Production par ultrasons de bêta-glucanes de schizophyllane hautement purifiés

Le schizophyllane est un β-glucane fongique aux propriétés immunomodulatrices. Pour obtenir des effets médicinaux hautement actifs, le schizophyllane doit avoir un faible poids moléculaire afin de présenter une meilleure biodisponibilité. Il a été prouvé que la sonication réduit le poids moléculaire du schizophyllane. En tant que méthode fiable et efficace, la sonication peut être facilement appliquée à la production de schizophyllane de faible poids moléculaire.

Champignons Schizophyllum et extraction des bêta-glucanes par ultrasons

Les espèces du champignon Schizophyllum poussent dans la nature sur des arbres en décomposition après les saisons des pluies. Les fructifications sont récoltées pendant la saison sèche suivante. Les espèces de Schizophyllum sont riches en composés biochimiques tels que les glucanes et sont donc consommées, en particulier dans les pays tropicaux, comme aliment et comme médicament. En raison de ses propriétés immunomodulatrices, antifongiques, antinéoplasiques et antivirales, Schizophyllum commune, également connu sous le nom de schizophylle commun (Splitgill mushroom), a attiré l’attention des entreprises de biotechnologie et de l’industrie pharmaceutique.
Le polysaccharide schizophyllane, également connu sous les noms de sizofiran, sonifilan ou sizofilan, est le principal β-glucane présent dans les champignons Schizophyllum, qui fournissent le β-glucane bioactif hautement efficace qu’est le schizophyllane.
Les champignons Schizophyllum commune poussent dans la nature sur les arbres ; le mycélium peut également être cultivé dans un bouillon de fermentation. Pour les applications pharmaceutiques et cosmétiques, le schizophyllane de faible poids moléculaire est bien plus efficace que le schizophyllane de poids moléculaire élevé. Cela s’explique par le fait que le schizophyllane de faible poids moléculaire présente une biodisponibilité et des taux d’absorption nettement meilleurs. De plus, le schizophyllane de poids moléculaire élevé pose souvent problème dans les applications, car il entraîne une viscosité élevée de ses solutions aqueuses.
La réduction de taille par ultrasons est une technique très efficace et fiable pour abaisser le poids moléculaire du schizophyllane, améliorant ainsi la qualité de la molécule de β-glucane.

Protocole de production de schizophyllane de faible poids moléculaire

Étant donné que le schizophyllane de poids moléculaire présente une biodisponibilité et des propriétés d’application considérablement meilleures, l’équipe de recherche de Smirnou a étudié la sonication pour le clivage et la réduction de taille de la molécule de β-glucane schizophyllane.

Sonication du schizophyllane

Le β-1.3(1.6)-glucane schizophyllane (SPG) a été produit par culture submergée du champignon S. commune en bioréacteur, avec du saccharose comme substrat.
À la fin de la culture, le bouillon de culture a été dilué avec de l’eau déminéralisée jusqu’à une concentration en schizophyllane de 2 g/L, puis soniqué à l’aide du processeur à ultrasons UIP2000hdT (Hielscher Ultrasonics GmbH, Allemagne) en mode recirculation, avec les paramètres et conditions suivants : débit du milieu 50 mL/s, fréquence 20 kHz, puissance 2000 W, sonotrode de type BS2d22, booster de type B2-1.4 et amplitude 100%. La température du bouillon de culture au début de la sonication était de 25°C. Le bouillon de culture soniqué (apport d’énergie spécifique 100 Ws/mL) a été filtré sur un filtre en profondeur Seitz HS800 sous une pression de 1,5 bar à 40°C. Le schizophyllane soniqué (uSPG) destiné à la caractérisation chimique a été précipité à partir du filtrat avec trois fois son volume d’alcool isopropylique à température ambiante de laboratoire, puis séché à 60°C pendant 12h. Les solutions d’uSPG destinées aux études immunologiques ont été préparées comme suit : (1) le filtrat du bouillon de culture soniqué a été diafiltré à travers une cassette PES Pall Centramate série T de 0,1m2 (seuil de coupure 100 kDa) à 0,8 bar, et la diafiltration a été poursuivie jusqu’à ce que la conductivité du rétentat atteigne 20 μS/cm ; (2) la solution a été concentrée par diafiltration jusqu’à une concentration en uSPG de 1 g/L et stérilisée par autoclavage à 120°C/20 min. L’uSPG dénaturé a été préparé de manière similaire, à ceci près que du NaOH a été ajouté au filtrat du bouillon de culture à une concentration de 0,2 M et que la solution alcalinisée a été incubée pendant 30 min à température ambiante de laboratoire avant la diafiltration.

Méthodes analytiques

Le rendement en mycélium a été estimé par gravimétrie : le bouillon de culture a été dilué avec de l’eau dans un rapport 1:4, centrifugé à 10 000 × g à 25°C pendant 20 min ; le précipité a été lavé avec trois fois son volume d’eau, séché à 60°C et pesé. Le schizophyllane a été précipité à partir du surnageant avec trois fois son volume d’alcool isopropylique, séché à 60°C pendant 24h, et son rendement a été déterminé par gravimétrie. La pO2 dans le bouillon de culture a été mesurée à l’aide de la sonde optique Hamilton-Visiferm DO 120 (Hamilton, Suisse).
La viscosité dynamique du bouillon de culture a été mesurée sur un HAAKE Visco Tester 6L avec les mobiles 1L et 2L à 4°C et à une vitesse de rotation de 30 tr/min. La vitesse de filtration a été calculée à partir du temps de filtration de 500 mL de bouillon de culture à travers un filtre en profondeur Seitz HS800 (Pall, USA) de 200 × 200 mm à une pression de 1,5 bar et à 40°C.
Le poids moléculaire de l’uSPG a été mesuré par SEC-MALLS sur un système HPLC Alliance (Waters) avec des colonnes PL aquagel OH60 et PL aquagel OH40 connectées en série, et le détecteur miniDAWN TREOS (Wyatt) a été concentré par diafiltration jusqu’à une concentration en uSPG de 1 g/L et stérilisé par autoclavage à 120°C/20 min. L’uSPG dénaturé a été préparé de manière similaire, à ceci près que du NaOH a été ajouté au filtrat du bouillon de culture à une concentration de 0,2 M et que la solution alcalinisée a été incubée pendant 30 min à température ambiante de laboratoire avant la diafiltration.

Résultats :
Le traitement par sonication a été appliqué directement au bouillon de culture de S. commune de 144 h contenant le mycélium, afin de faciliter le traitement en aval du SPG.

Caractéristiques du schizophyllane soniqué : Le schizophyllane soniqué (uSPG) a été précipité à l’alcool à partir du filtrat du bouillon de culture, puis caractérisé. La SEC-MALLS a estimé la Mw de l’uSPG à environ 1 MDa. Le poids moléculaire moyen du schizophyllane issu de fermentation liquide est d’environ 5 MDa, tandis qu’en culture à l’état solide il peut atteindre jusqu’à 10 MDa. En comparant le poids moléculaire du schizophyllane soniqué aux poids moléculaires du schizophyllane natif non traité, on observe une réduction du poids moléculaire d’un facteur 5 à 10 due à la sonication.
Le polysaccharide soniqué uSPG contenait 0,7%w/w de protéines et 1,0%w/w de résidu après calcination. L’hydrolysat d’uSPG était constitué de glucose à plus de 99%. Les résultats analytiques indiquent que la sonication clive la chaîne principale du β-glucane de manière aléatoire, tandis que les ramifications latérales restent intactes, réduisant ainsi la taille et le poids moléculaire du schizophyllane. Des études immunologiques sur de l’uSPG pratiquement exempt de protéines et d’endotoxines ont montré que le schizophyllane soniqué de faible Mw présente une activité immunomodulatrice prononcée.

 
Viscosité réduite : La sonication a entraîné une diminution significative de la viscosité du bouillon de culture. Pendant la sonication, la viscosité du bouillon de culture a évolué de façon non linéaire : la diminution de viscosité était rapide au début de la sonication, puis elle a ralenti. Un apport d’énergie spécifique de 100 Ws/mL a suffi pour réduire la viscosité du bouillon de culture de près de 7 fois.

Filtration améliorée : Le bouillon de culture traité par ultrasons a traversé le filtre plus rapidement que le bouillon de culture non traité (apport d’énergie spécifique 0 Ws/mL) contenant du SPG de haut poids moléculaire. En outre, la sonication a considérablement réduit les pertes de produit lors de la filtration. Le filtrat du bouillon de culture non traité contenant du SPG de haut poids moléculaire (apport d’énergie spécifique 0 Ws/mL) contenait 0,3 ± 0,07 g/L de SPG, alors que la concentration en SPG avant la filtration en profondeur était de 2 g/L. En revanche, le filtrat du bouillon de culture soniqué à 100 Ws/mL contenait du SPG à une concentration de 2,2 ± 0,2 g/L, ce qui correspond à une perte de produit quasi nulle.

Conclusion : Dans sa conclusion, l’équipe de recherche résume que le traitement par ultrasons est une technologie efficace pour la fabrication de schizophyllane de faible poids moléculaire, qui peut ensuite être utilisé en cosmétique et en médecine. La sonication, lorsqu’elle est appliquée au bouillon de culture complet contenant le mycélium, apporte certains avantages à la production de schizophyllane. Elle réduit les pertes de produit lors du traitement en aval et rend possible la production de polysaccharide hautement purifié grâce à une utilisation efficace de l’ultrafiltration.
En outre, les chercheurs ont constaté que le traitement du schizophyllane par ultrasons est facilement transposable à plus grande échelle. Une unité du désintégrateur à ultrasons d’installation pilote UIP2000hdT a traité 1 litre de bouillon de culture en 110 s en mode continu. La productivité du système peut être facilement augmentée par le raccordement en série d’unités à ultrasons supplémentaires.

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Équipements à ultrasons haute performance pour le traitement des glucanes fongiques

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