वायलट्वीटर सोनिकेटर का उपयोग करके अल्फा-सिन्यूक्लिन विखंडन
α-सिन्यूक्लिन फाइब्रिल और रिबन छोटे फाइब्रिल स्निपेट या यहां तक कि व्यक्तिगत प्रोटीन अणुओं को उत्पन्न करने के लिए वैज्ञानिक अनुसंधान में खंडित होते हैं, जिन्हें विभिन्न प्रयोगात्मक तकनीकों का उपयोग करके अधिक आसानी से विश्लेषण किया जा सकता है। वायलट्वीटर सोनिकेटर कुशल और विश्वसनीय अल्फा-सिंक्यूक्लिन विखंडन के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किए जाने वाले अल्ट्रासोनिकेटर में से एक है।
अनुसंधान में α-सिन्यूक्लिन।
अल्फा-सिन्यूक्लिन फाइब्रिल प्रोटीन समुच्चय हैं जो पार्किंसंस रोग और मनोभ्रंश के कुछ रूपों जैसे न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों से दृढ़ता से जुड़े होते हैं, जिसमें लेवी शरीर के साथ मनोभ्रंश भी शामिल है। अल्फा-सिन्यूक्लिन फाइब्रिल पर केंद्रित अनुसंधान का उद्देश्य रोग की प्रगति में उनकी भूमिका को समझना और संभावित चिकित्सीय हस्तक्षेप विकसित करना है। अल्फा-सिन्यूक्लिन फाइब्रिल को छोटे टुकड़ों में तोड़कर, शोधकर्ता उनकी विशिष्ट संरचनात्मक विशेषताओं की जांच कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, अल्फा-सिन्यूक्लिन फाइब्रिल का टुकड़ा शोधकर्ताओं को प्रोटीन, लिपिड या छोटे अणुओं जैसे अन्य अणुओं के साथ उनकी बातचीत की जांच करने में सक्षम बनाता है। छोटे टुकड़ों का उत्पादन करके, इन बातचीत भागीदारों के लिए बाध्यकारी साइटों और आत्मीयता की अधिक प्रभावी ढंग से जांच की जा सकती है। छोटे α-सिन फ्रिब्रिल और रिबन भी परिवर्तित विषाक्तता और जैव रासायनिक प्रभाव दिखा सकते हैं। इसलिए, एक विश्वसनीय और कुशल विखंडन तकनीक, जो एक त्वरित और सरल नमूना उपचार में प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम उत्पन्न करती है, महत्वपूर्ण है।
अल्ट्रासोनिक अल्फा-सिन विखंडन: वायलट्वीटर सोनिकेटर स्थापित अल्ट्रासोनिक नमूना तैयारी प्रणाली है जो बिल्कुल समान परिस्थितियों में एक साथ 10 शीशियों तक सोनिक करती है। प्रोग्रामेबल सेटिंग्स एक ही प्रयोगों के सरल और त्वरित पुन: रन के लिए अनुमति देती हैं, जो अल्फा-सिन्यूक्लिन फाइब्रिल विखंडन में अत्यधिक विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम देती है।
वायलट्वीटर सोनिकेटर कई अल्फा-सिन्यूक्लिन नमूनों के एक साथ अल्ट्रासोनिक विखंडन के लिए।
α-सोनिकेटर के साथ सिन्यूक्लिन नमूना तैयारी
अल्फा-सिन्यूक्लिन फाइब्रिल का अध्ययन करने के लिए एक दृष्टिकोण में सोनिकेशन जैसी तकनीकों का उपयोग करके उनके निष्कर्षण और विखंडन शामिल हैं। सोनिकेशन एक ऐसी प्रक्रिया है जो प्रोटीन समुच्चय को बाधित करने और तोड़ने के लिए उच्च तीव्रता, कम आवृत्ति अल्ट्रासाउंड तरंगों का उपयोग करती है, जिससे छोटे फाइब्रिल या व्यक्तिगत प्रोटीन अणुओं की रिहाई होती है। सोनिकेटर वायलट्वीटर इस उद्देश्य के लिए α-सिन्यूक्लिन-संबंधित अनुसंधान अध्ययनों में आमतौर पर इस्तेमाल किया जाने वाला उपकरण है।
कई शोध अध्ययनों में अल्फा-सिन्यूक्लिन फाइब्रिल सोनिकेशन के सटीक नमूना तैयारी प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है, जो कुशल और विश्वसनीय α-सिन्यूक्लिन फाइब्रिल विखंडन के लिए Hielscher वायलट्वीटर का उपयोग करते हैं। फाइब्रिल को अल्ट्रासोनिक रूप से टुकड़े करके, शोधकर्ता परिणामी उत्पादों का विश्लेषण कर सकते हैं और उनकी संरचना, विषाक्तता और अन्य अणुओं के साथ बातचीत की जांच कर सकते हैं। यह शोध न्यूरोडीजेनेरेशन के अंतर्निहित तंत्र में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान करता है और संभावित रूप से नए चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान करता है। वायलट्वीटर सोनिकेटर का उपयोग करके अच्छी तरह से स्थापित α-सिन्यूक्लिन सोनिकेशन प्रोटोकॉल विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणामों की अनुमति देते हैं।
ऊपरी छवियां: अखंडित अल्फा-सिंक्यूक्लिन फाइब्रिल।
निचली छवियां: वायलट्वीटर सोनिकेटर के साथ अल्ट्रासोनिक रूप से खंडित अल्फा-सिंक्यूक्लिन फाइब्रिल
(अध्ययन और चित्र: ©डिरिक्स एट अल।
α-सिन्यूक्लिन फाइब्रिल का अल्ट्रासोनिक विखंडन – प्रोटोकॉल
चूंकि कई शोधकर्ता एक समान α-सिन्यूक्लिन फाइब्रिल टुकड़े बनाने के लिए पसंदीदा विखंडन तकनीक के रूप में वायलट्वीटर सोनिकेटर का उपयोग करते हैं, इसलिए स्थापित प्रोटोकॉल आसानी से उपलब्ध हैं। नीचे आप कुछ अनुकरणीय विखंडन प्रोटोकॉल पा सकते हैं।
क्लियरटाउ बीज की तैयारी: क्लियरटाऊ फाइब्रिल को डीएच 2 ओ में 10 μM तक पतला किया गया था और वायलट्वीटर के साथ सोनिकेटर यूपी 200 एसटी का उपयोग करके ट्यूब में 1 एस ऑन 1 एस ऑफ साइकिल के साथ 50 सेकंड के लिए 70% आयाम पर सोनिकेटेड किया गया था। बीज इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा विशेषता थी।
टीएचएस प्रतिदीप्ति माप: क्लियरटाउ फाइब्रिल को डीएच 2 ओ में 2.5 μM तक पतला किया गया था और वायलट्वीटर के साथ यूपी 200 एसटी का उपयोग करके ट्यूब में 1 s ON 1 s ऑफ साइकिल के साथ 50 s के लिए 70% आयाम पर सोनिक किया गया था। 2.5 μM पूर्ण लंबाई ताऊ 4R2N मोनोमर एक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था। 100 μl प्रतिक्रिया के लिए, THS (10 μM) के 100 μl जोड़े गए, जिससे 1.25 μM की अंतिम प्रोटीन सांद्रता प्राप्त हुई। सिंगल-टाइम पॉइंट टीएचएस फ्लोरेसेंस को फ्लुओस्टार ओमेगा माइक्रोप्लेट रीडर में स्थापित 96 अच्छी तरह से स्पष्ट निचली प्लेटों का उपयोग करके मापा गया था, जिसमें 445 एनएम पर उत्तेजना और 485 एनएम पर उत्सर्जन दर्ज किया गया था।
(सीएफ लिमोरेंको एट अल, 2023)।
सोनिकेशन का उपयोग करके समान α-सिंक्यूक्लिन लंबाई: α-सिन फाइब्रिल और रिबन की लंबाई विषमता को 75% आयाम, 0.5 एस दालों पर सेट किए गए वायलट्वीटर में 2-मिलीलीटर एपेंडॉर्फ ट्यूबों में बर्फ पर 20 मिनट के लिए सोनिकेशन द्वारा कम किया गया था।
(cf. Bousset et al., 2013)
मानव पुनः संयोजक मोनोमेरिक डब्ल्यूटी या एस 129 ए ए-सिन और उनके द्वारा उत्पन्न फाइब्रिलर पॉलीमोर्फ के साथ-साथ ए-सिन 1-110 का गुणवत्ता नियंत्रण किया गया था। इसके बाद, फाइब्रिलर पॉलीमोर्फ को 42-52 एनएम के औसत आकार के साथ फाइब्रिलर कणों को उत्पन्न करने के लिए वायलट्वीटर अल्ट्रासोनिकेटर में 2-एमएल एपेंडॉर्फ ट्यूबों में 20 मिनट के लिए सोनिकेशन द्वारा खंडित किया गया था जो एंडोसाइटोसिस के लिए उपयुक्त हैं।
(सीएफ श्रीवास्तव और अन्य, 2020)
"पांच फाइब्रिलर α-सिन पॉलीमोर्फ का लक्षण वर्णन"। (ए) नकारात्मक रूप से सना हुआ α-सिन फाइब्रिलर पॉलीमोर्फ फाइब्रिल, रिबन, फाइब्रिल -91, फाइब्रिल -65, और फाइब्रिल -110 के ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ (ऊपरी लेन) से पहले और वायलट्वीटर (निचली लेन) के साथ विखंडन के बाद दिखाया गया है। (बी) खंडित फाइब्रिलर पॉलीमोर्फ का लंबाई वितरण दिखाया गया है। हिस्टोग्राम से प्राप्त फाइब्रिलर असेंबली की संख्या (एन) इंगित की गई है।
(अध्ययन और चित्र: श्रीवास्तव और अन्य, 2020)
टीईएम विश्लेषण द्वारा मूल्यांकन के अनुसार औसत आकार 42-52 एनएम के साथ फाइब्रिलर कण उत्पन्न करने के लिए α-सिन फाइब्रिल को एक वायलट्वीटर में 2 मिलीलीटर एपेंडॉर्फ ट्यूबों में 20 मिनट के लिए सोनिकेशन द्वारा खंडित किया गया था।
(सीएफ नेग्रिनी एट अल, 2022)
पुन: निलंबित फाइब्रिल 91 (पीबीएस में) को सेल कल्चर में जोड़ने से पहले 2 एमएल एपेंडॉर्फ ट्यूबों में 20 मिनट के लिए शीशी ट्वीटर सोनिकेटर का उपयोग करके विभाजित किया गया था, एलिकोट, तरल नाइट्रोजन में फ्लैश जमे हुए और -80 डिग्री सेल्सियस पर उपयोग तक संग्रहीत किया गया था।
(सीएफ वझोज एट अल, 2021)
मल्टी-वेल प्लेटों में अल्फा-सिन्यूक्लिन फाइब्रिल विखंडन के लिए सोनिकेटर यूआईपी 400एमटीपी।
α-सिन फ्रेगमेंटेशन के लिए वायलट्वीटर और लैब सोनिकेटर
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Hielscher Ultrasonics एक आईएसओ प्रमाणित कंपनी है और अत्याधुनिक प्रौद्योगिकी और उपयोगकर्ता-मित्रता की विशेषता वाले उच्च प्रदर्शन अल्ट्रासोनिकेटर पर विशेष जोर देती है। बेशक, Hielscher Sonicaters CE अनुरूप हैं और UL, CSA और RoHs की आवश्यकताओं को पूरा करते हैं।
नीचे दी गई तालिका आपको हमारे प्रयोगशाला-आकार के अल्ट्रासोनिकेटर्स की अनुमानित प्रसंस्करण क्षमता का संकेत देती है:
| अनुशंसित उपकरणों | बैच वॉल्यूम | प्रवाह की दर |
|---|---|---|
| यूआईपी400एमटीपी | मल्टी-वेल / माइक्रोटिटर प्लेटें | एन.ए. |
| अल्ट्रासोनिक cuphorn | शीशियों या बीकर के लिए CupHorn | एन.ए. |
| GDmini2 | अल्ट्रासोनिक माइक्रो-फ्लो रिएक्टर | एन.ए. |
| VialTweeter | 0.5 से 1.5 एमएल | एन.ए. |
| UP100H | 1 से 500 एमएल | 10 से 200 मील / मिनट |
| UP200Ht, UP400St | 10 से 2000 मील | 20 से 400 एमएल / मिनट |
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द वायल ट्वीटर आमतौर पर पूर्व-विश्लेषणात्मक नमूना तैयारी के चरण के रूप में अल्फा-सिन्यूक्लिन फाइब्रिल को टुकड़े करने के लिए उपयोग किया जाता है
साहित्य/संदर्भ
- Emil Dandanell Agerschou, Marie P. Schützmann, Nikolas Reppert, Michael M. Wördehoff, Hamed Shaykhalishahi, Alexander K. Buell, Wolfgang Hoyer (2021): β-Turn exchanges in the α-synuclein segment 44-TKEG-47 reveal high sequence fidelity requirements of amyloid fibril elongation. Biophysical Chemistry, Volume 269, 2021.
- Bousset, L., Pieri, L., Ruiz-Arlandis, G. et al. (2013): Structural and functional characterization of two alpha-synuclein strains. Nature Communications 4, 2575 (2013).
- Vajhøj, Charlott; Schmid, Benjamin; Alik, Ania; Melki, Ronald; Fog, Karina; Holst, Bjørn; Stummann, Tina (2021): Establishment of a human induced pluripotent stem cell neuronal model for identification of modulators of A53T α-synuclein levels and aggregation. PLOS ONE 16, 2021.
- Dieriks B.V.; Highet B.; Alik A.; Bellande T.; Stevenson T.J.; Low V.; Park T.I.; Correia J.; Schweder P.; Faull R.L.M.; Melki R.; Curtis M.A.; Dragunow M. (2022): Human pericytes degrade diverse α-synuclein aggregates. PLoS One, Nov 18;17(11), 2022.
- Amulya Nidhi Shrivastava, Luc Bousset, Marianne Renner, Virginie Redeker, Jimmy Savistchenko, Antoine Triller, Ronald Melki (2020): Differential Membrane Binding and Seeding of Distinct α-Synuclein Fibrillar Polymorphs. Biophysical Journal, Volume 118, Issue 6, 2020. 1301-1320.
- Negrini M, Tomasello G, Davidsson M, Fenyi A, Adant C, Hauser S, Espa E, Gubinelli F, Manfredsson FP, Melki R, Heuer A. (2022): Sequential or Simultaneous Injection of Preformed Fibrils and AAV Overexpression of Alpha-Synuclein Are Equipotent in Producing Relevant Pathology and Behavioral Deficits. Journal of Parkinsons Disease 12(4), 2022. 1133-1153.
- Limorenko G, Tatli M, Kolla R, Nazarov S, Weil MT, Schöndorf DC, Geist D, Reinhardt P, Ehrnhoefer DE, Stahlberg H, Gasparini L, Lashuel HA (2023): Fully co-factor-free ClearTau platform produces seeding-competent Tau fibrils for reconstructing pathological Tau aggregates. Nature Communications 4;14(1), July 2023.
हिल्स्चर अल्ट्रासोनिक्स उच्च प्रदर्शन अल्ट्रासोनिक होमोजेनाइजर्स से बनाती है प्रयोगशाला सेवा मेरे औद्योगिक आकार।