइब्रिल प्रोटीन समुच्चय हैं जिनका पार्किंसन रोग और मनोभ्रंश के कुछ रूपों, जिनमें लेवी बॉडी वाला मनोभ्रंश भी शामिल है, जैसे तंत्रिका अपक्षयी विकारों से गहरा संबंध है। अल्फा-सिन्यूक्लिन फ़ाइब्रिलों पर केंद्रित अनुसंधान का उद्देश्य रोग की प्रगति में उनकी भूमिका को समझना और संभावित चिकित्सीय हस्तक्षेप विकसित करना है। अल्फा-सिन्यूक्लिन फ़ाइब्रिलों को छोटे खंडों में तोड़कर शोधकर्ता उनकी विशिष्ट संरचनात्मक विशेषताओं की जाँच कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, अल्फा-सिन्यूक्लिन फ़ाइब्रिलों का खंडन शोधकर्ताओं को प्रोटीन, लिपिड या छोटे अणुओं जैसे अन्य अणुओं के साथ उनकी अंतःक्रियाओं की जाँच करने में सक्षम बनाता है। छोटे खंड उत्पन्न करके इन अंतःक्रिया करने वाले अणुओं के लिए बंधन स्थलों और बंधुता की अधिक प्रभावी ढंग से जाँच की जा सकती है। छोटे α-Syn फ़ाइब्रिलों और रिबनों की विषाक्तता और जैवरासायनिक प्रभावों में भी बदलाव हो सकता है। इसलिए, एक विश्वसनीय और कुशल खंडन तकनीक अत्यंत आवश्यक है, जो नमूने के त्वरित और सरल उपचार से पुनरुत्पादनीय परिणाम देती हो।
अल्ट्रासोनिक Alpha-Syn खंडन: VialTweeter सोनिकेटर एक स्थापित अल्ट्रासोनिक नमूना तैयारी प्रणाली है, जो बिल्कुल समान परिस्थितियों में एक साथ 10 तक वायलों का सोनिकेशन करती है। प्रोग्राम करने योग्य सेटिंग्स उन्हीं प्रयोगों को सरलता और शीघ्रता से दोहराने की सुविधा देती हैं, जिससे अल्फा-सिन्यूक्लिन फ़ाइब्रिलों के खंडन में अत्यधिक विश्वसनीय और पुनरुत्पादनीय परिणाम मिलते हैं।
VialTweeter सोनिकेटर कई अल्फा-सिन्यूक्लिन नमूनों के एक साथ अल्ट्रासोनिक खंडन के लिए।
सोनिकेटर से α-सिन्यूक्लिन नमूनों की तैयारी
अल्फा-सिन्यूक्लिन फ़ाइब्रिलों का अध्ययन करने के एक तरीके में सोनिकेशन जैसी तकनीकों से उनका निष्कर्षण और खंडन किया जाता है। सोनिकेशन एक ऐसी प्रक्रिया है, जिसमें उच्च तीव्रता वाली, निम्न आवृत्ति की अल्ट्रासाउंड तरंगों से प्रोटीन समुच्चयों को विघटित करके तोड़ा जाता है, जिससे छोटे फ़ाइब्रिल या अलग-अलग प्रोटीन अणु मुक्त होते हैं। इस उद्देश्य के लिए α-सिन्यूक्लिन संबंधी अनुसंधान अध्ययनों में VialTweeter सोनिकेटर का सामान्यतः उपयोग किया जाता है।
अनेक अनुसंधान अध्ययन अल्फा-सिन्यूक्लिन फ़ाइब्रिलों के सोनिकेशन के लिए सटीक नमूना तैयारी प्रोटोकॉलों का वर्णन करते हैं, जिनमें α-सिन्यूक्लिन फ़ाइब्रिलों के कुशल और विश्वसनीय खंडन के लिए Hielscher VialTweeter का उपयोग किया जाता है। अल्ट्रासोनिक विधि से फ़ाइब्रिलों का खंडन करके शोधकर्ता परिणामी उत्पादों का विश्लेषण कर सकते हैं और उनकी संरचना, विषाक्तता तथा अन्य अणुओं के साथ अंतःक्रियाओं की जाँच कर सकते हैं। यह अनुसंधान तंत्रिका अपक्षय के अंतर्निहित तंत्रों के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान करता है और संभावित रूप से नए चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान करने में सहायक हो सकता है। VialTweeter सोनिकेटर का उपयोग करने वाले सुस्थापित α-सिन्यूक्लिन सोनिकेशन प्रोटोकॉल विश्वसनीय और पुनरुत्पादनीय परिणाम प्राप्त करने में सक्षम बनाते हैं।
ऊपर के चित्र: अखंडित अल्फा-सिन्यूक्लिन फ़ाइब्रिल
नीचे के चित्र: VialTweeter सोनिकेटर से अल्ट्रासोनिक विधि द्वारा खंडित अल्फा-सिन्यूक्लिन फ़ाइब्रिल
(अध्ययन और चित्र: ©Dieriks et al., 2022)
α-सिन्यूक्लिन फ़ाइब्रिलों का अल्ट्रासोनिक खंडन – प्रोटोकॉल
चूँकि अनेक शोधकर्ता एकसमान α-सिन्यूक्लिन फ़ाइब्रिल खंड उत्पन्न करने के लिए VialTweeter सोनिकेटर को पसंदीदा खंडन तकनीक के रूप में उपयोग करते हैं, इसलिए स्थापित प्रोटोकॉल आसानी से उपलब्ध हैं। नीचे खंडन के कुछ उदाहरणात्मक प्रोटोकॉल दिए गए हैं।
ClearTau सीड की तैयारी: ClearTau फ़ाइब्रिलों को dH2O में तनु करके उनकी सांद्रता 10 μM की गई और VialTweeter युक्त UP200St सोनिकेटर का उपयोग करके ट्यूब के भीतर 70 % आयाम पर 1 s चालू और 1 s बंद चक्र के साथ 50 s तक सोनिकेशन किया गया। सीडों का अभिलक्षण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी से किया गया।
ThS प्रतिदीप्ति मापन: ClearTau फाइब्रिलों को dH2O में तनु करके 2.5 μM सांद्रता पर लाया गया और VialTweeter के साथ UP200St का उपयोग करके ट्यूब के भीतर 70 % आयाम पर 50 s तक 1 s चालू और 1 s बंद के चक्र में सोनिकेशन किया गया। नियंत्रण के रूप में 2.5 μM पूर्ण-लंबाई वाले Tau 4R2N मोनोमर का उपयोग किया गया। 100 μl अभिक्रिया मिश्रण में 100 μl ThS (10 μM) मिलाया गया, जिससे प्रोटीन की अंतिम सांद्रता 1.25 μM हुई। FLUOstar Omega माइक्रोप्लेट रीडर में रखी गई पारदर्शी तली वाली 96 वेल प्लेटों का उपयोग करके एकल समय-बिंदु पर ThS प्रतिदीप्ति मापी गई; उत्तेजन 445 nm पर किया गया और 485 nm पर उत्सर्जन दर्ज किया गया।
(cf. Limorenko et al., 2023)
सोनिकेशन द्वारा α-सिन्यूक्लिन की एकसमान लंबाई: α-syn फाइब्रिलों और रिबनों की लंबाई में विषमता को कम करने के लिए बर्फ पर रखी 2-ml Eppendorf ट्यूबों में 20 min तक सोनिकेशन किया गया। इसके लिए VialTweeter को 75% आयाम और 0.5 s पल्स पर सेट किया गया।
(cf. Bousset et al., 2013)
मानव पुनःसंयोजक मोनोमेरिक WT या S129A a-Syn और उनसे उत्पन्न होने वाले फाइब्रिलीय बहुरूपों के साथ-साथ a-Syn 1–110 का भी गुणवत्ता नियंत्रण किया गया। इसके बाद, VialTweeter अल्ट्रासोनिकेटर में 2-mL Eppendorf ट्यूबों में 20 min तक सोनिकेशन द्वारा फाइब्रिलीय बहुरूपों का खंडन किया गया, ताकि 42–52 nm के औसत आकार वाले फाइब्रिलीय कण उत्पन्न हों, जो एंडोसाइटोसिस के लिए उपयुक्त हों।
(cf. Shrivastava et al., 2020)
पाँच फाइब्रिलीय α-Syn बहुरूपों का अभिलक्षणन। (A) ऋणात्मक अभिरंजन किए गए α-Syn फाइब्रिलीय बहुरूपों fibrils, ribbons, fibrils-91, fibrils-65 और fibrils-110 के VialTweeter से खंडन से पहले (ऊपरी पंक्ति) और बाद (निचली पंक्ति) के संचरण इलेक्ट्रॉन सूक्ष्मचित्र दिखाए गए हैं। (B) खंडित फाइब्रिलीय बहुरूपों का लंबाई वितरण दिखाया गया है। जिन फाइब्रिलीय समुच्चयों से हिस्टोग्राम तैयार किए गए, उनकी संख्या (n) दर्शाई गई है।
(अध्ययन और चित्र: Shrivastava et al., 2020)
α-Syn फाइब्रिलों का VialTweeter में 2 ml Eppendorf ट्यूबों में 20 min तक सोनिकेशन द्वारा खंडन किया गया, ताकि औसतन 42–52 nm आकार के फाइब्रिलीय कण उत्पन्न हों; इस आकार का आकलन TEM विश्लेषण से किया गया।
(cf. Negrini et al., 2022)
पुनःनिलंबित fibrils91 (PBS में) को कोशिका संवर्धनों में मिलाने से पहले Vial Tweeter सोनिकेटर का उपयोग करके 2 mL Eppendorf ट्यूबों में 20 min तक सोनिकेशन द्वारा खंडित किया गया, छोटे अंशों में बाँटा गया, तरल नाइट्रोजन में तत्काल जमाया गया और उपयोग किए जाने तक -80 ̊C पर संग्रहित किया गया।
(cf. Vajhøj et al., 2021)
मल्टी-वेल प्लेटों में अल्फा-सिन्यूक्लिन फाइब्रिलों के खंडन के लिए सोनिकेटर UIP400MTP।
α-Syn खंडन के लिए VialTweeter और प्रयोगशाला सोनिकेटर
Hielscher Ultrasonics को अत्याधुनिक अल्ट्रासोनिकेटरों के अग्रणी निर्माता के रूप में विश्वभर में मान्यता प्राप्त है। विश्वभर की प्रमुख अनुसंधान प्रयोगशालाओं में विश्वसनीय और स्थापित हमारे अल्ट्रासोनिकेटर आपके महत्वपूर्ण प्रयोगों के लिए बेजोड़ गुणवत्ता और प्रदर्शन प्रदान करते हैं।
Hielscher VialTweeter और किसी भी अन्य Hielscher सोनिकेटर के साथ आपको उपयोग में बेजोड़ सुविधा मिलेगी, क्योंकि इन्हें पुनरुत्पादनीय परिणामों, उपयोग में आसानी और निर्बाध संचालन के लिए सोच-समझकर डिज़ाइन किया गया है। स्वचालित डेटा रिकॉर्डिंग सुविधाओं के साथ आप अपने अनुसंधान पर ध्यान केंद्रित कर सकते हैं, जबकि हमारे अल्ट्रासोनिकेटर पुनरुत्पादनीयता और सटीकता के लिए महत्वपूर्ण डेटा सावधानीपूर्वक रिकॉर्ड करते हैं।
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हमारे अल्ट्रासोनिकेटरों का अभिकल्पन और निर्माण जर्मनी में होता है। जर्मन परिशुद्धता और उच्चतम अभियांत्रिकी गुणवत्ता हर बार अल्फा-सिन्यूक्लीन फ़ाइब्रिल के खंडन जैसी नमूना तैयारी की विश्वसनीयता और सटीकता सुनिश्चित करती हैं। असंगत परिणामों की अब कोई चिंता नहीं – हमारी अल्ट्रासाउंड तकनीक सुनिश्चित करती है कि आपका अनुसंधान वैज्ञानिक प्रगति में सबसे आगे बना रहे।
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नवाचार, विश्वसनीयता और असाधारण उपयोगकर्ता अनुभव चुनें – अल्फा-सिन्यूक्लीन फ़ाइब्रिल के खंडन के लिए VialTweeter जैसे हमारे प्रयोगशाला सोनिकेटर चुनें। पहले से स्थापित प्रोटोकॉल का लाभ उठाएँ और उन अग्रणी शोधकर्ताओं में शामिल हों जो अपने महत्वपूर्ण अध्ययनों के लिए हमारी तकनीक पर भरोसा करते हैं। हमारे अत्याधुनिक अल्ट्रासोनिकेटरों के साथ अपने अनुसंधान को नई ऊँचाइयों पर ले जाएँ और डिमेंशिया तथा तंत्रिका अपक्षयी रोगों के अनुसंधान में नई संभावनाएँ तलाशें।
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Hielscher अल्ट्रासोनिकेटर अपनी उच्चतम गुणवत्ता और डिज़ाइन मानकों के लिए प्रसिद्ध हैं। मज़बूती और आसान संचालन के कारण हमारे अल्ट्रासोनिकेटरों को औद्योगिक संयंत्रों में सहजता से एकीकृत किया जा सकता है। Hielscher अल्ट्रासोनिकेटर कठोर परिस्थितियों और चुनौतीपूर्ण परिवेशों में आसानी से काम करते हैं।
Hielscher Ultrasonics एक ISO प्रमाणित कंपनी है और अत्याधुनिक तकनीक तथा उपयोग में सुगमता वाले उच्च प्रदर्शन के अल्ट्रासोनिकेटरों पर विशेष ज़ोर देती है। निस्संदेह, Hielscher सोनिकेटर CE के अनुरूप हैं और UL, CSA तथा RoHs की आवश्यकताओं को पूरा करते हैं।
नीचे दी गई तालिका हमारे प्रयोगशाला आकार के अल्ट्रासोनिकेटरों की अनुमानित प्रसंस्करण क्षमता का संकेत देती है:
| अनुशंसित उपकरण | बैच का आयतन | प्रवाह दर |
|---|---|---|
| UIP400MTP | मल्टी-वेल / माइक्रोटाइटर प्लेटें | n.a. |
| Ultrasonic CupHorn | वायल या बीकर के लिए CupHorn | n.a. |
| GDmini2 | अल्ट्रासोनिक सूक्ष्म-प्रवाह रिएक्टर | n.a. |
| VialTweeter | 0.5 से 1.5mL | n.a. |
| UP100H | 1 से 500mL | 10 से 200mL/min |
| UP200Ht, UP400St | 10 से 2000mL | 20 से 400mL/min |
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VialTweeter का उपयोग आमतौर पर विश्लेषण-पूर्व नमूना तैयारी के एक चरण के रूप में अल्फा-सिन्यूक्लीन फ़ाइब्रिल के खंडन के लिए किया जाता है
साहित्य / संदर्भ
- Emil Dandanell Agerschou, Marie P. Schützmann, Nikolas Reppert, Michael M. Wördehoff, Hamed Shaykhalishahi, Alexander K. Buell, Wolfgang Hoyer (2021): β-Turn exchanges in the α-synuclein segment 44-TKEG-47 reveal high sequence fidelity requirements of amyloid fibril elongation. Biophysical Chemistry, Volume 269, 2021.
- Bousset, L., Pieri, L., Ruiz-Arlandis, G. et al. (2013): Structural and functional characterization of two alpha-synuclein strains. Nature Communications 4, 2575 (2013).
- Vajhøj, Charlott; Schmid, Benjamin; Alik, Ania; Melki, Ronald; Fog, Karina; Holst, Bjørn; Stummann, Tina (2021): Establishment of a human induced pluripotent stem cell neuronal model for identification of modulators of A53T α-synuclein levels and aggregation. PLOS ONE 16, 2021.
- Dieriks B.V.; Highet B.; Alik A.; Bellande T.; Stevenson T.J.; Low V.; Park T.I.; Correia J.; Schweder P.; Faull R.L.M.; Melki R.; Curtis M.A.; Dragunow M. (2022): Human pericytes degrade diverse α-synuclein aggregates. PLoS One, Nov 18;17(11), 2022.
- Amulya Nidhi Shrivastava, Luc Bousset, Marianne Renner, Virginie Redeker, Jimmy Savistchenko, Antoine Triller, Ronald Melki (2020): Differential Membrane Binding and Seeding of Distinct α-Synuclein Fibrillar Polymorphs. Biophysical Journal, Volume 118, Issue 6, 2020. 1301-1320.
- Negrini M, Tomasello G, Davidsson M, Fenyi A, Adant C, Hauser S, Espa E, Gubinelli F, Manfredsson FP, Melki R, Heuer A. (2022): Sequential or Simultaneous Injection of Preformed Fibrils and AAV Overexpression of Alpha-Synuclein Are Equipotent in Producing Relevant Pathology and Behavioral Deficits. Journal of Parkinsons Disease 12(4), 2022. 1133-1153.
- Limorenko G, Tatli M, Kolla R, Nazarov S, Weil MT, Schöndorf DC, Geist D, Reinhardt P, Ehrnhoefer DE, Stahlberg H, Gasparini L, Lashuel HA (2023): Fully co-factor-free ClearTau platform produces seeding-competent Tau fibrils for reconstructing pathological Tau aggregates. Nature Communications 4;14(1), July 2023.
अक्सर पूछे जाने वाले प्रश्न
क्या अल्फा-सिन्यूक्लीन एक अमाइलॉइड है?
हाँ, अल्फा-सिन्यूक्लीन अमाइलॉइड जैसे फ़ाइब्रिल बना सकता है। यह लेवी बॉडीज़ का एक प्रमुख घटक है, जो पार्किंसन रोग और अन्य सिन्यूक्लीनोपैथियों की रोगात्मक पहचान हैं। इसका समुच्चयन पारंपरिक अमाइलॉइडों के समान न्यूक्लिएशन पर निर्भर बहुलकीकरण प्रक्रिया के अनुसार होता है।
अमाइलॉइड-बीटा और अल्फा-सिन्यूक्लीन में क्या अंतर है?
एमिलॉइड-बीटा (Aβ) और अल्फा-सिन्यूक्लिन (α-syn) अलग-अलग प्रोटीन हैं, जो तंत्रिका अपक्षयी रोगों में रोगात्मक समुच्चय बनाते हैं। एमिलॉइड प्रीकर्सर प्रोटीन (APP) से उत्पन्न Aβ मुख्य रूप से अल्ज़ाइमर रोग से जुड़ा है और कोशिकाबाह्य प्लाक बनाता है। इसके विपरीत, α-syn एक प्रीसिनेप्टिक न्यूरोनल प्रोटीन है, जो पार्किंसन रोग और संबंधित विकारों में कोशिकाओं के भीतर एकत्रित होता है। यद्यपि दोनों में β-शीट से समृद्ध एमिलॉइड संरचनाएँ होती हैं, उनके अनुक्रम, समुच्चयन के मार्ग और रोग-विशिष्ट विकृतियाँ अलग-अलग होती हैं।
एमिलॉइड किस प्रकार का प्रोटीन है?
एमिलॉइड एक गलत तरीके से वलित, तंतुमय प्रोटीन है, जो क्रॉस-β-शीट संरचना अपनाता है और एकत्रित होकर अघुलनशील फाइब्रिल बनाता है। ये प्रोटीन आमतौर पर सामान्यतः घुलनशील पूर्ववर्ती पदार्थों से उत्पन्न होते हैं, जिनमें संरूपण संबंधी परिवर्तन होते हैं, जिससे स्व-संयोजन और निक्षेपण होता है। एमिलॉइड विभिन्न तंत्रिका अपक्षयी और पूरे शरीर को प्रभावित करने वाले रोगों से जुड़े हैं, जिनमें उनका समुच्चयन कोशिकीय विषाक्तता और ऊतक क्षति में योगदान देता है। जानें कि 96-वेल प्लेट सोनिकेटर UIP400MTP अनुसंधान उद्देश्यों के लिए मानकीकृत एमिलॉइड फाइब्रिल तेज़ी से बनाने में कैसे मदद करता है!
एमिलॉइड के कारण कौन-से रोग होते हैं?
एमिलॉइड अनेक रोगों में शामिल होते हैं, जिन्हें सामूहिक रूप से एमिलॉइडोसिस कहा जाता है। इनमें शामिल हैं:
- तंत्रिका अपक्षयी रोग: अल्ज़ाइमर रोग (Aβ), पार्किंसन रोग (α-syn), हंटिंगटन रोग (उत्परिवर्ती हंटिंगटिन), और प्रायन रोग (PrPSc)। (उच्च नमूना प्रसंस्करण क्षमता के साथ प्रायन का पता लगाने के लिए सोनिकेशन-सहायित PMCA के बारे में और पढ़ें!)
- प्रणालीगत एमिलॉइडोसिस: लाइट-चेन (AL) एमिलॉइडोसिस, ट्रान्सथायरेटिन (ATTR) एमिलॉइडोसिस, और द्वितीयक (AA) एमिलॉइडोसिस।
- स्थानीयकृत एमिलॉइडोसिस: टाइप 2 मधुमेह में आइलेट एमिलॉइड पॉलीपेप्टाइड (IAPP)।
प्रत्येक एमिलॉइड-संबंधित रोग की विशेषता प्रोटीन का गलत तरीके से वलित होना, समुच्चयन और निक्षेपण है, जिससे कोशिकीय कार्य में गड़बड़ी और विषाक्तता होती है।
Hielscher Ultrasonics उच्च-प्रदर्शन वाले अल्ट्रासोनिक होमोजेनाइज़र का निर्माण प्रयोगशाला आकार से लेकर औद्योगिक आकार तक करती है।