Sonication de microplaques en protéomique « shotgun » – Note d'application
La protéomique de type « shotgun » repose sur une préparation efficace et reproductible des échantillons afin de transformer des matériaux biologiques complexes en peptides prêts pour la LC-MS/MS. Le sonicateur pour microplaques UIP400MTP facilite ce processus en permettant une sonication standardisée et parallèle d’échantillons de petit volume, aidant ainsi les laboratoires à améliorer la désintégration, l’extraction et la resolubilisation dans les flux de travail basés sur des microplaques. Cette note d'application décrit comment l'UIP400MTP peut être intégré à la préparation d'échantillons protéomiques, en s'appuyant sur un flux de travail publié concernant les vésicules extracellulaires issu d'études sur PLA2G12A/Th17, utilisé ici comme exemple testé en laboratoire.
Sonication sur microplaques pour une protéomique « shotgun » plus reproductible
Pour les chercheurs en protéomique, une préparation reproductible des échantillons est essentielle pour obtenir des données LC-MS/MS de haute qualité. Le sonicateur de microplaques UIP400MTP permet une sonication standardisée et parallèle dans le cadre de flux de travail sur microplaques et à petit volume/haut débit.
Il est particulièrement utile pour les laboratoires qui travaillent dans les domaines suivants :
- Ensembles d'échantillons volumineux nécessitant un traitement homogène dans de nombreux puits
- Matériau à apport limité, pour lequel la perte d'échantillon et la variabilité doivent être réduites au minimum
- Échantillons riches en lipides, tels que les vésicules extracellulaires
- Préparations biologiques complexes nécessitant une désintégration, une extraction ou une resolubilisation efficaces
- Protéomique comparative de type « shotgun », où la reproductibilité entre les conditions et les réplicats est essentielle
En intégrant une sonication sur microplaques avant la digestion, les chercheurs peuvent améliorer la préparation des échantillons en vue :
- Extraction et resolubilisation des protéines
- Trypsin/Lys-C digestion
- Acquisition par nano-LC/MS/MS
- Analyse protéomique quantitative en aval
Découvrez comment la sonication sur microplaques permet de réduire la variabilité liée aux opérations manuelles, d'améliorer la désintégration des échantillons et de préparer des échantillons biologiques complexes en vue d'une analyse LC-MS/MS fiable.
La sonication sur microplaques peut présenter les avantages suivants :
- Infrastructures centrales de protéomique
- Laboratoires de recherche sur les véhicules électriques
- Laboratoires d'immunologie et de biologie cellulaire
- Groupes de recherche translationnelle
- Équipes du secteur des sciences de la vie passant de la préparation d'échantillons individuels à des flux de travail à haut débit
The UIP400MTP is not an ultrasonic bath. It'a a high intensity cup horn for focused sonication. This powerful non-contact sonicator delivers a uniform sonication across all wells of your standard well-plate. You have precise control over amplitude, power, and pulsing. A built-in timer and temperature probe ensures consistent results. The UIP400MTP plate sonicator cools samples with water bath (external chiller optional).
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Préparation d'échantillons à haut débit pour l'analyse du protéome des vésicules extracellulaires
Qu'est-ce que la protéomique « shotgun » ?
La protéomique de type « shotgun » est devenue une stratégie analytique centrale pour la caractérisation d’échantillons biologiques complexes, allant des lysats cellulaires entiers et des extraits tissulaires aux organites purifiés, en passant par les vésicules extracellulaires et les échantillons cliniques à faible volume. Sa force principale réside dans la combinaison de la digestion des protéines, de la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem à haute résolution et de l’inférence informatique des peptides en protéines. Cependant, la qualité de l’ensemble de données protéomiques final est déterminée bien avant que l’échantillon n’atteigne le spectromètre de masse. Une désintégration efficace de l’échantillon, la solubilisation des protéines, l’élimination des substances interférentes, une digestion enzymatique reproductible et une récupération robuste des peptides sont autant de facteurs décisifs pour la profondeur de couverture et la fiabilité quantitative.
Pour les chercheurs en protéomique et les laboratoires des sciences de la vie qui travaillent avec des échantillons limités ou précieux, la préparation des échantillons constitue souvent un goulot d'étranglement.
L'UIP400MTP garantit une préparation fiable des échantillons et une intégration facile dans les flux de travail des laboratoires existants.
Le défi posé par les vésicules extracellulaires en protéomique
Les vésicules extracellulaires (VE), par exemple, constituent une catégorie d’échantillons particulièrement exigeante. Il s’agit de particules nanométriques, délimitées par une membrane et riches en lipides, qui présentent un rendement protéique relativement faible et un risque élevé de contamination par des lipides, des sels, des détergents, des protéines sériques et d’autres composants de la matrice. Ces caractéristiques peuvent nuire à l’efficacité de la digestion, aux performances chromatographiques, à la stabilité lors de l’électrospray et à l’identification des peptides. Un protocole de préparation pour la protéomique des VE doit donc être suffisamment puissant pour rompre les structures vésiculaires et solubiliser la charge protéique, tout en restant compatible avec la digestion enzymatique en aval et l’analyse par LC-MS/MS.
Dans ce contexte, la sonication compatible avec les microplaques offre une approche pratique pour un traitement reproductible et parallélisé des échantillons. Les modèles de soniqueurs pour microplaques Hielscher UIP400MTP (400 W) et UIP550MTP (550 W) sont conçus pour la sonication d’échantillons dans des plaques multipuits et des récipients de petit volume, permettant ainsi des flux de travail à plus haut débit que les soniqueurs à sonde unique classiques. Pour les laboratoires de protéomique, ce format est particulièrement intéressant car il permet de réduire la variabilité liée à l’intervention manuelle, d’améliorer le traitement en parallèle de plusieurs échantillons et de s’intégrer plus naturellement dans les chaînes de préparation d’échantillons basées sur des plaques.
Exemple de flux de travail
Une récente procédure de protéomique des vésicules extracellulaires appliquée à la biologie des cellules Th17 induites par la PLA2G12A offre un exemple utile et validé en laboratoire de la manière dont le sonicateur pour microplaques UIP400MTP peut être intégré à la préparation d’échantillons pour la protéomique de type « shotgun ». Dans cette série d’études, les échantillons de vésicules extracellulaires (VE) ont été traités en vue d’une analyse protéomique selon les étapes suivantes : traitement au méthanol, sonication avec l’UIP400MTP, centrifugation, séchage, digestion par la trypsine et la Lys-C, puis analyse par chromatographie liquide à nano-débit (LC) couplée à une spectrométrie de masse en tandem à haute résolution. Ces travaux biologiques ont d’abord été présentés sous forme de prépublication sur bioRxiv, puis publiés dans *Cell Reports*, où l’analyse protéomique a permis de caractériser la manière dont la PLA2G12A modifie les protéines contenues dans les VE dans le contexte des réponses pathogènes des lymphocytes T.
Sonicateur UIP400MTP pour plaques à 96 puits, destiné à l'extraction de protéines à haut débit
Sonicateur : Sonicateur pour microplaques UIP400MTP
Données d'entrée : 5 µg d'équivalent protéique EV
Digestion: Trypsine/Lys-C
Résultats : Protéomique par nano-LC-MS/MS / DIA
Instructions étape par étape : Préparation d'échantillons de véhicules électriques à l'aide de l'UIP400MTP pour la protéomique de type « shotgun »
Ce protocole décrit une méthode de préparation d'échantillons pour la protéomique « shotgun » des vésicules extracellulaires (EV) nécessitant un faible volume d'échantillon, utilisant le sonicateur pour microplaques UIP400MTP. Il s'appuie sur un protocole de protéomique des VE déjà publié, dans lequel les échantillons de VE ont été normalisés, séchés, traités au méthanol, soniqués, digérés par la trypsine/Lys-C, acidifiés, puis analysés par nano-LC-MS/MS.
Cette procédure est destinée aux chercheurs en protéomique et aux laboratoires des sciences de la vie qui préparent des VE ou d'autres échantillons biologiques de faible volume et riches en lipides en vue d'une protéomique « shotgun » de type « bottom-up ».
Présentation du flux de travail
| Scène | Objectif | Résultat clé |
|---|---|---|
| Préparation du véhicule électrique | Isoler, laver et quantifier les échantillons d'EV | Entrée EV normalisée |
| Séchage des échantillons | Éliminer le liquide avant le traitement assisté par solvant | Matériau EV séché |
| Traitement au méthanol | Favoriser la désintégration du contenu des EV riches en lipides | Échantillon imprégné de méthanol |
| Sonication avec l'UIP400MTP | Favoriser la désagrégation, l'extraction et l'homogénéisation | Échantillon d'EV traité |
| digestion | Générer des peptides à partir de protéines issues d'EV | Digestion peptidique par la trypsine et la Lys-C |
| Analyse LC-MS/MS | Séparer, détecter et quantifier les peptides | Ensemble de données protéomiques |
| Analyse des données | Identifier et quantifier les peptides et les protéines | Résultats au niveau des protéines |
Protocole étape par étape
| étape | Instructions | Paramètres critiques |
|---|---|---|
| 1 | Préparez des échantillons d'EV purifiés en suivant la procédure d'isolement établie par le laboratoire. | Éliminer les cellules, les débris et les principaux contaminants avant la préparation protéomique. |
| 2 | Quantifier la teneur en protéines EV, par exemple à l'aide du test BCA. | Normaliser tous les échantillons pour qu'ils correspondent à un apport équivalent en protéines. |
| 3 | Transférer l'équivalent de 5 µg de protéine EV dans des tubes PCR propres ou dans des tubes de faible volume compatibles. | Utilisez des tubes à faible adhérence lorsque la perte d'échantillon est un risque. |
| 4 | Séchez complètement les échantillons EV. | Évitez toute surchauffe ; assurez-vous qu’il ne reste plus aucune trace de liquide. |
| 5 | Ajouter 25 µL de méthanol à chaque échantillon d'EV séché. | Veillez à ce que le matériau sec soit entièrement imbibé. |
| 6 | Soumettez les échantillons à une sonication pendant 3 minutes à l'aide du sonicateur pour microplaques UIP400MTP. | Utilisez les mêmes paramètres de sonication et la même logique de disposition pour tous les échantillons. |
| 7 | Centrifuger les échantillons traités par ultrasons à 19 000 × g pendant 20 minutes à 4 °C. | Évitez de remuer les agglomérats ou les matières insolubles après la centrifugation. |
| 8 | Prélevez avec précaution 20 µL du surnageant. | Utilisez une technique de pipetage uniforme pour tous les échantillons. |
| 9 | Séchez complètement le reste de l'échantillon. | Procéder directement à la digestion ou conserver uniquement dans des conditions validées. |
| 10 | Ajouter 4 µL de solution de trypsine/Lys-C à 100 ng/µL dans une solution de bicarbonate d'ammonium 50 mM. | Préparez une solution enzymatique fraîche ou utilisez des aliquotes correctement conservées. |
| 11 | Soumettre brièvement à des ultrasons pour dissoudre les résidus protéiques séchés dans la solution de digestion. | Récupérez tout le liquide présent au fond du tube après la sonication. |
| 12 | Laisser digérer pendant 2 heures à 37 °C en agitant à 300 tr/min. | Veillez à bien fermer les bouchons pour éviter toute évaporation. |
| 13 | Ajouter 1 µL de TFA à 1,25 % pour acidifier le digestat. | L'acidification interrompt la digestion et prépare les peptides pour la LC-MS/MS. |
| 14 | Transférer le produit de digestion dans des flacons ou des plaques compatibles avec la LC-MS. | Évitez de transférer des débris insolubles. |
| 15 | Analyser par nano-LC-MS/MS. | Utilisez un volume d'injection, un gradient LC et des paramètres d'acquisition MS constants. |
| 16 | Traitez les données brutes à l'aide d'un logiciel de DIA, de DDA ou de protéomique ciblée, selon le cas. | Appliquer la base de données appropriée, la spécificité enzymatique, les paramètres de modification et les seuils FDR. |
sonicateur pour plaques multi-puits UIP400MTP
Pourquoi recourir à la sonication sur microplaques ?
L'UIP400MTP permet une sonication standardisée et parallèle d'échantillons de petit volume. Cette fonctionnalité s'avère utile lorsque la reproductibilité, un faible volume d'échantillon et un débit élevé d'échantillons sont des critères importants.
Utilisez n'importe quelle microplaque standard ! Préparation d'échantillons à haut débit avec l'UIP400MTP
Le protocole de protéomique des EV mentionné prévoyait un échantillon de départ équivalent à 5 µg de protéines, 25 µL de méthanol, 3 minutes de sonication avec l'UIP400MTP, une digestion par la trypsine et la Lys-C, une acidification au TFA et une analyse par nano-LC-MS/MS.
Étapes recommandées pour la LC-MS/MS et l'analyse des données
Après digestion et acidification, les échantillons peuvent être analysés par chromatographie liquide en phase inverse à nano-débit, couplée à une spectrométrie de masse en tandem à haute résolution. Dans le protocole publié, les peptides ont été séparés sur un système de nano-LC puis analysés par acquisition indépendante des données sur un spectromètre de masse Orbitrap.
| Scène | Recommandation | Objectif |
|---|---|---|
| Chargement des échantillons | Utilisez un piège C18 ou un dispositif équivalent de chargement de peptides. | Concentre les peptides et élimine les contaminants hautement polaires. |
| Séparation des peptides | Utiliser une chromatographie en phase inverse à nano-débit. | Améliore la séparation des peptides et la sensibilité de la spectrométrie de masse. |
| Acquisition de MS | Utilisez la DIA, la DDA ou la MS ciblée en fonction du protocole de l'étude. | Génère des données spectrales au niveau des peptides. |
| Recherche dans la base de données | Utilisez une base de données de référence adaptée à l'espèce concernée. | Permet l'identification des peptides et des protéines. |
| Contrôle FDR | Appliquer les seuils de taux de fausses découvertes pour les peptides et les protéines. | Permet de contrôler le niveau de confiance de l'identification. |
| Quantification | Exporter les tableaux d'abondance des peptides, des précurseurs et des protéines. | Permet d'effectuer des comparaisons statistiques entre des groupes. |
Liste de contrôle pour le contrôle qualité
- Vérifiez que la quantité de protéine EV équivalente est identique pour tous les échantillons.
- Utilisez des schémas de traitement des échantillons aléatoires ou équilibrés.
- Veillez à ce que le volume de méthanol, la durée de sonication, la durée de séchage et le volume de digestion restent constants.
- Surveiller le rendement en peptides et le nombre total de protéines identifiées.
- Vérifiez le taux de clivage manqué et la répartition de la longueur des peptides.
- Vérifier la forme des pics chromatographiques et la reproductibilité des temps de rétention.
- Prévoir des cases vides pour contrôler les reports.
- Utilisez des échantillons de contrôle qualité regroupés pour les études de plus grande envergure.
- Évaluer le coefficient de variation des réplicats.
- Utilisez l'analyse en composantes principales (ACP) ou des méthodes apparentées pour identifier les effets de lot ou les échantillons aberrants.
Recommandations relatives à la rédaction des procès-verbaux
Lors de la publication ou de la documentation de ce protocole, veuillez indiquer la quantité d’EV utilisée, le format de la plaque, le volume de méthanol, l’amplitude et la durée de sonication de l’UIP400MTP, les conditions de centrifugation, la méthode de séchage, le tampon de digestion, la concentration enzymatique, la durée de digestion, les conditions d’acidification, la plateforme LC-MS/MS, le mode d’acquisition, la version du logiciel, la base de données, le seuil FDR, la méthode de normalisation et le workflow statistique.
Tous les sonicateurs pour microplaques Hielscher enregistrent automatiquement les paramètres clés du processus, tels que l'amplitude, la durée de la sonication et la température, avec horodatage, sous forme de fichier CSV sur la carte SD intégrée. La consignation des données à des fins de reproductibilité et de contrôle qualité n'a jamais été aussi simple !
Pour la protéomique DIA, utilisez des paramètres d'acquisition uniformes pour tous les échantillons et incluez, dans la mesure du possible, des échantillons de contrôle qualité regroupés. Surveillez le nombre de précurseurs, la stabilité du temps de rétention et la variabilité entre les réplicats.
Ce protocole est un exemple validé en laboratoire pour la protéomique des véhicules électriques. Pour d'autres types d'échantillons, il convient d'optimiser la quantité d'échantillon, les conditions de solvant, la durée de sonication, le volume de digestion et la stratégie d'injection en LC-MS/MS avant de passer à une étude à grande échelle.
L'étude en détail : protéomique par EV Shotgun dans l'étude sur le gène PLA2G12A
L'étude sur la PLA2G12A fournit un exemple concret de l'utilisation de l'UIP400MTP dans un protocole de protéomique de type « shotgun ». La question biologique posée était de savoir comment la phospholipase sécrétée PLA2G12A modifie les vésicules extracellulaires dérivées des cellules Th17 et influence ainsi la différenciation des lymphocytes T pathogènes. Les auteurs ont montré que la PLA2G12A agit sur les membranes des VE pour produire des lysophospholipides, notamment la 1-oléoyl-lysophosphatidyléthanolamine, et que la signalisation en aval de l’acide lysophosphatidique via la LPA2 contribue à la différenciation des Th17. Au-delà de la signalisation lipidique, ces études ont également examiné le contenu des VE, notamment leur teneur en ARN et en protéines, faisant de la protéomique de type « shotgun » un élément important de la stratégie de caractérisation.
Dans le protocole de préparation des EV, les cellules Th17 ont été cultivées dans un milieu contenant du sérum fœtal bovin appauvri en exosomes. Les surnageants de culture ont d’abord été centrifugés pour éliminer les cellules, filtrés à travers un filtre de 0,22 µm, concentrés par ultrafiltration/ultracentrifugation, lavés, remis en suspension dans du PBS, puis quantifiés par dosage protéique BCA. Cette étape préliminaire de préparation des EV a permis de garantir qu’une quantité définie de matériel EV, équivalente en protéines, puisse être intégrée dans le processus de protéomique.
Pour l'analyse protéomique de type « shotgun », les auteurs ont utilisé des échantillons d'EV correspondant à 5 µg d'équivalents protéiques. Ces échantillons ont été séchés dans des tubes PCR, puis 25 µL de méthanol y ont été ajoutés. Les échantillons ont ensuite été soniqués pendant 3 minutes à l'aide du sonicateur de microplaques UIP400MTP. Après la sonication, les échantillons ont été centrifugés à 4 °C pendant 20 minutes à 19 000 × g. Après retrait de 20 µL de surnageant, les échantillons ont été centrifugés jusqu’à siccité. Les protéines ont ensuite été dissoutes par sonication dans 4 µL d’une solution de trypsine/Lys-C à 100 ng/µL dans du bicarbonate d’ammonium 50 mM. La digestion a été réalisée pendant 2 heures à 37 °C sous agitation à 300 tr/min. Le produit de digestion a été acidifié avec 1 µL d’acide trifluoroacétique à 1,25 % puis soumis à une chromatographie liquide à nano-débit couplée à une spectrométrie de masse en tandem à haute résolution.
Ce protocole met en évidence plusieurs principes utiles pour la protéomique des VE à faible apport. Premièrement, l’apport a été normalisé en équivalent protéique, ce qui est important lors de la comparaison de VE provenant de génotypes ou de traitements différents. Deuxièmement, l’utilisation de méthanol avant la sonication a favorisé la disruption et l’extraction tout en évitant les systèmes détergents susceptibles de compliquer la LC-MS/MS. Troisièmement, l’étape de sonication a été brève et standardisée, ce qui est compatible avec le traitement parallèle des échantillons. Quatrièmement, la digestion par la trypsine et la Lys-C a été réalisée dans un très petit volume, ce qui a permis de réduire la dilution et de favoriser la récupération des peptides à faible concentration. Enfin, le passage direct de la digestion à l’acidification puis à la LC-MS/MS a permis de minimiser les étapes de manipulation superflues.
La méthode LC-MS/MS en aval a utilisé une séparation en phase inverse à nano-débit couplée à un spectromètre de masse Orbitrap Q-Exactive HF. Les échantillons ont été piégés sur une précolonne C18, puis séparés sur une colonne analytique de 50 µm de diamètre intérieur à un débit de 200 nL/min et à 40 °C. Le gradient est passé d’une faible teneur en solvant organique à 35 % de solvant B en 60 minutes, suivi d’un lavage à forte teneur en solvant organique et d’un rééquilibrage. L’acquisition MS a été réalisée en mode ions positifs à l’aide d’une acquisition indépendante des données avec dissociation par collision à haute énergie. Les fichiers bruts DIA ont été analysés à l’aide du logiciel DIA-NN 1.8 avec une bibliothèque de spectres prédits in silico.
Extraction de protéines à haut débit avec le sonicateur de plaques à 96 puits UIP400MTP
Questions fréquemment posées
Qui tire le plus grand bénéfice de la sonication sur microplaques en protéomique « shotgun » ?
La sonication sur microplaques est particulièrement utile pour les laboratoires de protéomique traitant plusieurs échantillons en parallèle, notamment les plateformes communes, les groupes de recherche en protéomique, les laboratoires d'immunologie, les équipes de recherche translationnelle et les laboratoires des sciences de la vie qui s'orientent vers des flux de travail LC-MS/MS à haut débit. Elle s'avère particulièrement pertinente lorsque la reproductibilité d'un échantillon à l'autre est essentielle.
Pourquoi utiliser l'UIP400MTP plutôt qu'un sonicateur à sonde classique ?
Un sonicateur à sonde classique traite généralement les échantillons un par un et nécessite un nettoyage minutieux entre chaque échantillon afin de réduire les risques de contamination croisée. Les modèles de sonificateurs pour microplaques UIP400MTP et UIP550MTP prennent en charge la sonication en parallèle, que ce soit sur microplaques ou en petits volumes, ce qui permet de réduire les manipulations manuelles, d’améliorer la cohérence et de rationaliser la préparation de plusieurs échantillons. Ils s’intègrent également facilement dans des flux de travail automatisés.
Quelle est la place de la sonication dans le processus de protéomique de type « shotgun » ?
La sonication est généralement utilisée lors de la phase de préparation des échantillons précédant la digestion. Elle peut faciliter la désagrégation, l'extraction, l'homogénéisation et la resolubilisation avant la digestion enzymatique par la trypsine, la Lys-C ou un mélange de trypsine et de Lys-C.
De plus, la sonication peut également être utilisée pendant la digestion afin d'accélérer considérablement la digestion enzymatique des protéines. Découvrez le potentiel de la digestion protéique à haut débit par sonication pour un flux de travail protéomique rapide !
La sonication sur microplaques est-elle utile pour la protéomique des vésicules extracellulaires ?
Oui. Les vésicules extracellulaires sont des particules riches en lipides et entourées d'une membrane, dont le traitement de manière reproductible peut s'avérer difficile. Dans les études sur la PLA2G12A mentionnées, les échantillons de VE ont été traités au méthanol, soniqués à l'aide de l'UIP400MTP, séchés, digérés par la trypsine/Lys-C, puis analysés par nano-LC/MS/MS.
Quels types d'échantillons peuvent bénéficier de la sonication sur microplaques ?
La sonication sur microplaques peut s'avérer utile pour les lysats cellulaires, les fractions d'organites, les immunoprécipités, les agrégats protéiques, les échantillons riches en membranes, les vésicules extracellulaires et d'autres préparations biologiques de faible volume. Pour chaque type d'échantillon, il convient d'optimiser l'intensité et la durée de la sonication, les conditions de solvant, la quantité d'échantillon introduite et la stratégie de digestion.
La sonication remplace-t-elle la digestion enzymatique ?
Non. La sonication permet de préparer l'échantillon à la digestion en améliorant la désagrégation, l'extraction ou la resolubilisation. Une digestion protéolytique reste toutefois nécessaire pour générer les peptides requis par la protéomique « bottom-up » de type « shotgun ».
Découvrez-en davantage sur la digestion des protéines assistée par ultrasons dans les flux de travail protéomiques !
L'UIP400MTP est-il compatible avec la protéomique à faible quantité d'échantillon ?
Oui, le format de microplaque est particulièrement adapté aux protocoles de travail à petit volume, où la conservation des échantillons et la cohérence du traitement sont essentielles. Dans le protocole de travail sur les EV publié, la préparation protéomique a été réalisée à partir d'un échantillon de 5 µg d'équivalent protéique d'EV.
La sonication des microplaques peut-elle améliorer la reproductibilité ?
Les soniqueurs Hielscher favorisent la reproductibilité en appliquant des conditions de sonication standardisées à plusieurs échantillons. Cependant, d’autres facteurs, tels que l’isolement des cellules ou des EV, la normalisation des échantillons, l’efficacité de la digestion, la stabilité de la LC-MS/MS, le traitement des données et l’analyse statistique, contribuent également à la reproductibilité globale de la protéomique.
La sonication sur microplaques permet-elle d'améliorer la précision de l'identification des protéines ?
Cela peut contribuer à améliorer la profondeur d'identification lorsque la désagrégation ou la resolubilisation de l'échantillon constitue un facteur limitant. Cet effet dépend du type d'échantillon, de la composition chimique des protéines, de la stratégie de purification, des conditions de digestion et des performances de la méthode LC-MS/MS.
Quels aspects faut-il optimiser avant de mettre ce flux de travail en place de manière systématique ?
Les paramètres clés comprennent l'échantillon d'entrée, la composition du tampon ou du solvant, le format de la plaque, l'amplitude et la durée des ultrasons, les conditions de séchage, le volume de digestion, la concentration enzymatique, le temps d'incubation et le volume d'injection en LC-MS/MS. Il est recommandé de réaliser des essais pilotes avant d'appliquer ce protocole à une série expérimentale complète.
Ce workflow peut-il être utilisé avec la protéomique DIA ?
Oui. Le protocole EV mentionné faisait appel à une acquisition indépendante des données, suivie d'une analyse DIA-NN. La sonication des microplaques fait partie du processus de préparation des échantillons en amont et peut être intégrée aux méthodes DIA, DDA ou de protéomique ciblée.
Quels indicateurs de contrôle qualité faut-il surveiller ?
Les indicateurs de contrôle qualité recommandés comprennent le rendement en peptides, le nombre de peptides et de groupes protéiques identifiés, le taux de clivage manqué, la distribution de la longueur des peptides, la forme des pics chromatographiques, la stabilité du temps de rétention, le coefficient de variation des réplicats, le transfert de traces et la séparation des groupes biologiques par ACP ou des méthodes apparentées.
Quel est le principal avantage de l'intégration des modèles de sonicateurs pour microplaques UIP400MTP ou UIP550MTP dans la préparation d'échantillons pour la protéomique ?
Le principal avantage réside dans le traitement standardisé et en parallèle d'échantillons de faible volume. Cela permet aux laboratoires de réduire la variabilité liée aux opérations manuelles et de préparer de manière plus homogène des échantillons biologiques complexes en vue de leur digestion, de l'acquisition par LC-MS/MS et de l'analyse protéomique quantitative.
Les sonicateurs pour microplaques Hielscher s'intègrent parfaitement dans les flux de travail automatisés.
Littérature / Références
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet UIP550MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- Mochizuki-Ono C., Taketomi Y., Irie A., Kano K. et al. (2026): PLA2G12A-driven extracellular vesicle-lipid signaling amplifies pathogenic T cell responses in inflammatory diseases. Cell Reports 45, 2026.
- Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
- Lischnig A., Bergqvist M., Ochiya T., Lässer C. (2023): Corrigendum for “Quantitative Proteomics Identifies Proteins Enriched in Large and Small Extracellular Vesicles”. Molecular & Cellular Proteomics, 22; 2023.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.
Hielscher Ultrasonics fabrique des homogénéisateurs à ultrasons très performants à partir de laboratoires à taille industrielle.