Sonication en microplaque en protéomique shotgun – Note d’application

La protéomique shotgun repose sur une préparation d’échantillons efficace et reproductible pour convertir un matériel biologique complexe en peptides prêts pour la LC-MS/MS. Le sonicateur pour microplaques UIP400MTP soutient ce processus en permettant une sonication standardisée et parallèle d’échantillons de faible volume, aidant ainsi les laboratoires à améliorer la rupture, l’extraction et la resolubilisation dans les flux de travail sur microplaques. Cette note d’application décrit comment l’UIP400MTP peut être intégré à la préparation d’échantillons protéomiques, en prenant comme exemple éprouvé en laboratoire un flux de travail publié portant sur les vésicules extracellulaires, issu d’études PLA2G12A/Th17.

Sonication en microplaque pour une protéomique shotgun plus reproductible

Pour les chercheurs en protéomique, une préparation d’échantillons reproductible est essentielle à l’obtention de données LC-MS/MS de haute qualité. Le sonicateur pour microplaques UIP400MTP permet une sonication standardisée et parallèle dans les flux de travail sur plaques et à faible volume/haute cadence.

Il est particulièrement utile pour les laboratoires travaillant avec :

• De grandes séries d’échantillons nécessitant un traitement homogène dans de nombreux puits
• Du matériel en quantité limitée, pour lequel la perte d’échantillon et la variabilité doivent être réduites au minimum
• Des échantillons riches en lipides, tels que les vésicules extracellulaires
• Des préparations biologiques complexes nécessitant une rupture, une extraction ou une resolubilisation efficaces
• La protéomique shotgun comparative, où la reproductibilité entre conditions et entre réplicats est essentielle

En intégrant la sonication en microplaque avant la digestion, les chercheurs peuvent mieux préparer les échantillons pour :

• L’extraction et la resolubilisation des protéines
• La digestion trypsine/Lys-C
• L’acquisition nano-LC/MS/MS
• L’analyse protéomique quantitative en aval

La sonication en microplaque peut être bénéfique pour :

• Les plateformes de protéomique
• Les laboratoires de recherche sur les VE
• Les laboratoires d’immunologie et de biologie cellulaire
• Les groupes de recherche translationnelle
• Les équipes en sciences de la vie passant de la préparation d’échantillons individuels à des flux de travail à plus haute cadence

Préparation d’échantillons à haute cadence pour l’analyse du protéome des vésicules extracellulaires

Qu’est-ce que la protéomique shotgun ?

La protéomique shotgun est devenue une stratégie analytique centrale pour la caractérisation d’échantillons biologiques complexes, des lysats de cellules entières et extraits tissulaires aux organites purifiés, vésicules extracellulaires et échantillons cliniques en faible quantité. Sa principale force réside dans l’association de la digestion des protéines, de la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem à haute résolution et de l’inférence informatique des protéines à partir des peptides. Cependant, la qualité du jeu de données protéomiques final est déterminée bien avant que l’échantillon n’atteigne le spectromètre de masse. Une rupture efficace des échantillons, la solubilisation des protéines, l’élimination des substances interférentes, une digestion enzymatique reproductible et une récupération robuste des peptides sont tous déterminants pour la profondeur de couverture et la fiabilité quantitative.
Pour les chercheurs en protéomique et les laboratoires des sciences de la vie travaillant avec des échantillons limités ou précieux, la préparation des échantillons constitue souvent le goulot d’étranglement.

Le défi des vésicules extracellulaires en protéomique

Les vésicules extracellulaires (VE), par exemple, constituent une catégorie d’échantillons particulièrement exigeante. Il s’agit de particules nanométriques entourées d’une membrane et riches en lipides, présentant un rendement protéique relativement faible et un risque élevé d’entraînement de lipides, de sels, de détergents, de protéines sériques et d’autres composants de la matrice. Ces caractéristiques peuvent nuire à l’efficacité de la digestion, aux performances chromatographiques, à la stabilité de l’électronébulisation et à l’identification des peptides. Un flux de travail de préparation pour la protéomique des VE doit donc être suffisamment puissant pour rompre les structures vésiculaires et solubiliser le contenu protéique, tout en restant compatible avec la digestion enzymatique et l’analyse LC-MS/MS en aval.
Dans ce contexte, l’ultrasonication compatible avec les microplaques offre une approche pratique pour un traitement des échantillons reproductible et parallélisé. Les modèles de sonicateurs pour microplaques Hielscher UIP400MTP (400 W) et UIP550MTP (550 W) sont conçus pour la sonication d’échantillons dans des plaques multipuits et des récipients de faible volume, permettant des flux de travail à plus haute cadence que les sonicateurs conventionnels à sonde unique. Pour les laboratoires de protéomique, ce format est intéressant car il peut réduire la variabilité liée aux manipulations, améliorer le traitement parallèle de plusieurs échantillons et s’intégrer plus naturellement dans les chaînes de préparation d’échantillons sur plaques.

Exemple de flux de travail

Un flux de travail récent de protéomique des vésicules extracellulaires, consacré à la biologie des cellules Th17 pilotée par PLA2G12A, fournit un exemple utile et éprouvé en laboratoire de la manière dont le sonicateur pour microplaques UIP400MTP peut être intégré à la préparation d’échantillons pour la protéomique shotgun. Dans cette série d’études, les échantillons de VE ont été préparés pour l’analyse protéomique par traitement au méthanol, sonication avec l’UIP400MTP, centrifugation, séchage, digestion trypsine/Lys-C et MS en tandem haute résolution couplée à une LC à nanodébit. Les travaux biologiques ont été publiés en 2026 par Mochizuki-Ono et ses collègues ; l’analyse protéomique y a permis de caractériser la manière dont PLA2G12A modifie les protéines cargo des VE dans le contexte des réponses pathogènes des lymphocytes T.

Sonicateur pour plaques multipuits UIP400MTP

Pourquoi la sonication en microplaque ?
L’UIP400MTP permet une sonication standardisée et parallèle d’échantillons de faible volume. C’est utile lorsque la reproductibilité, une faible quantité d’échantillon et la cadence de traitement de multiples échantillons sont importantes.


Liste de contrôle qualité

• Confirmer une quantité d’entrée égale en équivalent protéique de VE pour tous les échantillons.
• Utiliser des dispositions de traitement des échantillons randomisées ou équilibrées.
• Maintenir constants le volume de méthanol, la durée de sonication, la durée de séchage et le volume de digestion.
• Surveiller le rendement peptidique et le nombre total de protéines identifiées.
• Vérifier le taux de clivages manqués et la distribution des longueurs de peptides.
• Examiner la forme des pics chromatographiques et la reproductibilité des temps de rétention.
• Inclure des blancs pour surveiller la contamination par report.
• Utiliser des échantillons de CQ poolés pour les études de plus grande envergure.
• Évaluer le coefficient de variation entre réplicats.
• Utiliser l’ACP ou des méthodes apparentées pour identifier les effets de lot ou les échantillons aberrants.

Recommandations pour la documentation du protocole

Lors de la publication ou de la documentation de ce flux de travail, indiquer la quantité d’entrée de VE, le format de plaque, le volume de méthanol, l’amplitude et la durée de sonication de l’UIP400MTP, les conditions de centrifugation, la méthode de séchage, le tampon de digestion, la concentration enzymatique, la durée de digestion, les conditions d’acidification, la plateforme LC-MS/MS, le mode d’acquisition, la version du logiciel, la base de données, le seuil de FDR, la méthode de normalisation et le flux de travail statistique.
Tous les sonicateurs pour microplaques Hielscher enregistrent automatiquement les paramètres de procédé importants, tels que l’amplitude, la durée de sonication et la température, avec horodatage (date et heure), sous forme de fichier CVS sur la carte SD intégrée. La documentation des données pour la reproductibilité et le contrôle qualité n’a jamais été aussi simple !

L’étude en détail : protéomique shotgun des VE dans l’étude PLA2G12A

L’étude PLA2G12A fournit un exemple concret d’utilisation de l’UIP400MTP dans un flux de travail de protéomique shotgun. La question biologique était de savoir comment la phospholipase sécrétée PLA2G12A modifie les vésicules extracellulaires dérivées des cellules Th17 et influence ainsi la différenciation des lymphocytes T pathogènes. Les auteurs ont montré que PLA2G12A agit sur les membranes des VE pour produire des lysophospholipides, dont la 1-oléoyl-lysophosphatidyléthanolamine, et que la signalisation en aval de l’acide lysophosphatidique via LPA2 contribue à la différenciation des Th17. Au-delà de la signalisation lipidique, les études ont également examiné le contenu des VE, notamment en ARN et en protéines, faisant de la protéomique shotgun une composante importante de la stratégie de caractérisation.
Dans le flux de travail de préparation des VE, les cellules Th17 ont été cultivées dans un milieu contenant du sérum de veau fœtal appauvri en exosomes. Les surnageants de culture ont d’abord été centrifugés pour éliminer les cellules, filtrés sur un filtre de 0,22 µm, concentrés par ultrafiltration/ultracentrifugation, lavés, remis en suspension dans du PBS et quantifiés par dosage protéique BCA. Cette préparation des VE en amont a garanti qu’une quantité définie de matériel de VE, exprimée en équivalent protéique, puisse être introduite dans le flux de travail protéomique.
Pour l’analyse protéomique shotgun, les auteurs ont utilisé des échantillons de VE correspondant à 5 µg d’équivalents protéiques. Ces échantillons ont été séchés dans des tubes PCR, puis 25 µL de méthanol ont été ajoutés. Les échantillons ont ensuite été soumis à une sonication de 3 minutes à l’aide du sonicateur pour microplaques UIP400MTP. Après la sonication, les échantillons ont été centrifugés à 4°C pendant 20 minutes à 19 000 × g. Après prélèvement de 20 µL de surnageant, les échantillons ont été centrifugés jusqu’à siccité. Les protéines ont ensuite été dissoutes par sonication dans 4 µL de solution de trypsine/Lys-C à 100 ng/µL dans du bicarbonate d’ammonium 50 mM. La digestion a été réalisée pendant 2 heures à 37°C sous agitation à 300 rpm. Le digestat a été acidifié avec 1 µL d’acide trifluoroacétique à 1,25% et soumis à une spectrométrie de masse en tandem haute résolution couplée à une LC à nanodébit.
Ce flux de travail met en évidence plusieurs principes utiles pour la protéomique des VE en faible quantité. Premièrement, la quantité d’entrée a été normalisée par équivalent protéique, ce qui est important lorsque l’on compare des VE issues de génotypes ou de traitements différents. Deuxièmement, le méthanol a été utilisé avant la sonication, favorisant la rupture et l’extraction tout en évitant les systèmes à base de détergents susceptibles de compliquer la LC-MS/MS. Troisièmement, l’étape de sonication était courte et standardisée, ce qui est compatible avec le traitement parallèle des échantillons. Quatrièmement, la digestion trypsine/Lys-C a été réalisée dans un très petit volume, réduisant la dilution et favorisant la récupération des peptides à partir de faibles quantités. Enfin, le passage direct de la digestion à l’acidification et à la LC-MS/MS a réduit au minimum les étapes de manipulation inutiles.
La méthode LC-MS/MS en aval utilisait une séparation en phase inverse à nanodébit couplée à un spectromètre de masse Orbitrap Q-Exactive HF. Les échantillons ont été piégés sur une précolonne C18, puis séparés sur une colonne analytique de 50 µm de diamètre intérieur à 200 nL/min et 40°C. Le gradient allait d’une faible teneur en solvant organique à 35% de solvant B en 60 minutes, suivi d’un lavage à forte teneur organique et d’une rééquilibration. L’acquisition MS a été réalisée en mode ions positifs par acquisition indépendante des données avec dissociation collisionnelle à plus haute énergie. Les fichiers bruts DIA ont été analysés avec DIA-NN 1.8 à l’aide d’une bibliothèque spectrale prédite in silico.