Ultraheli tüvirakkude isoleerimine
Ultraheli töötlus (sonikeerimine) on väga tõhus mehaaniline meetod tüvirakkude isoleerimiseks inimese rasvkoest. Ultraheliga isoleeritud stroomaalne vaskulaarne fraktsioon (SVF) näitab märkimisväärset regeneratiivset potentsiaali meditsiinilisteks rakendusteks. Hielscher Ultrasonics pakub tüvirakkude kogumiseks mitmesuguseid otsese ja kaudse ultraheli töötluse võimalusi. Leidke oma tüvirakkude isoleerimisprotsessi jaoks ideaalne sonikaator!
Tüvirakkude ultraheliga isoleerimine
Inimkehast eraldatud rasvkude (rasvaimu abil) töödeldakse ultraheliga, et eraldada kude tüvirakkudest ja teistest kasvurakkudest. Seda eraldatud rakkude osa tuntakse stroomaalsete vaskulaarsete fraktsiooni rakkudena (SVF).
Tüvirakkude ultraheliga isoleerimise meetod rasvkoest põhineb ainult ultraheliga tekitatud kavitatsiooni toimimispõhimõttel, mis on puhtalt mehaaniline nihe. Need kavitatsioonilised nihkejõud lõhuvad rasvkoe, nii et tüvirakud vabanevad rasvkoe struktuurist. Tüvirakkude ultraheliga isoleerimine on ensüümivaba protseduur, mis väldib kollagenaasi, trüpsiini või dispaasi kasutamist.
Eraldatud tüvirakkude, mesenhümaalsete tüvirakkude, endoteeli eelkäijarakkude ja muude kasvurakkude tüüpide eraldamiseks tsentrifuugitakse ultraheliga töödeldud rasvkude.
Eraldatud tüvirakud kogutakse ja analüüsitakse nende kvaliteedi osas, sealhulgas rakkude arv, elujõulisus, endotoksiin ja gramm-värvimine, enne kui neid kasutatakse kohe autoloogseks siirdamiseks või säilitatakse krüosäilituses.
Miks vältida ensüüme?
Kuna tüvirakkude isoleerimiseks kasutatav ensümaatiline lagundamine on seotud suurte kulude ja võimalike ohutusriskidega ning ebapiisava tõhususega [Oberbauer et al. 2015], eelistatakse mitteensümaatilisi isoleerimismeetodeid, näiteks ultraheli kavitatsiooni. Ultraheliga isoleerimise etapp asendab ensümaatilise lagundamise, eraldades rakud ja rakuagregaadid rasvkoest mehaaniliselt.
GDmini2 UP200St-TD muunduril (200 vatti)
- Kiire
- Tõhus
- Reprodutseeritav
- Ohutu
- Ensüümivaba
- Kulutõhus
- Steriilsed võimalused
Rasvkoest pärinevad tüvirakud
Ultraheli töötlusega saadud tüvirakkude saagis
Avaldatud stroomaalse vaskulaarse fraktsiooni isoleerimismeetod ultraheli kavitatsiooni abil andis 1,67–2,24 × 107 rakku, elujõulisusega 97,1–98,9% [Victor, S., 2014]. Rakusaagised umbes 2–4 miljonit rakku grammi rasvkoe kohta saadi küpsete adipotsüütide ultraheliga lüüsimisel dissotsieeritud rasvkoes [Bright et al., 2014].
Ultraheliga ette valmistatud rakkudel on võrreldes standardse ensümaatilise isoleerimismeetodiga võrdselt kõrge adipogeenne ja osteogeenne diferentseerumispotentsiaal [Oberbauer et al. 2015].
Ultraheli süsteemid tüvirakkude isoleerimiseks
Kõrgeima ohutuse ja parima kvaliteedi tagamiseks on töökindel ultraheliseadmestik, mis võimaldab tüvirakkude töötlust täpselt kontrollida, patsientide eduka ravi võtmetegur. Hielscher Ultrasonics pakub mitmesuguseid võimalusi autoloogseks ultraheli kavitatsiooni abil eraldamise protsessiks, et isoleerida ja koguda tüvirakke ning endoteeli eelkäijarakke.
Otsene ultraheli töötlus tüvirakkude isoleerimiseks
Tüvirakkude isoleerimisprotsessis otsese ultraheli töötluse abil sukeldatakse ultraheli sarv (sonotrood, ultraheli otsak / sond) rasvkoesse. Sonotroodi kaudu juhitakse ultrahelilained otse autoloogsesse rasva, nii et ultraheli kavitatsioon vabastab tüvirakud ja stroomarakud ülejäänud koest. Hielscheri sonikaatorid UP200Ht ja UP200St koos sonotroodiga S26d14 on autoloogseks tüvirakkude töötluseks sageli kasutatavad süsteemid. Stroomaalse vaskulaarse fraktsiooni isoleerimine otsese ultraheli töötlusega sobib enamasti kasutamiseks puhasruumides.
Kaudne ultraheli töötlus tüvirakkude isoleerimiseks
Kuna tüvirakke kasutatakse autoloogsetes rakendustes, on protsessi steriilsus väga oluline. Seetõttu on Hielscher välja töötanud mitmeid kaudse ultraheli töötluse võimalusi, näiteks GDmini2, VialTweeter ja muud kohandatud süsteemid. Kaudse sonikeerimise korral juhitakse ultraheli lained läbi mahuti seina rasvkoesse. Stromaalne vaskulaarne fraktsioon (SVF) eraldatakse rasvkoest ultraheli kavitatsiooni abil samamoodi nagu otsese sonikeerimise korral.
Kaudse sonikeerimise protsess pakub eelist töödelda rakke suletud anumas saastevabades tingimustes, kuna sonotroodi (ultraheli sarve) sisestamisest tuleneva ristsaaste oht on välistatud. Rakkude isoleerimine toimub suletud süsteemis, mis tagab steriilsed protsessitingimused.
Loe lähemalt Hielscheri steriilsete sonikaatorite kohta!
Hielscheri digitaalseid sonikaatoreid saab täpselt juhtida puuteekraani või brauserijuhtimise kaudu. Sonikeerimise protseduurid saab eelnevalt seadistada intuitiivse menüü kaudu. Ultraheliseadmed on varustatud automaatse andmete salvestusega (kõik sonikeerimisprotsessi andmed salvestatakse integreeritud SD-kaardile). Ultraheli võimsussisendit saab rakkude isoleerimise protokollile täpselt vastavaks reguleerida.
VialTweeter sonikaator on steriilne homogenisaator ühtlaseks ja kiireks steriilseks proovide ettevalmistuseks.
Kirjandus/viited
- Oberbauer, Eleni; Steffenhagen, Carolin; Wurzer, Christoph; Gabriel, Christian; Redl, Heinz; Wolbank, Susanne (2015): Enzymatic and non-enzymatic isolation systems for adipose tissue-derived cells: current state of the art. Cell Regeneration (2015) 4:7.
- Stadlmann, J., Taubenschmid, J., Wenzel, D. et al. (2017): Comparative glycoproteomics of stem cells identifies new players in ricin toxicity. Nature 549, 2017. 538–542
- Haghjoo M., Azarbayjani M.A., Peeri M., Hosseini S.A. (2019): Effect of Training, Hyaluronic Acid, and Mesenchymal Stem Cell Therapies on Osteocalcin Gene Expression in Cartilage Tissue of Rats with Knee Osteoarthritis. Gene Cell Tissue 6, 2019.
- Zhu M., Kong D., Tian R., Pang M. , Mo M., Cheng, Y., Yang G., Cheng H.L., Lei X., Fang K., Cheng B., Wu Y. (2020): Platelet sonicates activate hair follicle stem cells and mediate enhanced hair follicle regeneration. Journal of Cellular and Molecular Medicine 24, 2020. 1786–1794.
Teadmist väärt faktid
Mis on tüvirakud?
Tüvirakud on mitmerakulise organismi diferentseerumata rakud, mis on võimelised looma lõputult juurde samat tüüpi rakke. Neid iseloomustab märkimisväärne potentsiaal areneda elu ja kasvu varases etapis paljudeks erinevateks keharakkude tüüpideks. Tüvirakkude kõige eristavam omadus on nende võime end rakkude jagunemise teel uuendada ning võime muutuda koe- või organispetsiifilisteks rakkudeks, millel on eriomased funktsioonid. Pluripotentsetel tüvirakkudel on potentsiaal diferentseeruda mis tahes kolmeks sugurakuks (germ cells): endoderm (mao sisemine limaskest, seedetrakt, kopsud), mesoderm (lihased, luu, veri, urogenitaalsüsteem) või ektoderm (epidermaalsed koed ja närvisüsteem).
Mõnes organis, näiteks soolestikus ja luuüdis, jagunevad tüvirakud regulaarselt, et parandada ja asendada kulunud või kahjustatud kudesid. Teistes organites, näiteks kõhunäärmes ja südames, jagunevad tüvirakud ainult erilistel tingimustel.
Mesenhümaalsed stroomarakud/tüvirakud (MSC), millel on suur potentsiaal mitmekesisteks terapeutilisteks rakendusteks regeneratiivses ja esteetilises meditsiinis, asuvad peamiselt luuüdis, kuid neid saab isoleerida ka teistest kudedest (nt kõhr, rasv, lihasrakud). Mesenhümaalseid tüvirakke peetakse prototüüpseteks täiskasvanu tüvirakkudeks, mida iseloomustab nende iseuuenemisvõime.
Tüvirakkude uuringuid ja ravi kasutatakse kudede ja organite kasvatamiseks siirdamise eesmärgil (koetehnoloogia). Muid tüvirakkude meditsiinilisi kasutusvaldkondi leidub ajuhaiguste (nt Parkinsoni ja Alzheimeri tõbi), rakupuudulikkuse ravis, verehaiguste (nt leukeemia), liigeste ja kõhre degeneratsiooni (nt osteoartriit) ravis ning kosmeetilistes ravimeetodites (nt vananemisvastased ravimeetodid). Üldiselt on tüvirakkude läbimõõt ligikaudu 15–25 mikronit.
Mesenhümaalsed tüvirakud (MSC) on multipotentsed stroomarakud, mis on võimelised diferentseeruma mitmesugusteks rakutüüpideks, sealhulgas osteoblastideks (luurakud), kondrotsüütideks (kõhrerakud), müotsüütideks (lihasrakud) ja adipotsüütideks (rasvarakud).
Mis on stromaalne vaskulaarne fraktsioon (SVF)?
Stromaalne vaskulaarne fraktsioon (SVF) on lipoaspiraadi komponent, mida saab inimkeha rasvkoest rasvaimu abil eraldada. Lipoaspiraat koosneb heterogeensest rakkude segust ja sisaldab palju tüvirakke, mida nimetatakse rasvkoest pärinevateks tüvirakkudeks (ASC või ADSC) ning mis sarnanevad luuüdi tüvirakkudega, näiteks oma võime poolest diferentseeruda mitmeliinilisteks rakkudeks.
Stromaalse vaskulaarse fraktsiooni heterogeenne populatsioon sisaldab muu hulgas endoteelirakke, erütrotsüüte, fibroblaste, lümfotsüüte, monotsüüte/ makrofaage ja perütsüüte ning samuti olulist osa rasvkoest pärinevaid tüvirakke.
Mis on rasvkoest pärinevad stromaalsed/tüvirakud (ASC)?
Rasvkoest pärinevad stromaalsed/tüvirakud (ASC / ADSC) vabastavad suurel hulgal bioaktiivseid kasvufaktoreid, näiteks epidermaalne kasvufaktor (EGF), vaskulaarne endoteeli kasvufaktor (VEGF), fibroblastide põhiline kasvufaktor (bFGF), keratinotsüütide kasvufaktor (KGF), trombotsüütidest pärinev kasvufaktor (PDGF), hepatotsüütide kasvufaktor (HGF), transformeeriv kasvufaktor-beeta (TGF-β), insuliini kasvufaktor (IGF) ja ajust pärinev neurotroofne faktor (BDNF). ACS ei vabasta mitte ainult kasvufaktoreid, vaid eritab ka tsütokiine, sealhulgas fms-sarnase türosiinkinaasi 3 (Flt-3) ligand, granulotsüütide kolooniaid stimuleeriv faktor (G-CSF), granulotsüütide-makrofaagide kolooniaid stimuleeriv faktor (GM-CSF), makrofaagide kolooniaid stimuleeriv faktor (M-CSF), interleukiinid (IL), näiteks IL-6, IL-7, IL-8, IL-11 ja IL-12, leukeemiat pärssiv faktor (LIF) ning kasvajanekroosifaktor-alfa (TNF-α).
Kuidas tüvirakke eraldatakse?
Inimeste autoloogseid täiskasvanud tüvirakke saab eraldada järgmistest allikatest:
- Luuüdi, mille eraldamiseks on vaja koe koristamist ehk luu puurimist.
- Rasvkude (lipiidirakud), mille eraldamiseks on vaja rasvaimu.
- Veri, mille eraldamiseks on vaja aferees, mille käigus doonori veri läbib „dialüüsi“ aparaadi, kus tüvirakud eraldatakse, samal ajal kui ülejäänud verekomponendid suunatakse doonorile tagasi.