Liposoomide ultraheli abil valmistamine

Ultraheli abil toodetud liposoomidel on väga kõrge kapseldumistõhusus, suur laadimismaht ja ühtlaselt väike sfääriline suurus. Seeläbi pakuvad ultraheli liposoomid suurepärast biosaadavust. Hielscher Ultrasonics pakub sonikaatoreid farmatseutilise kvaliteediga liposoomide usaldusväärseks tootmiseks partii- ja pidevrežiimis.

Liposoomide ultraheli abil tootmise eelised

Liposoomide ultraheli abil kapseldamine on tehnika, mille puhul ravimeid või muid terapeutilisi aineid kapseldatakse liposoomidesse ultraheli energia abil. Võrreldes teiste liposoomide kapseldamismeetoditega on ultraheli abil kapseldamisel mitu eelist, mis muudavad selle parimaks tootmistehnikaks.

• Suur laadimismaht, kõrge kapseldumistõhusus: Ultraheli abil liposoomide tootmise kohta on hästi teada, et sellega saadakse liposoome, milles on suur aktiivainete sisaldus, nt C-vitamiin, ravimimolekulid jms. Samal ajal on sonikeerimismeetodi kapseldumistõhusus kõrge. See tähendab, et ultraheli töötlusega kapseldatakse suur osa toimeainest. Kokkuvõttes teeb see ultraheli töötluse liposoomide tootmiseks väga tõhusaks meetodiks.
• Ühtlaselt väikesed liposoomid: Üks liposoomide ultraheli abil kapseldamise eeliseid on võime toota väga ühtlaseid liposoome kitsa suurusjaotusega. Ultraheli energiat saab kasutada suuremate liposoomide või lipiidiagregaatide lagundamiseks väiksemateks, ühtlasemateks liposoomideks. See tagab liposoomide suuruse ja kuju parema ühtluse, mis võib olla oluline ravimite kohaletoimetamise rakendustes, kus osakeste suurus võib mõjutada nende farmakokineetikat ja efektiivsust.
• Rakendatav mis tahes molekulidele: Teine liposoomide ultraheli abil kapseldamise eelis on võime kapseldada laia valikut ravimeid ja muid terapeutilisi aineid. Tehnikat saab kasutada nii hüdrofiilsete kui ka hüdrofoobsete ravimite kapseldamiseks, mida teiste meetoditega võib olla raske teha. Lisaks saab ultraheli energiat kasutada makromolekulide ja nanoosakeste kapseldamiseks, mis võivad olla teiste meetodite jaoks kapseldamiseks liiga suured.
• Kiire ja usaldusväärne: Liposoomide ultraheli abil kapseldamine on samuti suhteliselt lihtne ja kiire protsess. See ei nõua karmide kemikaalide ega kõrgete temperatuuride kasutamist, mis võivad kapseldatavatele terapeutilistele ainetele kahjulikud olla.
• Suurendamine: Lisaks saab tehnikat hõlpsasti suuremasse mahtu üle viia, mistõttu on see ravimite kohaletoimetamise rakenduste jaoks kuluefektiivne valik.

Kokkuvõttes on liposoomide ultraheli abil kapseldamine parem liposoomide kapseldamise tehnika, kuna see võimaldab toota ühtlaseid liposoome kitsa suurusjaotusega, kapseldada laia valikut terapeutilisi aineid ning on lihtne ja hõlpsasti suurendatav.

Pärast lipiidikile moodustumist ja sellele järgnevat rehüdratsiooni kasutatakse sonikeerimist toimeainete kapseldumise soodustamiseks liposoomi. Lisaks saavutatakse sonikeerimisega soovitud liposoomi suurus.

Liposoomide ultraheli abil valmistamine farmaatsia- ja kosmeetikatoodete jaoks

Liposoomid (lipiididel põhinevad vesiikulid), transferosoomid (ülideformeeruvad liposoomid), etosoomid (ülideformeeruvad vesiikulid kõrge alkoholisisaldusega) ja niosoomid (sünteetilised vesiikulid) on mikroskoopilised vesiikulid, mida saab kunstlikult valmistada kerakujuliste kandjatena, millesse saab kapseldada toimemolekule. Neid vesiikuleid, mille läbimõõt on 25 kuni 5000 nm, kasutatakse sageli ravimikandjatena farmaatsia- ja kosmeetikatööstuses, näiteks suukaudsel või paiksel ravimite manustamisel, geeniteraapias ja immuniseerimisel. Ultraheli töötlus on teaduslikult tõestatud meetod liposoomide väga tõhusaks tootmiseks. Hielscheri sonikaatorid toodavad liposoome, millel on suur toimeainete sisaldus ja suurepärane biosaadavus.

Liposoomid ja liposomaalne koostis

Liposoomid on unilamellaarsed, oligolamellaarsed või multilamellaarsed vesiikulaarsüsteemid, mis koosnevad samast materjalist nagu rakumembraan (lipiidide kaksikkiht). Vastavalt koostisele ja suurusele eristatakse liposoome järgmiselt:

• multilamellaarsed vesiikulid (MLV, 0,1-10μm)
• väikesed unilamellaarsed vesiikulid (SUV, <100 nm)
• suured unilamellaarsed vesiikulid (LUV, 100–500 nm)
• hiiglaslikud unilamellaarsed vesiikulid (GUV, ≥1 μm)

Liposoomide põhistruktuur koosneb fosfolipiididest. Fosfolipiididel on hüdrofiilne peagrupp ja hüdrofoobne sabagrupp, mis koosneb pikast süsivesinikuahelast.
Liposoomimembraani koostis on nahabarjääri omaga väga sarnane, mistõttu saab liposoome hõlpsasti inimnahka integreerida. Kui liposoomid nahaga ühinevad, võivad nad kaasa püütud toimeained vabastada otse sihtkohas, kus toimeained saavad oma ülesandeid täita. Seega suurendavad liposoomid kaasa püütud farmatseutiliste ja kosmeetiliste toimeainete naha läbitavust/ permeaablust. Ka kapseldatud toimeaineteta liposoomid, tühjad vesiikulid, on nahale tugevatoimelised toimeained, sest «phosphatidylcholin» sisaldab kahte asendamatut komponenti, mida inimorganism ise toota ei suuda: linoolhapet ja koliini.
Liposoome kasutatakse ravimite, peptiidide, valkude, «plasmic DNA», antisense-oligonukleotiidide või ribosüümide biosobivate kandjatena farmatseutilistel, kosmeetilistel ja biokeemilistel eesmärkidel. Osakeste suuruse ja lipiidide füüsikaliste parameetrite suur varieeruvus pakub atraktiivset potentsiaali kohandatud kandjate loomiseks väga erinevateks rakendusteks. (Ulrich 2002)

Liposoomide ultraheli abil moodustamine

Liposoome saab moodustada ultraheli abil. Liposoomide valmistamise põhimaterjaliks on «amphilic» molekulid, mis on tuletatud bioloogiliste membraanide lipiididest või põhinevad neil. Väikeste unilamellaarsete vesiikulite (SUV) moodustamiseks sonikeeritakse lipiidide dispersiooni õrnalt – nt käeshoitava ultraheliseadmega UP50H (50W, 30kHz), seadmega VialTweeter või ultraheli reaktoriga CupHorn – jäävannis. Sellise ultraheli töötluse kestus on ligikaudu 5 – 15 minutit. Teine meetod väikeste unilamellaarsete vesiikulite saamiseks on multilamellaarsete vesiikulite liposoomide sonikeerimine.
Dinu-Pirvu et al. (2010) teatab transferosoomide saamisest multilamellaarsete vesiikulite (MLV) sonikeerimisel toatemperatuuril.
Hielscher Ultrasonics pakub mitmesuguseid ultraheliseadmeid, sonotroode ja tarvikuid ning suudab seega tagada kõige sobivama ultraheli seadistuse väga tõhusaks liposoomide kapseldamiseks igas mastaabis.

Toimeainete ultraheliga kapseldamine liposoomidesse

Liposoomid toimivad kandjatena toimeainetele, nagu vitamiinid, terapeutilised molekulid, peptiidid jne. Ultraheli on tõhus vahend liposoomide valmistamiseks ja moodustamiseks toimeainete kaasapüüdmiseks. Samal ajal toetab ultraheli töötlus (sonikeerimine) kapseldamis- ja kaasapüüdmisprotsessi, mille tulemusena tekivad liposoomid, milles on suur toimeainete sisaldus. Enne kapseldamist kipuvad liposoomid fosfolipiidide polaarsete peade pinnalaengu-laengu vastasmõju tõttu klastreid moodustama (vrd Míckova et al. 2008), lisaks tuleb need avada. Näitena kirjeldavad Zhu et al. (2003) biotiinipulbri kapseldamist liposoomidesse ultraheli abil. Kui biotiinipulber lisati vesiikulite suspensioonilahusele, sonikeeriti lahust. Pärast seda töötlust püüti biotiin liposoomidesse kinni.
Loe lähemalt GLP-1 «peptrides» (nt semaglutiidi) ultraheliga kapseldamise kohta liposoomidesse!

Liposomaalsed emulsioonid ultraheli töötlusega

Niisutavate või vananemisvastaste kreemide, losjoonide, geelide ja muude kosmetsöötiliste koostiste toitva toime tugevdamiseks lisatakse liposomaalsetele dispersioonidele emulgaatoreid, et stabiliseerida suuremaid lipiidikoguseid. Uuringud on aga näidanud, et liposoomide võimekus on üldiselt piiratud. Emulgaatorite lisamisel ilmneb see mõju varem ja lisaemulgaatorid nõrgestavad fosfatidüülkoliini barjääriaffiinsust. Nanoosakesed – mis koosnevad fosfatidüülkoliinist ja lipiididest – on sellele probleemile lahenduseks. Need nanoosakesed moodustuvad õlitilgast, mida katab fosfatidüülkoliini monokiht. Nanoosakeste kasutamine võimaldab valmistada koostisi, mis suudavad neelata rohkem lipiide ja jäävad stabiilseks, nii et lisaemulgaatoreid pole vaja.
Ultraheli töötlus on tõestatud meetod nanoemulsioonide ja nanodispersioonide valmistamiseks. Suure intensiivsusega ultraheli annab vajaliku energia, et dispergeerida vedel faas (dispergeeritud faas) väikeste tilkadena teises faasis (pidev faas). Dispergeerimistsoonis tekitavad implodeerivad kavitatsioonimullid ümbritsevas vedelikus intensiivseid lööklaineid ja põhjustavad suure vedelikukiirusega vedelikujugade teket. Dispergeeritud faasi äsja tekkinud tilkade stabiliseerimiseks koalestsentsi vastu lisatakse emulsioonile emulgaatoreid (pindaktiivsed ained, surfaktandid) ja stabilisaatoreid. Kuna tilkade koalestsents pärast nende lõhkumist mõjutab lõplikku tilkade suurusjaotust, kasutatakse tõhusalt stabiliseerivaid emulgaatoreid, et hoida lõplik tilkade suurusjaotus tasemel, mis on võrdne jaotusega vahetult pärast tilkade lõhkumist ultraheli dispergeerimistsoonis.

Liposomaalsed dispersioonid ultraheli töötluse abil

Liposomaalsetel dispersioonidel, mis põhinevad küllastumata ühendil „phosphatidylchlorine“, puudub stabiilsus oksüdeerumise vastu. Dispersiooni stabiliseerimine on võimalik saavutada antioksüdantidega, näiteks vitamiinide C ja E kompleksiga.

Liposoomide moodustamine pöördfaasilise aurustamise meetodil ultraheli töötlust kasutades

Ortan jt (2002) saavutasid oma uuringus, mis käsitles Anethum graveolens eeterliku õli ultraheli abil liposoomidesse viimist, häid tulemusi. Pärast ultraheli töötlust olid liposoomide mõõtmed vahemikus 70-150 nm ja MLV puhul 230-475 nm; need väärtused olid ligikaudu püsivad ka 2 kuu pärast, kuid suurenesid 12 kuu pärast, eriti SUV dispersioonis (vt allolevaid histogramme). Stabiilsusmõõtmine, mis käsitles eeterliku õli kadu ja suurusjaotust, näitas samuti, et liposomaalsed dispersioonid säilitasid lenduva õli sisalduse. See viitab sellele, et eeterliku õli kinnipüüdmine liposoomidesse suurendas õli stabiilsust.

Ortan jt (2009): MLV ja SUV dispersioonide stabiilsus 1 aasta pärast. Liposomaalseid koostisi hoiti temperatuuril 4±1 ºC.

Hielscheri ultraheliprotsessorid on ideaalsed seadmed kosmeetika- ja farmatseutikatööstuse rakendusteks. Mitmest ultraheliprotsessorist, millest igaüks on kuni 16 000 vatti, koosnevad süsteemid tagavad vajaliku võimsuse, et viia see laborirakendus üle tõhusaks tootmismeetodiks peenelt dispergeeritud emulsioonide saamiseks pidevas vooluses või partiina – saavutades tulemusi, mis on võrreldavad tänapäeva parimate saadaolevate kõrgsurvehomogenisaatorite, näiteks avaventiilidega. Lisaks sellele pideva emulgeerimise suurele tõhususele vajavad Hielscheri ultraheliseadmed väga vähe hooldust ning neid on väga lihtne kasutada ja puhastada. Ultraheli toetab tegelikult puhastamist ja loputamist. Ultraheli võimsus on reguleeritav ning seda saab kohandada konkreetsete toodete ja emulgeerimisnõuetega. Saadaval on ka spetsiaalsed läbivoolukambriga reaktorid, mis vastavad kõrgendatud CIP- (clean-in-place) ja SIP- (sterilize-in-place) nõuetele.

Korduma kippuvad küsimused liposoomide kohta

Milliseid liposoomide tüüpe eristatakse?

Liposoome liigitatakse erinevatesse tüüpidesse nende suuruse ja neis sisalduvate kaksikkihtide arvu alusel. Need kategooriad hõlmavad järgmist:

• Väikesed unilamellaarsed vesiikulid (SUV): Need on väikseimad liposoomid, millel on üks lipiidide kaksikkiht.
• Suured unilamellaarsed vesiikulid (LUV): Need on SUV-idest suuremad ja neil on samuti üks kaksikkiht.
• Multilamellaarsed vesiikulid (MLV): Need sisaldavad mitut kontsentrilist kaksikkihti.
• Multivesikulaarsed vesiikulid (MVV): Need koosnevad mitmest väiksemast vesiikulist suurema vesiikuli sees.

Teiste spetsiaalsete tüüpide hulka kuuluvad:

• PEGüleeritud liposoomid: Polüetüleenglükooliga (PEG) modifitseeritud liposoomid, mis parandavad stabiilsust ja ringlusaega.
• Nanoliposoomid: Väga väikesed liposoomid, mida kasutatakse tavaliselt sihipäraseks ravimite kohaletoimetamiseks.

Milliseid vesiikulite struktuure võivad liposoomid omada?

Liposoome liigitatakse vesiikulite struktuuri alusel edasi seitsmeks põhitüübiks:

• Multilamellaarsed suured vesiikulid (MLV): Sisaldavad mitut kaksikkihti.
• Oligolamellaarsed vesiikulid (OLV): Neil on mõned kaksikkihid.
• Väikesed unilamellaarsed vesiikulid (SUV): Väikseimad, ühe kaksikkihiga.
• Keskmise suurusega unilamellaarsed vesiikulid (MUV): Vahepealse suurusega, ühe kaksikkihiga.
• Suured unilamellaarsed vesiikulid (LUV): Suuremad, ühe kaksikkihiga.
• Hiiglaslikud unilamellaarsed vesiikulid (GUV): Väga suured, ühe kaksikkihiga.
• Multivesikulaarsed vesiikulid (MVV): Mitu vesiikulit ühe suure vesiikuli sees.

Millised on erinevused liposoomide ja niosoomide vahel?

Liposoomid ja niosoomid erinevad peamiselt oma koostise poolest:
Liposoomid: Valmistatud kaheahelalistest fosfolipiididest, mis võivad olla kas neutraalsed või laetud.
Niosoomid: Valmistatud laenguta ühe ahelaga pindaktiivsetest ainetest ja kolesteroolist.
Mõlemad struktuurid moodustuvad ultraheli töötluse (sonikeerimise) abil, mis soodustab kaksikkihiliste vesiikulite kokkupanekut.

Milline on liposoomi ideaalne suurus?

Terapeutiliseks kohaletoimetamiseks on liposoomi ideaalne suurus teoreetiliselt 50 kuni 200 nanomeetrit läbimõõdus. See suurusvahemik optimeerib stabiilsust ja biosaadavust. Ultraheli töötlust (sonikeerimist) kasutatakse tavaliselt vesiikuli vähendamiseks soovitud suuruseni.

Kas liposoomid võivad kanda hüdrofiilseid ravimeid?

Jah, liposoomid võivad kanda hüdrofiilseid ravimeid. Neid hinnatakse biomeditsiinilistes rakendustes nende võime tõttu kapseldada nii hüdrofoobseid kui ka hüdrofiilseid aineid. Lisaks pakuvad need kõrget biosobivust ja biolagunevust, mistõttu on need tõhusad kohaletoimetamissüsteemid.

Kuidas liposoome valmistada?

Levinumad liposoomide valmistamise meetodid on õhukese kile meetod ja pöördfaasi aurustamise meetod.
Õhukese kile hüdratatsiooni meetod:

1. Lahustage lipiidid orgaanilises lahustis.
2. Aurustage lahusti, et moodustada õhuke lipiidikile.
3. Hüdratiseerige kile vesilahusega, kasutades ultraheli töötlust (sonikeerimist), et moodustada multilamellaarseid vesiikuleid.

Pöördfaasi aurustamise meetod:

1. Lahustage lipiidid vees ja etanoolis.
2. Töödelge lahust ultraheliga (sonikeerimine) temperatuuril 60°C umbes 10 minutit, et moodustada lipiidipasta.
3. Jahutage lipiidide suspensioon ja lisage vett või puhverlahust tilkhaaval pidevalt segades.
4. Hüdratiseerige suspensiooni 1 tund, et moodustada multilamellaarseid vesiikuleid.
5. Vähendage liposoomide suurust edasise ultraheli töötlusega (sonikeerimisega).

Mis on arhesoomid?

Arhesoomid on liposoomid, mis on valmistatud arhelipiididest, mis on tuntud oma stabiilsuse ja vastupidavuse poolest äärmuslikele tingimustele. Need omadused muudavad arhesoomid eriti kasulikuks ravimite kohaletoimetamisel ja vaktsiinide arendamisel keerulistes keskkondades.

Kuidas arhesoome valmistatakse?

Sonikeerimise protseduur Pise (2022) järgi: arhaeosoome võib valmistada Sulfolobussolfataricus’e polaarsete lipiidide fraktsioonist „PLF“ ultraheli töötlusega temperatuuril 60°C ilma välise lipiidide lisamiseta. Temperatuuril 0°C sonikeeriti Sulfolobusacidocaldarius’e polaarseid lipiide tõhusalt, et moodustada arhaeosoome. BMD-ga laetud arhaeosoome ja tavapäraseid liposoome ning Archaea H. salinarum’ist eraldatud ja fosfatidüülkoliiniga rikastatud arhaeaallipiide valmistati sonikeerimistehnikatega. Sonikeeritud vesiikulid loodi paikseks manustamiseks, sonikeerides MLV-dispersioone 80-protsendilisel amplituudil 4 minutit Hielscher UP50H sondtüüpi sonikaatoriga (vt pilti vasakul).

Kirjandus/viited

• Raquel Martínez-González, Joan Estelrich, Maria Antònia Busquets (2016): Liposomes Loaded with Hydrophobic Iron Oxide Nanoparticles: Suitable T2 Contrast Agents for MRI. International Journal of Molecular Science 2016.
• Zahra Hadian, Mohammad Ali Sahari, Hamid Reza Moghimi; Mohsen Barzegar (2014): Formulation, Characterization and Optimization of Liposomes Containing Eicosapentaenoic and Docosahexaenoic Acids; A Methodology Approach. Iranian Journal of Pharmaceutical Research (2014), 13 (2): 393-404.
• Joanna Kopecka, Giuseppina Salzano, Ivana Campia, Sara Lusa, Dario Ghigo, Giuseppe De Rosa, Chiara Riganti (2014): Insights in the chemical components of liposomes responsible for P-glycoprotein inhibition. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine 2013.
• Pise, Ganesh (2022): Archaeosomes for both cell-based delivery applications and drug-based delivery applications. Journal of Medical Pharmaceutical and Allied Sciences 11, 2022. 4995-5003.