Parandage HPLC analüüsi usaldusväärse proovi ettevalmistamise abil
Suure jõudlusega vedelikkromatograafia (HPLC) on endiselt üks tähtsamaid analüüsimeetodeid ühendite identifitseerimiseks ja kvantifitseerimiseks keerulistes matriitsides. HPLC-meetodeid hinnatakse nende tundlikkuse, selektiivsuse ja reprodutseeritavuse tõttu alates ravimite kvaliteedikontrollist kuni keskkonnaseire ja toiduanalüüsini. Kromatograafiliste andmete usaldusväärsus sõltub aga suuresti ühest olulisest etapist: HPLC-proovi ettevalmistamisest.
Uuringud ja proovi ettevalmistamise rutiin näitavad, et sonikatsiooniga ekstraheerimine ja proovi ettevalmistamine parandab oluliselt HPLC-analüüsi tõhusust, täpsust ja kiirust. Kasutades ultraheli energiat maatriksite lõhkumiseks ja analüütide lahustitesse ülekandumise suurendamiseks, saavad laborid suurema saagise, lühema ekstraheerimisaja ja korratavamad analüüsitulemused.
Miks proovi ettevalmistamine on HPLC-s oluline
Paljudes analüütilistes töövoogudes on proovi maatriks – nagu taimne materjal, bioloogiline kude, pinnas või vesi. – sisaldab keerulisi segusid ühenditest, mis võivad segada kromatograafilist eraldamist. Seetõttu on vaja tõhusat proovi ettevalmistamist, et isoleerida analüütid, eemaldada segavad ained ja kontsentreerida sihtühendid enne HPLC-süsteemi süstimist.
Traditsioonilised ekstraheerimismeetodid hõlmavad sageli pikki protseduure, suuri orgaaniliste lahustite koguseid ja mitmeid puhastusetappe. Need meetodid võivad põhjustada varieeruvust, suurendada tegevuskulusid ja pikendada analüüsi koguaega.
Ultraheli proovi ettevalmistamine pakub tõhusat alternatiivi. Soniseerimine toob kõrgsagedusliku akustilise energia vedelasse keskkonda, tekitades mikroskoopilisi kavitatsioonimulle. Kui need mullid kokku kukuvad, tekitavad nad lokaalseid nihkejõude ja mikrosegunemisefekte, mis häirivad tahkeid matriise ja kiirendavad massiülekannet. See protsess suurendab oluliselt ekstraheerimise tõhusust.
UIP400MTP suure läbilaskevõimega sonikaator koos Tube-Rackiga autoproovampleri viaali jaoks
Teaduslikud tõendid: Sonikatsioon parandab analüütilist tulemuslikkust
Mitmed refereeritud uuringud on näidanud ultraheli ekstraheerimise eeliseid HPLC tööprotsessides.
Näiteks pestitsiidide jääkide jälgimiseks veeproovides välja töötatud meetodis kasutati karbarüüli pestitsiidide kontsentratsiooni määramiseks sonikatsiooni koos LC-MS/MS-analüüsiga. Selle meetodi puhul ekstraheeriti veeproovid enne kromatograafilist analüüsi ultraheli abil atsetonitriiliga. Meetodiga saavutati tugev analüütiline tulemuslikkus, sealhulgas saagis vahemikus 89,53% kuni 101,72%, mis kinnitab ultraheli-proovide ettevalmistamise protseduuri täpsust ja usaldusväärsust.
Ultraheli ekstraheerimise etapp võimaldas analüütide tõhusat ülekandmist vesipõhisest maatriksist orgaanilisse lahustisse, vähendades lahusti tarbimist ja kõrvaldades vajaduse ulatusliku puhastusprotseduuri järele. Valideeritud analüütiline meetod näitas suurepärast lineaarsust, täpsust ja kvantifitseerimise piire, mis näitab sonikatsiooni tõhusust kaasaegsetes kromatograafilistes tööprotsessides. (vt Roudani et al., 2018)
Ühes teises uuringus tutvustati ultraheli abil toimuvat tahkefaasilist dispersiooni (UA-MSPD) oliivilehtede oleuropeiini määramiseks HPLC-analüüsi abil. Selle tehnika puhul segati taimepulber ja sorbendi materjal ning seejärel puututi elutsioonietapi ajal kokku ultrahelilainetega. Ultraheli suurendas analüüdi desorptsiooni sorbendi pinnalt, parandades samal ajal ekstraheerimist proovi maatriksist. (vt Rashidipour ja Heydari, 2018)
Optimeeritud ultraheli-menetlus andis märkimisväärseid analüütilisi parandusi, sealhulgas:
- Lineaarsed kalibreerimiskõverad R² = 0,9979
- Avastamispiirid on nii madalad kui 0,03 µg ml-¹.
- Taastamismäärad vahemikus 90,2% kuni 96,7%.
Need tulemused kinnitavad, et ultraheli abil toimuv ekstraheerimine mitte ainult ei kiirenda proovi ettevalmistamist, vaid suurendab ka ekstraheerimise tulemuslikkust võrreldes klassikalise maatriksiga tahkefaasilise dispersioonimeetodiga.
Sondi tüüpi sonikaator UP200St HPLC-proovide ettevalmistamiseks
Ultraheli proovi ettevalmistamise peamised eelised HPLC jaoks
Ultraheli ekstraheerimise kasvav kasutuselevõtt analüütilistes laborites on tingitud mitmetest mõõdetavatest eelistest.
- Suurem ekstraheerimise tõhusus
Akustiline kavitatsioon lagundab tahkeid matriksid ja parandab lahusti tungimist. See parandab analüüdi eraldumist ja suurendab saagise määrasid, eriti keerukates proovides sisalduvate jälgi sisaldavate ühendite puhul. - Vähendatud proovi ettevalmistamise aeg
Ultraheli ekstraheerimine võib sageli viia proovi ettevalmistamise lõpule sekundite või minutite jooksul. Näiteks UA-MSPD optimeeritud ultraheli ekstraheerimisparameetrid saavutasid tõhusa analüüdi taastamise umbes 30 sekundiga sonikatsiooni ajal, mis näitab, kui oluliselt saab kiirendada analüüsi tööprotsesse. - Väiksem lahusti tarbimine
Kuna ultraheli suurendab massiülekannet, on tavaliselt vaja väiksemaid lahustimahtusid. Vähenenud lahustikasutus parandab labori jätkusuutlikkust ja vähendab tegevuskulusid. - Paremini reprodutseeritavus
Ühetaoline ultraheli energiajaotus tagab proovi ühtlase lõhkumise ja ekstraheerimise korduste lõikes, mis viib analüütiliste mõõtmiste parema täpsuseni. - Ühilduvus kaasaegsete kromatograafiliste meetoditega
Ultraheli ekstraheerimine on hõlpsasti integreeritav HPLC-, UHPLC- ja LC-MS-süsteemidega, mistõttu sobib see suure tootlikkusega analüütilisse keskkonda.
Fenoolsete ühendite HPLC-kromatogramm Annona muricata lehtede ultraheli isoleeritud ekstraktist, kasutades ultrasonikaatorit UP400S.
(Uuring ja graafik: ©Nolasco-González et al., 2022)
Praktilised sonikatsioonilahendused HPLC-proovide ettevalmistamiseks
Hielscheri sonikaatorid pakuvad ultraheli ekstraheerimist rakendavatele laboritele täpset kontrolli selliste parameetrite üle nagu amplituud, aeg ja impulssrežiim. Seetõttu sobivad Hielscheri laboratoorsed sonikaatorid eriti hästi analüütiliste laborite jaoks.
Valige oma HPLC-proovide jaoks kõige sobivam laborisonaator
| Sonicator mudel | HPLC eelised | Parim kasutusviis HPLC-proovide ettevalmistamisel |
| VialTweeter Multi-Tube Sonicator |
- Kuni 10 suletud viaalide samaaegne sonikatsioon ühesuguse ultraheli energiaga - Steriilne: ristsaastumist ei toimu, sest proovid jäävad suletuks. - Väga hästi korratavad ekstraheerimistingimused eri partiide puhul - Tõhus kavitatsioon väikese mahuga analüütiliste proovide jaoks |
- Keskkonna-, toidu- või ravimiproovide suure läbilaskevõimega ettevalmistamine - Jälganalüütide ekstraheerimine enne HPLC, UHPLC või LC-MS analüüsi. - Standardiseeritud tööprotsessid, mis nõuavad mitme proovi identset töötlemist |
| Mikroplaadi sonikaatori UIP400MTP |
- Tervete mikroplaatide (96-kujulised, 384-kujulised formaadid) kontaktivaba sonikatsioon. - Ühetaoline ultraheli energiajaotus kõigis puuraukudes - Võimaldab automatiseerimist ja robotite integreerimist analüütiliste töövoogude jaoks. - Suur läbilaskevõime koos amplituudi ja soniseerimisaja täpse kontrolliga |
- Suure läbilaskevõimega UHPLC sõelumisprotsessid - Farmaatsiaühendite raamatukogud ja metaboloomika proovide ettevalmistamine - Plaadipõhine ekstraheerimine LC-MS või UHPLC analüütiliste torujuhtmete jaoks |
| Laboratooriumi sonikaatorid mikrootsikuga (otsene sonikatsioon) |
- Maksimaalne ultraheli intensiivsus tõhusaks maatriksi lõhkumiseks - Analüütide väga kiire ekstraheerimine tahketest, viskoossetest või heterogeensetest proovidest - Reguleeritav amplituud ja impulsi parameetrid optimeeritud ekstraheerimistingimuste jaoks - Kõrge kavitatsioonienergia parandab analüüdi saagist ja ekstraheerimise tulemuslikkust |
- Ekstraheerimine keerulistest matriitsidest, nagu taimekude, toiduproovid või polümeerid. - Homogeniseerimine enne SPE-d, filtreerimist või vedelik-vedelik ekstraheerimist - Meetodi väljatöötamine ultraheli-HPLC proovi ettevalmistamiseks |
| kupael (“kõrge intensiivsusega vann” keeduklaasid ja torud) |
- Kaudne sonikatsioon takistab sondi saastumist - Ühetaoline ultraheliväli mitme toru jaoks samaaegselt - Ideaalne steriilsete, ohtlike või lenduvate proovide jaoks, mis peavad jääma suletuks. - Lihtsustab käsitsemist, säilitades samal ajal tugeva kavitatsioonienergia |
- Mitme HPLC-proovi paralleelne ekstraheerimine suletud tsentrifuugitorudesse - Bioloogiliste, farmaatsiatoodete või keskkonnaproovide ettevalmistamine - Tööprotsessid, kus on vaja saastevaba kaudset sonikatsiooni |
Teaduslik tähtsus analüütilise keemia jaoks
Kuna analüütiline keemia liigub kiiremate ja säästvamate laboratooriumitavade suunas, on ultraheli proovide ettevalmistamine muutunud võimsaks tehnoloogiaks, mis võimaldab seda teha. Sonikatsioon toetab kiirete analüütiliste meetodite väljatöötamist väiksema lahustikulu, parema ekstraheerimise tõhususe ja tugevate valideerimisparameetrite abil.
Üha kasvav kirjandus ultraheli ekstraheerimise kohta näitab, et sonikaatoriga HPLC-proovide ettevalmistamine ei ole pelgalt mugavus. – see on teaduslikult valideeritud lähenemisviis, mis suurendab analüütilist tulemuslikkust. Kombineerides ultraheli ekstraheerimise kaasaegsete kromatograafiliste meetoditega, saavad laborid saavutada analüütide usaldusväärse tuvastamise üha keerukamates proovimaatriksites.
Sonikatsiooniga täiustatud HPLC tööprotsessid
Analüüsiseadmete ja proovide ettevalmistamise tehnoloogiate pideva arengu tõttu hakkab ultraheli ekstraheerimine tõenäoliselt mängima veelgi suuremat rolli kromatograafialaboratooriumides. Selle võime ühtlustada tööprotsesse, parandada andmete kvaliteeti ja vähendada keskkonnamõju vastab hästi kaasaegse analüütilise teaduse arenevatele nõuetele.
Analüütilistele keemikutele ja tööstuslaboritele, kes soovivad optimeerida HPLC-proovide ettevalmistamist, pakub ultraheli ekstraheerimine tõestatud, skaleeritavat ja teaduslikult usaldusväärset lahendust. Integreerides sonikatsiooni rutiinsetesse proovide ettevalmistamise protokollidesse, saavad laborid oluliselt parandada nii kromatograafilise analüüsi tõhusust kui ka usaldusväärsust.
Disain, tootmine ja nõustamine – Kvaliteet Valmistatud Saksamaal
Hielscheri ultrasonikaatorid on tuntud oma kõrgeimate kvaliteedi- ja disainistandardite poolest. Vastupidavus ja lihtne kasutamine võimaldavad meie ultrasonikaatorite sujuvat integreerimist tööstusrajatistesse. Hielscheri ultrasonikaatorid saavad kergesti käsitseda karmid tingimused ja nõudlikud keskkonnad.
Hielscher Ultrasonics on ISO sertifitseeritud ettevõte ja paneb erilist rõhku suure jõudlusega ultrasonikaatoritele, millel on tipptasemel tehnoloogia ja kasutajasõbralikkus. Loomulikult on Hielscheri ultrasonikaatorid CE-nõuetele vastavad ja vastavad UL, CSA ja RoHs nõuetele.
Kirjandus / Viited
- M. Rashidipour and R. Heydari (2018): Ultrasonic-Assisted Matrix Solid-Phase Dispersion and High-Performance Liquid Chromatography as an Improved Methodology for Determination of Oleuropein from Olive Leaves. Analytical and Bioanalytical Chemistry Research 52, 2018. 307-316.
- Roudani, A.; Rachid, Mamouni; Nabil, Saffaj; Laknifli, A.; Gharby, Said; Noureddine, El Baraka; Bakka, Abdelhamid; Abdellah, Faouzi (2018): Method validation in the determination of Carbaryl pesticide in water samples using sonication and liquid chromatography-tandem mass spectrometry. JMES 8 (7), 2017. 2409-2420.
- Bimakr M., Ganjloo A., Zarringhalami S., Ansarian E. (2017): Ultrasound-assisted extraction of bioactive compounds from Malva sylvestris leaves and its comparison with agitated bed extraction technique. Food Science and Biotechnology 2017 Nov 30;26(6):1481-1490.
Korduma kippuvad küsimused
Mis on HPLC?
Suure jõudlusega vedelikkromatograafia (HPLC) on analüütiline eraldustehnika, mida kasutatakse segus olevate komponentide identifitseerimiseks, kvantifitseerimiseks ja puhastamiseks. HPLC puhul veab vedel liikuv faas lahustunud analüütikuid läbi kolonni, mis on pakitud kõrge rõhu all paikse faasiga. Erinevused analüütide, statsionaarse faasi ja liikuva faasi vahelistes vastastikmõjudes põhjustavad ühendite eraldumist kolonni läbimisel. Detektorid, nagu UV-Vis, fluorestsents või massispektromeetria, mõõdavad eraldatud ühendeid, võimaldades täpset kvalitatiivset ja kvantitatiivset analüüsi.
Millised on vedelikkromatograafia tüübid?
Vedelikukromatograafiat võib liigitada vastavalt eraldusmehhanismile, mida kasutatakse analüüdi, statsionaarse faasi ja liikuva faasi vahel. Kõige levinumad tüübid on pöördfaasikromatograafia, kus mittepolaarne statsionaarne faas eraldab ühendid hüdrofoobse koostoime alusel; normaalfaasikromatograafia, kus kasutatakse polaarset statsionaarset faasi ja eraldatakse ühendid vastavalt polaarsusele; ioonvahetuskromatograafia, kus laetud statsionaarsed faasid eraldavad analüüdid ioonse koostoime alusel; ja suuruskromatograafia, mis eraldab molekulid vastavalt nende hüdrodünaamilisele suurusele ja molekulkaalule. Täiendavate spetsialiseeritud meetodite hulka kuuluvad afiinsuskromatograafia ja hüdrofiilse interaktsiooni kromatograafia (HILIC), mis on suunatud spetsiifilistele molekulaarsetele interaktsioonidele või polaarsetele ühenditele.
Milliseid viaale kasutatakse HPLC jaoks?
HPLC-analüüsides kasutatakse tavaliselt väikeseid klaas- või polümeerviaalid, mis on mõeldud ettevalmistatud proovide hoidmiseks enne kromatograafiasüsteemi süstimist. Kõige tavalisem formaat on 2 ml autosampleriviaal, mis ühildub enamiku HPLC-autosampleritega. Need viaalid on tavaliselt valmistatud borsilikaatklaasist, et tagada keemiline vastupidavus ja minimaalne koostoime lahustite ja analüüdidega. Sõltuvalt proovi tüübist võivad viaalid sisaldada väikese mahuga proovide jaoks mõeldud sisestusi, kruvikorgiga või krimpkorgiga sulgureid ning proovi terviklikkuse säilitamiseks näiteks PTFE/silikoonist valmistatud septaid.
Mis on automaatproovivõtja viaali?
Autosampler-viaalid on spetsiaalsed proovikonteinerid, mis on mõeldud HPLC- ja UHPLC-seadmete automaatsete süstesüsteemide jaoks. Neis hoitakse ettevalmistatud proovilahust ja need asetatakse seadme autosampleri salve, kust süsteem võtab automaatselt kindla mahu kromatograafiakolonni süstimiseks välja. Autosampleri viaalid on valmistatud täpsete mõõtmetega, et tagada ühilduvus robotproovivõtunõeltega ja vähendada proovi aurustumist, saastumist või adsorptsiooni. Nende konstruktsioon võimaldab kaasaegsetes kromatograafialaborites reprodutseeritavat, suure läbilaskevõimega analüüsi.
Millised on HPLC sammud?
Kõrgsurvevedelikkromatograafia (HPLC) tüüpiline tööprotsess koosneb mitmest järjestikusest etapist, mis tagavad analüütide usaldusväärse eraldamise ja tuvastamise.
- Kõigepealt toimub proovi ettevalmistamine, et lahustada analüüsitav aine, eemaldada tahked osakesed ja sageli ekstraheerida või kontsentreerida sihtühendid proovi maatriksist. See etapp võib hõlmata filtreerimist, lahjendamist või ekstraheerimistehnikaid, nagu ultraheli ekstraheerimine, tahkefaasiline ekstraheerimine või vedelik-vedelik ekstraheerimine.
- Seejärel pannakse ettevalmistatud proov HPLC-viaalidesse ja sisestatakse autosamplerisse. Autosampler süstib täpse koguse proovi voolavasse liikuvasse faasi.
- Seejärel transpordib liikuva faasi tarneetapp süstitud proovi läbi süsteemi kõrgsurvepumba abil. Liikuv faas viib analüütid läbi kromatograafilise kolonni kontrollitud voolukiirusega.
- Kromatograafilise kolonni sees toimub eraldamine. Kolonn sisaldab statsionaarset faasi, tavaliselt pakendatud osakesi, millel on kindlaksmääratud keemilised omadused. Analüütide liikumisel läbi kolonni interakteeruvad nad erinevalt statsionaarse faasi ja liikuva faasiga, mistõttu nad elueeruvad eri aegadel.
- Pärast eraldamist läbivad ühendid detektori, näiteks UV-Vis-, fluorestsentsi- või massispektromeetria detektori. Detektor mõõdab elueeruvate ühendite olemasolu ja kontsentratsiooni ning teisendab signaali elektroonilisteks andmeteks.
- Lõpuks teostatakse andmete kogumine ja analüüs kromatograafiatarkvara abil. Süsteem genereerib kromatogrammi, mille piigid vastavad üksikutele ühenditele. Tippude peekide peetumisaeg aitab tuvastada analüütikuid, samas kui tippude pindalad või kõrgused võimaldavad kvantitatiivselt määrata nende kontsentratsiooni.
Hielscher Ultrasonics toodab suure jõudlusega ultraheli homogenisaatoreid alates Lab kuni tööstuslik suurus.