Production ultrasonique de bêta-glucanes schizophyllaniques hautement purifiés

Le schizophyllan est un β-glucane fongique aux propriétés immunomodulatrices. Pour obtenir des effets médicinaux hautement actifs, le schizophyllan doit avoir un faible poids moléculaire afin d'améliorer sa biodisponibilité. Il a été prouvé que les ultrasons réduisent le poids moléculaire du schizophyllan. En tant que méthode fiable et efficace, la sonication peut être facilement appliquée à la production de schizophyllan de faible poids moléculaire.

Champignons Schizophyllum et extraction ultrasonique de bêta-glucane

Le champignon Schizophyllum commune contient le β-glucan schizpphyllan, également connu sous le nom de Sizofiran, SPG, Sonifilan, Sizofilan, etc.Les espèces de champignons Schizophyllum poussent dans la nature sur des arbres en décomposition après la saison des pluies. Les fruits sont récoltés au cours de la saison sèche suivante. Les espèces de Schizophyllum sont riches en composés biochimiques tels que les glucanes et sont donc consommées, en particulier dans les pays tropicaux, en tant qu'aliments et médicaments. En raison de ses propriétés immunomodulatrices, antifongiques, antinéoplasiques et antivirales, Schizophyllum commune, également connu sous le nom de champignon Splitgill, a attiré les entreprises biotechnologiques et pharmaceutiques.
Le polysaccharide schizophyllan, également connu sous le nom de sizofiran, sonifilan ou sizofilan, est le principal β-glucane présent dans les champignons Schizophyllum, qui offrent le β-glucane schizophyllan bioactif hautement efficace.
Les champignons Schizophyllum commune poussent dans la nature sur les arbres, le mycellium peut également être cultivé dans un bouillon de fermentation. Pour les applications pharmaceutiques et cosmétiques, le schizophyllan de faible poids moléculaire est beaucoup plus efficace que le schizophyllan de poids moléculaire élevé. En effet, le schizophyllan de faible poids moléculaire présente une biodisponibilité et des taux d'absorption nettement supérieurs. En outre, le schizophyllan de poids moléculaire élevé est souvent problématique dans les applications car il entraîne une viscosité élevée de ses solutions aqueuses.
La réduction de la taille par ultrasons est une technique très efficace et fiable pour abaisser le poids moléculaire du schizophyllan, augmentant ainsi la qualité de la molécule de β-glucan.

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Processeur ultrasonique UIP2000hdT pour la réduction de la taille du schizophyllan (sizofiran, SPG, sonifilan, sizofilan).

L'appareil à ultrasons UIP2000hdT a été utilisé avec succès pour réduire le poids moléculaire du schizophyllan, un β-glucane fongique.

Protocole pour la production de schizophyllan de faible poids moléculaire

Étant donné que le schizophyllan de poids moléculaire présente une biodisponibilité et des propriétés d'application nettement meilleures, l'équipe de recherche de Smirnou a étudié l'ultrasonication pour le clivage et la réduction de la taille de la molécule de β-glucane schizophyllan.

Ultrasonication de Schizophyllan

Le β-1.3(1.6)-glucane schizophyllan (SPG) a été produit par culture submergée du champignon S. commune dans un bioréacteur utilisant du saccharose comme substrat.
Après la fin de la culture, le bouillon de culture a été dilué avec de l'eau déminéralisée jusqu'à une concentration de schizophyllan de 2 g/L et a été soumis à des ultrasons avec l'appareil Processeur à ultrasons UIP2000hdT (Hielscher Ultrasonics GmbH, Allemagne) en mode recyclage selon les paramètres et conditions suivants : débit du milieu 50 ml/s, fréquence 20 kHz, puissance 2000 W, sonotrode de type BS2d22, booster de type B2-1.4 et amplitude 100%. La température du bouillon de culture au début de la sonication était de 25°C. Le bouillon de culture ultrasonisé (apport d'énergie spécifique de 100 Ws/mL) a été filtré à travers un filtre en profondeur Seitz HS800 sous une pression de 1,5 bar à 40°C. Le schizophyllan ultrasonique (uSPG) pour la caractérisation chimique a été précipité du filtrat avec une triple quantité d'alcool isopropylique à la température du laboratoire, et séché à 60°C pendant 12h. Les solutions uSPG pour les études immunologiques ont été préparées comme suit : (1) le filtrat de bouillon de culture ultrasonisé a été diafiltré à travers une cassette PES Pall Centramate série T de 0,1 m2 (seuil de coupure de 100 kDa) à 0,8 bar et la diafiltration s'est poursuivie jusqu'à ce que la conductivité du rétentat soit de 20 μS/cm ; (2) la solution a été concentrée par diafiltration à une concentration d'uSPG de 1 g/L et stérilisée à l'autoclave à 120°C/20 min. L'uSPG dénaturé a été préparé de manière similaire, sauf que NaOH a été ajouté au filtrat du bouillon de culture à une concentration de 0,2 M et que la solution alcalinisée a été incubée pendant 30 minutes à la température du laboratoire avant d'être diafiltrée.

Méthodes d'analyse

Le rendement en mycélium a été estimé par gravimétrie : le bouillon de culture a été dilué avec de l'eau 1:4, centrifugé à 10000 × g à 25°C pendant 20 minutes, le précipité a été lavé avec une triple quantité d'eau, séché à 60°C et pesé. Le schizophyllan a été précipité à partir du surnageant avec une triple quantité d'alcool isopropylique, séché à 60°C pendant 24h et son rendement a été déterminé par gravimétrie. La pO2 dans le bouillon de culture a été mesurée par une sonde optique Hamilton-Visiferm DO 120 (Hamilton, Suisse).
La viscosité dynamique du bouillon de culture a été mesurée sur un testeur HAAKE Visco 6L avec des fuseaux 1L et 2L à 4°C et une vitesse de rotation de 30 rpm. La vitesse de filtration a été calculée à partir du temps de filtration de 500 ml de bouillon de culture à travers un filtre en profondeur Seitz HS800 (Pall, USA) de 200 × 200 mm à une pression de 1,5 bar et à 40°C.
Le poids moléculaire de l'uSPG a été mesuré par SEC-MALLS sur le système HPLC Alliance (Waters) avec des colonnes PL aquagel OH60 et PL aquagel OH40 connectées en série, et le détecteur miniDAWN TREOS (Wyatt) a été concentré par diafiltration à une concentration d'uSPG de 1 g/L et stérilisé à l'autoclave à 120°C/20 min. L'uSPG dénaturée a été préparée de manière similaire, sauf que NaOH a été ajouté au filtrat du bouillon de culture à une concentration de 0,2 M et que la solution alcalinisée a été incubée pendant 30 minutes à la température du laboratoire avant d'être diafiltrée.

Réduction ultrasonique du poids moléculaire du β-glucane schizophyllan fongique (Sizofiran, SPG, Sonifilan, Sizofilan)

UIP2000hdT pour la réduction du poids moléculaire du schizophyllan


L'ultrasonication est une méthode très efficace pour la production de schizophyllan de faible poids moléculaire de qualité pharmaceutique.

ultrasonateur UP400St (400W, 24kHz) pour la transformation du schizophyllan

Résultats :
Le traitement par ultrasons a été appliqué directement au bouillon de culture 144-h de S. commune avec mycélium pour faciliter le traitement en aval du SPG.
 
Caractéristiques du schizophyllan sonique : Le schizophyllan ultrasonique (uSPG) a été précipité dans le filtrat du bouillon de culture à l'aide d'alcool et caractérisé. Le SEC-MALLS a estimé que la masse moléculaire de l'uSPG était d'environ 1 MDa. Le poids moléculaire moyen du schizophyllan issu de la fermentation liquide est d'environ 5 MDa, alors qu'il peut atteindre jusqu'à 10 MDa dans le cas de la culture à l'état solide. Si l'on compare le poids moléculaire du schizophyllan traité par ultrasons avec celui du schizophyllan natif non traité, on observe une réduction de 5 à 10 fois du poids moléculaire due aux ultrasons.
Le polysaccharide uSPG sonifié contenait 0,7 % p/p de protéines et 1,0 % p/p de résidus après ignition. L'hydrolysat uSPG était composé de glucose à plus de 99 %. Les résultats analytiques indiquent que la sonication clive le squelette du β-glucane de manière aléatoire et que les branches latérales restent intactes, réduisant ainsi la taille et le poids moléculaire du schizophyllan. Des études immunologiques sur des uSPG essentiellement exempts de protéines et d'endotoxines ont montré que le schizophyllan ultrasonique de faible poids moléculaire a une activité immunomodulatrice prononcée.

L'ultrasonication est appliquée avec succès pour réduire le poids moléculaire du schizophyllan en clivant la molécule par cavitation acoustique.

Imagerie AFM (en haut) et profil topographique (en bas) du schizophyllan natif ultrasonique. Mesure en mode semi-contact avec une résolution de 512 × 512 pxs2. Conditions : revêtement en or, constante de ressort de 15,3 N/m, angle du cône de la pointe <22°.r/>(picture and study: ©Smirnou et al., 2017)

 
Viscosité réduite : L'ultrasonication a entraîné une diminution significative de la viscosité du bouillon de culture. Au cours de l'ultrasonication, la viscosité du bouillon de culture a évolué de manière non linéaire : la diminution de la viscosité a été rapide au début de l'ultrasonication, mais elle s'est ralentie par la suite. L'apport d'énergie spécifique de 100 Ws/mL était suffisant pour réduire la viscosité du bouillon de culture de près de 7 fois.

L'ultrasonateur UIP2000hdT est utilisé pour réduire efficacement la taille du composé fongique schizophyllan.

Ultrasonication du bouillon de culture de S.commune, qui a été obtenu par la culture du champignon dans le bioréacteur pendant 144h. Effet de la période d'ultrasonication (exprimée en énergie spécifique en Ws/mL) sur la vitesse de filtration en profondeur du bouillon de culture (colonne noire), et sur la concentration en schizophyllan (SPG) dans le filtrat (colonne grise). Conditions d'ultrasonication : Processeur à ultrasons UIP2000hd (20 kHz, 2000W)sonotrode BS2d22, booster B2-1.4, amplitude 100%, débit 50 mL/s.
(image et étude : ©Smirnou et al., 2017)

Filtration améliorée : Le bouillon de culture traité par ultrasons a traversé le filtre plus rapidement que le bouillon de culture non traité (apport d'énergie spécifique de 0 Ws/mL) avec un SPG à haut poids moléculaire. En outre, l'ultrasonication a réduit de manière significative la perte de produit pendant la filtration. Le filtrat du bouillon de culture non traité avec du SPG à haut poids moléculaire (apport d'énergie spécifique de 0 Ws/mL) contenait 0,3 ± 0,07 g/L de SPG, alors que la concentration de SPG avant la filtration en profondeur était de 2 g/L. En revanche, le filtrat de la culture ultrasonique à 100 Ws/mL contenait du SPG à une concentration de 2,2 ± 0,2 g/L, ce qui correspond à une perte de produit presque nulle.

La sonication améliore considérablement le shizophyllan.

Ultrasonication du bouillon de culture de S.commune, qui a été obtenu par la culture du champignon dans le bioréacteur pendant 144h. Effet de la période d'ultrasonication (exprimée en énergie spécifique en Ws/mL) sur la vitesse de filtration en profondeur du bouillon de culture (colonne noire), et sur la concentration en schizophyllan (SPG) dans le filtrat (colonne grise). Conditions d'ultrasonication : Processeur à ultrasons UIP2000hd (20 kHz, 2000W)sonotrode BS2d22, booster B2-1.4, amplitude 100%, débit 50 mL/s.
(image et étude : ©Smirnou et al., 2017)

L'ultrasonication est utilisée pour réduire le poids moléculaire du schizophyllan, un composé bioactif dérivé des champignons.

Imagerie AFM (en haut) et profil topographique (en bas) du schizophyllan dénaturé et traité par ultrasons. Mesure en mode semi-contact avec une résolution de 512 × 512 pxs2. Conditions : revêtement en or, constante du ressort 15,3 N/m, angle du cône de la pointe < 22°.
(image et étude : ©Smirnou et al., 2017)

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Conclusion : Dans sa conclusion, l'équipe de recherche affirme que le traitement ultrasonique est une technologie efficace pour la fabrication de schizophyllan à faible poids moléculaire, qui peut ensuite être utilisé en cosmétique et en médecine. L'ultrasonication, lorsqu'elle est appliquée à un bouillon de culture complet avec mycélium, apporte certains avantages à la production de schizophyllan. Elle réduit les pertes de produit au cours du traitement en aval et permet la production de polysaccharides hautement purifiés grâce à l'utilisation efficace de l'ultrafiltration.
En outre, les chercheurs ont constaté que le traitement ultrasonique du schizophyllan est facilement extensible. Une unité du désintégrateur ultrasonique UIP2000hdT de l'installation pilote a traité 1 litre de bouillon de culture en 110 s en mode flux. La productivité du système peut être facilement augmentée par la connexion séquentielle d'unités ultrasoniques supplémentaires.

 
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Équipement ultrasonique haute performance pour le traitement des glucanes fongiques

L'UIP4000hdT est un mélangeur ultrasonique en ligne d'une puissance de 4000 watts.La fragmentation des polysaccharides tels que les glucanes et d'autres composés bioactifs comme la chitine et le chitosane peut être réalisée de manière fiable avec l'équipement ultrasonique haute performance de Hielscher. Nos appareils à ultrasons peuvent fournir des amplitudes élevées, offrent un contrôle précis des paramètres du processus et peuvent fonctionner 24 heures sur 24, 7 jours sur 7, sous forte charge et dans des environnements exigeants. La gamme d'équipements Hielscher Ultrasonics répond de manière fiable à ces exigences. Outre leurs performances exceptionnelles en matière d'ultrasons, les ultrasons Hielscher offrent un rendement énergétique élevé, ce qui constitue un avantage économique considérable. – surtout lorsqu'ils sont utilisés dans le cadre d'une production commerciale à grande échelle.
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Le tableau ci-dessous vous donne une indication de la capacité de traitement approximative de nos ultrasons :

Volume du lotdébitDispositifs recommandés
1 à 500mL10 à 200mL/minUP100H
10 à 2000mL20 à 400mL/minUP200Ht, UP400ST
0.1 à 20L0.2 à 4L/minUIP2000hdT
10 à 100L2 à 10L/minUIP4000hdt
n.d.10 à 100L/minUIP16000
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Littérature / Références

Qu'il faut savoir

Schizophyllan – Un β-Glucan fongique

Le schizophyllan, également connu sous le nom de sizofiran, SPG, sonifilan, sizofilan, est un polysaccharide extracellulaire neutre produit par le champignon Schizophyllum commune Fries, une espèce de champignon Basidiomycetes. Le schizophyllan est un bêta-D-glucane soluble dont le mécanisme d'action exact n'est pas encore totalement élucidé, mais ce β-glucane spécifique présente des effets immunomodulateurs et antitumoraux. Bien que le mécanisme d'action exact du sizofiran ne soit pas encore totalement élucidé, cet agent semble stimuler le système immunitaire en augmentant la production de cytokines, en activant les macrophages et les cellules de Langerhans et en renforçant l'activité des leucocytes polymorphonucléaires (PML) et des cellules tueuses naturelles (NK). Le sizofiran s'est avéré plutôt inefficace contre le cancer gastrique, mais a prolongé la durée de survie des patients atteints d'un cancer de la tête et du cou. Dans le cas du cancer du col de l'utérus, le sizofiran a prolongé la survie et le délai avant la récidive pour les cas de stade II, mais pas pour ceux de stade III, et s'est révélé plus efficace lorsqu'il était injecté directement dans la masse tumorale. Sonifilan est utilisé comme modificateur de la réponse biologique (BRM) avec la radiothérapie pour le traitement du cancer au Japon. Il a été lancé en Corée du Sud en 1998 pour le traitement du cancer du col de l'utérus.


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