Täienda HPLC analüüsi usaldusväärse proovi ettevalmistusega
Kõrgefektiivne vedelikkromatograafia (HPLC) on endiselt üks olulisemaid analüütilisi meetodeid ühendite tuvastamiseks ja kvantifitseerimiseks keerukates maatriksites. Alates farmaatsiatoodete kvaliteedikontrollist kuni keskkonnaseire ja toidu analüüsini hinnatakse HPLC meetodeid nende tundlikkuse, selektiivsuse ja korratavuse tõttu. Kromatograafiliste andmete usaldusväärsus sõltub aga suurel määral ühest otsustavast etapist: HPLC proovi ettevalmistusest.
Uuringud ja proovi ettevalmistuse rutiinid näitavad, et ultraheli töötlusega (sonikeerimisega) toetatud ekstraheerimine ja proovi ettevalmistus parandavad oluliselt HPLC analüüsi efektiivsust, täpsust ja kiirust. Kasutades ultraheli energiat maatriksite lõhkumiseks ja analüütide ülekande parandamiseks lahustitesse, saavad laborid kõrgemaid saagiseid, lühemaid ekstraheerimisaegu ja paremini korratavaid analüütilisi tulemusi.
Miks on proovi ettevalmistus HPLC-s oluline
Paljudes analüütilistes töövoogudes sisaldab proovi maatriks – näiteks taimne materjal, bioloogiline kude, muld või vesi – keerukaid ühendite segusid, mis võivad kromatograafilist lahutamist segada. Seetõttu on vaja tõhusat proovi ettevalmistust, et analüüdid isoleerida, segavad ained eemaldada ja sihtühendid enne HPLC süsteemi süstimist kontsentreerida.
Traditsioonilised ekstraheerimismeetodid hõlmavad sageli pikki protseduure, suuri koguseid orgaanilisi lahusteid ja mitut puhastusetappi. Need meetodid võivad tuua kaasa varieeruvust, suurendada tegevuskulusid ja pikendada analüüsi kogukestust.
Ultraheliga proovi ettevalmistus pakub tõhusat alternatiivi. Ultraheli töötlus (sonikeerimine) toob vedelsöötmesse kõrgsageduslikku akustilist energiat, tekitades mikroskoopilisi kavitatsioonimulle. Kui need mullid kollapseeruvad, tekitavad nad lokaalseid nihkejõude ja mikrosegunemise efekte, mis lõhuvad tahkeid maatrikseid ja kiirendavad massiülekannet. See protsess suurendab ekstraheerimise efektiivsust märkimisväärselt.
Suure läbilaskevõimega sonikaator UIP400MTP automaatproovivõtja viaalide katseklaasialusega
Teaduslikud tõendid: ultraheli töötlus parandab analüütilist jõudlust
Mitmed eelretsenseeritud uuringud on näidanud ultraheliga ekstraheerimise eeliseid HPLC töövoogudes.
Näiteks kasutati veeproovide pestitsiidijääkide seireks välja töötatud meetodis ultraheli töötlust (sonikeerimist) koos LC–MS/MS analüüsiga, et määrata karbarüülpestitsiidi kontsentratsioone. Selle lähenemise puhul ekstraheeriti veeproovid enne kromatograafilist analüüsi ultraheli toimel atsetonitriiliga. Meetod saavutas tugeva analüütilise jõudluse, sealhulgas saagised vahemikus 89,53% kuni 101,72%, mis kinnitab ultraheliga proovi ettevalmistuse protseduuri täpsust ja usaldusväärsust.
Ultraheliga ekstraheerimise etapp võimaldas analüütide tõhusat ülekannet vesimaatriksist orgaanilisse lahustisse, vähendades lahusti tarbimist ja kaotades vajaduse ulatuslike puhastusprotseduuride järele. Valideeritud analüütiline meetod näitas suurepärast lineaarsust, täpsust ja kvantifitseerimispiire, mis rõhutab ultraheli töötluse (sonikeerimise) tõhusust kaasaegsetes kromatograafilistes töövoogudes. (vrd Roudani et al., 2018)
Teises uuringus tutvustati ultraheliga toetatud maatriksi tahkefaasilist dispersiooni (UA-MSPD) oleuropeiini määramiseks oliivilehtedes HPLC analüüsi abil. Selle tehnika puhul segati taimepulber ja sorbent ning seejärel allutati need elueerimisetapi ajal ultrahelilainetele. Ultraheli tõhustas analüütide desorptsiooni sorbendi pinnalt, parandades samal ajal ka ekstraheerimist proovi maatriksist. (vrd Rashidipour and Heydari, 2018)
Optimeeritud ultraheliprotseduur andis märkimisväärseid analüütilisi paranemisi, sealhulgas:
- Lineaarsed kalibreerimiskõverad, mille R² = 0,9979
- Avastamispiirid kuni 0,03 µg mL⁻¹
- Saagised vahemikus 90,2% kuni 96,7%
Need tulemused kinnitavad, et ultraheliga toetatud ekstraheerimine mitte ainult ei kiirenda proovi ettevalmistust, vaid suurendab ka ekstraheerimissaagist võrreldes klassikaliste maatriksi tahkefaasilise dispersiooni meetoditega.
Sondtüüpi sonikaator UP200St HPLC proovide ettevalmistamiseks
Ultraheli abil proovide ettevalmistamise peamised eelised HPLC jaoks
Ultraheliekstraktsiooni üha laiem kasutuselevõtt analüütikalaboratooriumides tuleneb mitmest mõõdetavast eelisest.
- Suurem ekstraktsiooni efektiivsus
Akustiline kavitatsioon lõhub tahkeid maatrikseid ja parandab lahusti tungimist. See soodustab analüütide vabanemist ja suurendab saagist, eriti jälgkoguses esinevate ühendite puhul keerukates proovides. - Lühem proovide ettevalmistamise aeg
Ultraheliekstraktsioon võimaldab proovide ettevalmistamise sageli lõpule viia sekundite või minutitega. Näiteks UA-MSPD meetodis saavutati optimeeritud ultraheliekstraktsiooni parameetritega analüütide efektiivne saagis umbes 30 sekundi pikkuse ultraheli töötlusega (sonikeerimisega), mis näitab, kui oluliselt saab analüüsi töövoogusid kiirendada. - Väiksem lahustitarbimine
Kuna ultraheli parandab massiülekannet, on tavaliselt vaja väiksemaid lahustikoguseid. Väiksem lahustikasutus parandab laboratooriumi jätkusuutlikkust ja vähendab tegevuskulusid. - Parem korratavus
Ühtlane ultraheli energia jaotus tagab proovi järjepideva lõhkumise ja ekstraktsiooni kõigis kordusproovides, mis annab analüütilistes mõõtmistes parema täpsuse. - Ühilduvus kaasaegsete kromatograafiameetoditega
Ultraheliekstraktsioon sobib hõlpsasti kokku HPLC, UHPLC ja LC-MS süsteemidega, mistõttu sobib see suure läbilaskevõimega analüütilistesse keskkondadesse.
Fenoolsete ühendite HPLC kromatogramm Annona muricata lehtede ultraheli abil eraldatud ekstraktist, kasutades ultraheli homogenisaatorit UP400S.
(Uuring ja graafika: ©Nolasco-González et al., 2022)
Praktilised ultraheli töötluse lahendused HPLC proovide ettevalmistamiseks
Ultraheliekstraktsiooni rakendavate laboratooriumide jaoks pakuvad Hielscheri sonikaatorid täpset kontrolli selliste parameetrite üle nagu amplituud, aeg ja impulssrežiim. Seetõttu sobivad Hielscheri laborisonikaatorid eriti hästi analüütikalaboratooriumidele.
Valige oma HPLC proovidele sobivaim laborisonikaator
| Sonikaatori mudel | Eelised HPLC jaoks | Parim kasutus HPLC proovide ettevalmistamisel |
| VialTweeter mitme tuubi sonikaator |
• Kuni 10 suletud viaali samaaegne ultraheli töötlus identse ultraheli energiaga • Steriilne: ristsaastumist ei teki, sest proovid jäävad suletuks • Väga korratavad ekstraktsioonitingimused eri partiide vahel • Efektiivne kavitatsioon väikese mahuga analüütiliste proovide jaoks |
• Keskkonna-, toidu- või farmatseutiliste proovide suure läbilaskevõimega ettevalmistamine • Jälgkoguses esinevate analüütide ekstraktsioon enne HPLC, UHPLC või LC-MS analüüsi • Standardiseeritud töövood, mis nõuavad mitme proovi identset töötlemist |
| Mikroplaadi sonikaator UIP400MTP |
• Tervete mikroplaatide kontaktivaba ultraheli töötlus (96-süvendilised ja 384-süvendilised formaadid) • Ühtlane ultraheli energia jaotus kõigis süvendites • Võimaldab analüütiliste töövoogude automatiseerimist ja robotitega integreerimist • Suur läbilaskevõime koos amplituudi ja ultraheli töötluse aja täpse juhtimisega |
• Suure läbilaskevõimega UHPLC sõeluuringu töövood • Farmatseutiliste ühendite raamatukogud ja metaboloomika proovide ettevalmistamine • Plaadipõhine ekstraktsioon LC-MS või UHPLC analüütiliste töövoogude jaoks |
| Laborisonikaatorid mikrotipiga (otsene ultraheli töötlus) |
• Maksimaalne ultraheli intensiivsus maatriksi efektiivseks lõhkumiseks • Analüütide väga kiire ekstraktsioon tahketest, viskoossetest või heterogeensetest proovidest • Reguleeritavad amplituudi- ja impulsiparameetrid optimeeritud ekstraktsioonitingimuste jaoks • Suur kavitatsioonienergia parandab analüütide saagist ja ekstraktsioonisaagist |
• Ekstraktsioon rasketest maatriksitest, näiteks taimekoest, toiduproovidest või polümeeridest • Homogeniseerimine enne SPE-d, filtreerimist või vedelik–vedelik-ekstraktsiooni • Meetodi arendamine ultraheliga HPLC proovide ettevalmistamiseks |
| CupHorn (“suure intensiivsusega vann” keeduklaaside ja tuubide jaoks) |
• Kaudne ultraheli töötlus hoiab ära sondi saastumise • Ühtlane ultraheliväli mitme tuubi samaaegseks töötlemiseks • Ideaalne steriilsetele, ohtlikele või lenduvatele proovidele, mis peavad jääma suletuks • Lihtsustab käsitsemist, säilitades samal ajal tugeva kavitatsioonienergia |
• Mitme HPLC proovi paralleelne ekstraktsioon suletud tsentrifuugitorudes • Bioloogiliste, farmatseutiliste või keskkonnaproovide ettevalmistamine • Töövood, kus on nõutav saastevaba kaudne ultraheli töötlus |
Teaduslik tähtsus analüütilises keemias
Kuna analüütiline keemia liigub kiiremate ja jätkusuutlikumate laboritavade suunas, on ultraheli abil tehtav proovide ettevalmistus kujunenud võimsaks võimaluste loovaks tehnoloogiaks. Ultraheli töötlus (sonikeerimine) toetab kiirete analüütiliste meetodite arendamist, mille puhul on lahusti tarbimine väiksem, ekstraktsiooni efektiivsus parem ja valideerimisparameetrid töökindlad.
Ultraheli abil toimuvat ekstraktsiooni käsitleva kirjanduse kasvav maht näitab, et ultraheli töötlusega toetatud HPLC proovide ettevalmistus ei ole pelgalt mugavus – see on teaduslikult valideeritud lähenemisviis, mis parandab analüütilist jõudlust. Kombineerides ultraheli ekstraktsiooni kaasaegsete kromatograafiliste tehnikatega, saavad laborid saavutada jälgedena esinevate analüütide usaldusväärse avastamise üha keerukamates proovimaatriksites.
Ultraheli töötlusega täiustatud HPLC töövood
Analüütilise instrumentaariumi ja proovide ettevalmistamise tehnoloogiate pideva arengu tõttu mängib ultraheli ekstraktsioon tõenäoliselt kromatograafialaborites veelgi suuremat rolli. Selle võime töövooge sujuvamaks muuta, andmete kvaliteeti parandada ja keskkonnamõju vähendada sobib hästi kaasaegse analüütilise teaduse arenevate nõuetega.
Analüütilistele keemikutele ja tööstuslaboritele, kes soovivad HPLC proovide ettevalmistust optimeerida, pakub ultraheli ekstraktsioon end tõestanud, skaleeritavat ja teaduslikult töökindlat lahendust. Integreerides ultraheli töötluse (sonikeerimise) proovide ettevalmistuse rutiinsetesse protokollidesse, saavad laborid oluliselt parandada nii kromatograafilise analüüsi efektiivsust kui ka usaldusväärsust.
Disain, tootmine ja konsulteerimine – Saksamaal valmistatud kvaliteet
Hielscheri ultraheliseadmed on tuntud oma kõrgeima kvaliteedi ja disainistandardite poolest. Töökindlus ja lihtne kasutamine võimaldavad meie ultraheliseadmeid sujuvalt tööstusrajatistesse integreerida. Hielscheri ultraheliseadmed tulevad kergesti toime karmide tingimuste ja nõudlike keskkondadega.
Hielscher Ultrasonics on ISO sertifitseeritud ettevõte ja pöörab erilist tähelepanu kaasaegse tehnoloogiaga ning kasutajasõbralikkusega suure jõudlusega ultraheliseadmetele. Loomulikult vastavad Hielscheri ultraheliseadmed CE nõuetele ning täidavad UL-i, CSA ja RoHs-i nõudeid.
Kirjandus / viited
- M. Rashidipour and R. Heydari (2018): Ultrasonic-Assisted Matrix Solid-Phase Dispersion and High-Performance Liquid Chromatography as an Improved Methodology for Determination of Oleuropein from Olive Leaves. Analytical and Bioanalytical Chemistry Research 52, 2018. 307-316.
- Roudani, A.; Rachid, Mamouni; Nabil, Saffaj; Laknifli, A.; Gharby, Said; Noureddine, El Baraka; Bakka, Abdelhamid; Abdellah, Faouzi (2018): Method validation in the determination of Carbaryl pesticide in water samples using sonication and liquid chromatography-tandem mass spectrometry. JMES 8 (7), 2017. 2409-2420.
- Bimakr M., Ganjloo A., Zarringhalami S., Ansarian E. (2017): Ultrasound-assisted extraction of bioactive compounds from Malva sylvestris leaves and its comparison with agitated bed extraction technique. Food Science and Biotechnology 2017 Nov 30;26(6):1481-1490.
Korduma kippuvad küsimused
Mis on HPLC?
Kõrgefektiivne vedelikkromatograafia (HPLC) on analüütiline lahutusmeetod, mida kasutatakse segu komponentide tuvastamiseks, kvantifitseerimiseks ja puhastamiseks. HPLC-s kannab vedel liikuv faas lahustunud analüüte läbi statsionaarse faasiga täidetud kolonni kõrge rõhu all. Erinevused analüütide, statsionaarse faasi ja liikuva faasi vahelises vastastikmõjus põhjustavad ühendite lahutumise, kui need kolonnis liiguvad. Detektorid, näiteks UV-Vis, fluorestsents- või massispektromeetriadetektorid, mõõdavad lahutatud ühendeid, võimaldades täpset kvalitatiivset ja kvantitatiivset analüüsi.
Millised on vedelikkromatograafia tüübid?
Vedelikkromatograafiat saab liigitada analüüdi, statsionaarse faasi ja liikuva faasi vahel kasutatava lahutusmehhanismi järgi. Kõige levinumad tüübid on pöördfaaskromatograafia, kus mittepolaarne statsionaarne faas lahutab ühendeid hüdrofoobsete vastastikmõjude alusel; normaalfaaskromatograafia, mis kasutab polaarset statsionaarset faasi ja lahutab ühendeid polaarsuse järgi; ioonvahetuskromatograafia, kus laetud statsionaarsed faasid lahutavad analüüte ioonsete vastastikmõjude alusel; ning suuruseralduskromatograafia, mis lahutab molekule nende hüdrodünaamilise suuruse ja molekulmassi järgi. Täiendavate spetsialiseeritud meetodite hulka kuuluvad afiinsuskromatograafia ja hüdrofiilse vastastikmõju kromatograafia (HILIC), mis on suunatud kindlatele molekulaarsetele vastastikmõjudele või polaarsetele ühenditele.
Milliseid viaale kasutatakse HPLC jaoks?
HPLC-analüüsides kasutatakse tavaliselt väikeseid klaas- või polümeerviaale, mis on mõeldud ettevalmistatud proovide hoidmiseks enne nende sissepritsimist kromatograafiasüsteemi. Kõige levinum vorming on 2 mL automaatproovivõtja viaal, mis sobib enamiku HPLC-automaatproovivõtjatega. Need viaalid on tavaliselt valmistatud borosilikaatklaasist, et tagada keemiline vastupidavus ja minimaalne vastastikmõju lahustite ja analüütidega. Sõltuvalt proovi tüübist võivad viaalid sisaldada vahetükke (insert) väikese mahuga proovidele, keeratava korgi või kokkupressitava (crimp) sulguriga kinnitust ning proovi terviklikkuse säilitamiseks selliste materjalide nagu PTFE/silikoon septumeid.
Mis on automaatproovivõtja viaalid?
Automaatproovivõtja viaalid on spetsiaalsed proovianumad, mis on mõeldud HPLC- ja UHPLC-seadmete automaatsetele sissepritsesüsteemidele. Need sisaldavad ettevalmistatud proovilahust ning paigutatakse seadme automaatproovivõtja alusele, kus süsteem võtab automaatselt kindla mahu sissepritsimiseks kromatograafiakolonni. Automaatproovivõtja viaalid valmistatakse täpsete mõõtmetega, et tagada ühilduvus robotiseeritud proovivõtunõeltega ning vähendada proovi aurustumist, saastumist või adsorptsiooni. Nende konstruktsioon võimaldab reprodutseeritavat suure läbilaskevõimega analüüsi kaasaegsetes kromatograafialaborites.
Millised on HPLC etapid?
Kõrgefektiivse vedelikkromatograafia (HPLC) tüüpiline töövoog koosneb mitmest järjestikusest etapist, mis tagavad analüütide usaldusväärse lahutamise ja detekteerimise.
- Esiteks tehakse proovi ettevalmistus, et lahustada analüüt, eemaldada osakesed ning sageli ekstraheerida või kontsentreerida sihtühendeid proovimaatriksist. See etapp võib hõlmata filtreerimist, lahjendamist või ekstraktsioonitehnikaid, nagu ultraheliekstraktsioon, tahke faasi ekstraktsioon või vedelik–vedelik-ekstraktsioon.
- Seejärel paigutatakse ettevalmistatud proov HPLC-viaali ja laaditakse automaatproovivõtjasse. Automaatproovivõtja süstib täpse proovimahu voolavasse liikuvasse faasi.
- Liikuva faasi etapp transpordib seejärel sissepritsitud proovi läbi süsteemi kõrgsurvepumba abil. Liikuv faas kannab analüüdid läbi kromatograafiakolonni kontrollitud vooluhulgaga.
- Kromatograafiakolonnis toimub lahutumine. Kolonn sisaldab statsionaarset faasi, tavaliselt pakitud osakesi kindlate keemiliste omadustega. Kui analüüdid liiguvad läbi kolonni, interakteeruvad nad statsionaarse ja liikuva faasiga erinevalt, mistõttu eluuduvad nad erinevatel aegadel.
- Pärast lahutumist läbivad ühendid detektori, näiteks UV-Vis-, fluorestsents- või massispektromeetria detektori. Detektor mõõdab eluueruvate ühendite olemasolu ja kontsentratsiooni ning muudab signaali elektrooniliseks andmeteks.
- Lõpuks toimub andmete kogumine ja analüüs kromatograafiatarkvara abil. Süsteem koostab kromatogrammi, milles piigid vastavad üksikutele ühenditele. Piikide retentsiooniajad aitavad analüüte identifitseerida, piikide pindalad või kõrgused võimaldavad aga nende kontsentratsiooni kvantitatiivselt määrata.
Hielscher Ultrasonics toodab suure jõudlusega ultraheli homogenisaatoreid alates laboriseadmetest kuni tööstusliku suuruseni.