UIP400MTP सोनिकेटर का उपयोग करके प्रियन के उच्च-थ्रूपुट डिटेक्शन के लिए पीएमसीए

UIP400MTP मल्टी-वेल प्लेट सोनिकेटर प्रोटीन मिसफोल्डिंग चक्रीय प्रवर्धन (पीएमसीए) में उच्च-थ्रूपुट नमूना तैयार करने के लिए एक शक्तिशाली समाधान प्रदान करता है। कई कुओं में समान ऊर्जा वितरण प्रदान करके और सटीक सोनीशन मापदंडों को बनाए रखते हुए, यह प्रणाली असाधारण प्रजनन क्षमता के साथ कई नमूनों के एक साथ प्रसंस्करण को सक्षम बनाती है। पीएमसीए को अनुकूलित करने के लिए ये क्षमताएं महत्वपूर्ण हैं ताकि चुनौतीपूर्ण जैविक नमूनों में कम सांद्रता में प्रियन का पता लगाया जा सके, जैसे लार, जहां परख अवरोधक परिणामों को अस्पष्ट कर सकते हैं।

प्रियन रोग, जैसे कि गर्भाशय ग्रीवा में पुरानी बर्बाद करने वाली बीमारी (सीडब्ल्यूडी) और मनुष्यों में क्रूट्सफेल्ड-जैकब रोग (सीजेडी), मिसफोल्डेड प्रियन प्रोटीन (पीआरपी) के कारण न्यूरोडीजेनेरेटिव विकार हैं^{अनुसूचित जाति}). इन बीमारियों में अक्सर लार, रक्त और मूत्र जैसे शारीरिक तरल पदार्थों में संक्रामक प्रियन के निम्न स्तर शामिल होते हैं, जो निदान और अनुसंधान को जटिल बनाते हैं। पर्यावरणीय मैट्रिक्स में प्रियन शेड के माध्यम से सीडब्ल्यूडी के क्षैतिज संचरण का वन्यजीव प्रबंधन और पारिस्थितिक स्वास्थ्य के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है। इसी तरह, Creutzfeldt-Jakob रोग जैसी बीमारियों में, मानव नमूनों से मिसफोल्डेड प्रियन प्रोटीन का विश्वसनीय प्रवर्धन निदान को आगे बढ़ाने और रोग की प्रगति को समझने के लिए महत्वपूर्ण है।

एक संशोधित पीएमसीए प्रोटोकॉल को लागू करने से आम परख अवरोधकों (जैसे, लार में श्लेष्म) को बायपास करने और वास्तविक समय क्वाकिंग-प्रेरित रूपांतरण (आरटी-क्विक) जैसी तकनीकों का उपयोग करके अन्यथा ज्ञानी या अस्पष्ट होने वाले प्रियन का पता लगाने में उच्च संवेदनशीलता प्राप्त करने की अनुमति मिलती है। ये प्रगति विभिन्न बीमारियों के लिए प्रियन डिटेक्शन को बढ़ाती है, जिससे पीएमसीए प्रियन अनुसंधान और निदान के लिए एक अनिवार्य उपकरण बन जाता है। मल्टी-वेल प्लेट सोनिकेटर UIP400MTP उच्च-थ्रूपुट पीएमसीए को माइक्रोप्लेट्स (जैसे 6-, 24-, या 96-वेल प्लेट्स) या ट्यूब रैक में शीशियों में कई नमूनों को सोनिकेट करने की सुविधा देता है।

उच्च-थ्रूपुट प्रोटीन मिसफोल्डिंग चक्रीय प्रवर्धन (PMCA) के लिए प्रोटोकॉल

निम्नलिखित प्रोटोकॉल मजबूत अनुसंधान परिणामों के लिए बिल्कुल एक ही शर्तों के तहत उच्च नमूना संख्या के कुशल प्रसंस्करण की अनुमति देता है।

नमूना तैयार करना

प्रारंभिक सामग्री:
द्वारा नमूने तैयार करें:

• पीएमसीए सब्सट्रेट में सरकोसिल निष्कर्षण छर्रों को निलंबित करना।
• सीधे स्पाइकिंग मस्तिष्क समरूप या प्रियन बीज के साथ रक्त के नमूने।

सब्सट्रेट:

• ट्रांसजेनिक चूहों से अधिक व्यक्त पीआरपी से तैयार 10% (wt/vol) मस्तिष्क समरूप का उपयोग करें^{के आसपास} (जैसे, टीजी चूहों)।
• मस्तिष्क के ऊतकों को समरूप बनाएं:
  – 1× पीबीएस।
  – 150 मिमी NaCl.
  – 1% ट्राइटन X-100।
• उपयोग होने तक सब्सट्रेट को -80ºC पर स्टोर करें।

माइक्रोप्लेट या ट्यूब में नमूना सेटअप:
ट्यूब:

• मस्तिष्क समरूप सब्सट्रेट के 90 माइक्रोन जोड़ें और नमूना के 10 माइक्रोन (जैसे, रक्त, मस्तिष्क समरूप, या सरकोसिल गोली) के साथ बीज जोड़ें।
• प्रत्येक 0.2 एमएल ट्यूब में 3 टेफ्लॉन मोती (1.59 मिमी या 2.38 मिमी व्यास) रखें।
• UIP400MTP sonicator के साथ संगत रैक में ट्यूबों माउंट.

6-अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट:

• अच्छी तरह से प्रति नमूना के 500 माइक्रोन के साथ मस्तिष्क समरूप सब्सट्रेट और बीज के 5 एमएल जोड़ें।
• प्रत्येक कुएं में 3 टेफ्लॉन मोती जोड़ें।

पीएमसीए प्रक्रिया

नियोजन:
निर्माता के निर्देशों के अनुसार ट्यूब रैक या 6-वेल माइक्रोप्लेट को UIP400MTP सोनिकेटर में रखें।

साइकिलिंग कार्यक्रम:
निम्नानुसार 144 PMCA चक्र करें:

• इनक्यूबेशन: 37 डिग्री सेल्सियस पर 29 मिनट और 30 सेकंड।
• Sonication: 60% आयाम पर 30 सेकंड।
• तापमान की निगरानी करें: नमूना तापमान की निगरानी के लिए प्लग करने योग्य तापमान संवेदक का उपयोग करें और UIP400MTP को अधिकतम 48-50 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर प्रोग्राम करें।

बाद के दौर:
144 चक्रों के पहले दौर को पूरा करने के बाद, प्रवर्धित सामग्री का एक विभाज्य स्थानांतरण:

• ताजा ट्रांसजेनिक माउस मस्तिष्क समरूप सब्सट्रेट में 10 गुना पतला।
• बाद के दौर के लिए 96 पीएमसीए चक्र करें, एक ही सोनीशन मापदंडों को बनाए रखें।
• राउंड की वांछित संख्या के लिए जारी रखें (आमतौर पर 5 तक)।

पीआरपी का पता लगाना^{अनुसूचित जाति}

1. प्रोटीनेज K पाचन:
   – 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रोटीनेज के (50 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ नमूनों का इलाज करें।
   – एसडीएस-नमूना बफर जोड़कर और 10 मिनट के लिए उबालकर पाचन समाप्त करें।
2. वेस्टर्न ब्लॉट विश्लेषण:
   – पचे हुए नमूनों का उपयोग करके विश्लेषण करें:
   – 6H4 या PRC1 एंटी-पीआरपी एंटीबॉडी।
   – एसडीएस-पेज करें और पता लगाने के लिए पीवीडीएफ झिल्ली में स्थानांतरित करें।

 

 

अधिक मजबूत परिणामों के लिए अधिक नमूने संसाधित करें

UIP400MTP मल्टी-वेल प्लेट सोनिकेटर प्रोटीन मिसफोल्डिंग चक्रीय प्रवर्धन (पीएमसीए) की दक्षता और मापनीयता को काफी बढ़ाता है, जो प्रक्रिया की पारंपरिक रूप से समय लेने वाली प्रकृति को संबोधित करता है। एक 96 अच्छी तरह से थाली में अप करने के लिए 96 नमूने के एक साथ प्रसंस्करण की अनुमति देकर, प्रणाली पीएमसीए वर्कफ़्लोज़ सुव्यवस्थित जबकि सभी कुओं भर में सटीक और वर्दी sonication की स्थिति को बनाए रखने. यह उच्च-थ्रूपुट क्षमता मैनुअल हैंडलिंग को कम करती है, श्रम-गहन चरणों को कम करती है, और प्रजनन क्षमता सुनिश्चित करती है, जिससे यह प्रियन अनुसंधान के लिए एक अनिवार्य उपकरण बन जाता है। चाहे पुरानी बर्बाद करने वाली बीमारी या क्रूट्सफेल्ड-जेकब रोग की जांच हो, UIP400MTP अधिक दक्षता के साथ बड़े पैमाने पर अध्ययन की सुविधा प्रदान करता है, जिससे शोधकर्ताओं को आधुनिक नैदानिक और वैज्ञानिक अनुप्रयोगों की मांगों को पूरा करने में सक्षम बनाया जा सकता है।

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