Kitiini ja kitosaani tootmine seentest

Ultraheli töötlus on väga tõhus meetod kitiini ja kitosaani vabastamiseks seenepõhistest allikatest, nagu seened. Kitiin ja kitosaan tuleb kvaliteetse biopolümeeri saamiseks järeltöötluses depolümeriseerida ja deatsetüleerida. Ultraheli abil toimuv depolümerisatsioon ja deatsetüleerimine on väga tõhus, lihtne ja kiire meetod, mille tulemusena saadakse kvaliteetseid kitosaane, millel on suur molekulmass ja parem biosaadavus.

Seentest pärinev kitiin ja kitosaan ultraheli töötluse abil

Söögiseeni ja ravimseeni, nagu Lentinus edodes (shiitake), Ganoderma lucidum (lingzhi ehk reishi), Inonotus obliquus (tšaaga), Agaricus bisporus (harilik šampinjon), Hericium erinaceus (siiloksa-näsasseen), Cordyceps sinensis (röövikuseen), Grifola frondosa (kähar sipelikseen), Trametes versicolor (Coriolus versicolor, Polyporus versicolor, kirju lehterseen) ja paljusid teisi seeneliike kasutatakse laialdaselt toiduna ning bioaktiivsete ühendite ekstraheerimiseks. Neid seeni ning töötlemisjääke (seenejäätmeid) saab kasutada kitosaani tootmiseks. Ultraheli töötlus mitte ainult ei soodusta kitiini vabanemist seene rakuseina struktuurist, vaid viib ka kitiini väärtuslikuks kitosaaniks muundumiseni ultraheli abil toimuva depolümerisatsiooni ja deatsetüleerimise kaudu.

Sonikeerimine soodustab kitiini depolümerisatsiooni ja deatsetüleerimist kitosaaniks

Intensiivne ultraheli töötlus sondtüüpi ultrahelisüsteemiga on meetod, mida kasutatakse kitiini depolümerisatsiooni ja deatsetüleerimise soodustamiseks, mis viib kitosaani tekkeni. Kitiin on looduslikult esinev polüsahhariid, mida leidub koorikloomade ja putukate väliskestades ning teatud seente rakuseintes. Kitosaan saadakse kitiinist, eemaldades kitiini molekulist atsetüülrühmad.

Ultraheli abil toimuv seenekitiini muundamine kitosaaniks

Kui kitosaani tootmisel kitiinist rakendatakse intensiivset ultraheli töötlust, sonikeeritakse kitiini suspensiooni suure intensiivsusega madalsageduslike ultraheli lainetega, tavaliselt vahemikus 20 kHz kuni 30 kHz. Protsessis tekib intensiivne akustiline kavitatsioon, mis tähendab vedelikus olevate mikroskoopiliste vaakumimullide teket, kasvu ja kollapsit. Kavitatsioon tekitab kavitatsioonimullide ümbritsevas vedelikus lokaalselt äärmiselt suuri nihkejõude, kõrgeid temperatuure (kuni mitu tuhat kraadi Celsiuse järgi) ja rõhke (kuni mitusada atmosfääri). Need äärmuslikud tingimused aitavad kaasa kitiinpolümeeri lagunemisele ja sellele järgnevale deatsetüleerimisele.

Kitiinide ja kitosaanide SEM-pildid kahest seeneliigist: a) kitiin liigist L. vellereus; b) kitiin liigist P. ribis; c) kitosaan liigist L.vellereus; d) kitosaan liigist P. ribis.
pilt ja uuring: © Erdoğan et al., 2017

Kitiini depolümerisatsioon ultraheli abil

Kitiini depolümerisatsioon toimub mehaaniliste jõudude, nagu mikrovoolamine ja vedelikujoad, ning kavitatsiooni käigus tekkivate vabade radikaalide ja teiste reaktiivsete osakeste esilekutsutud ultraheli poolt algatatud keemiliste reaktsioonide koosmõjul. Kavitatsiooni käigus tekkivad kõrgrõhulained panevad kitiiniahelad nihkepinge alla, mille tulemusena polümeer lõheneb väiksemateks fragmentideks.

Kitiini deatsetüleerimine ultraheli abil

Lisaks depolümerisatsioonile soodustab intensiivne ultraheli töötlus ka kitiini deatsetüülimist. Deatsetüülimine hõlmab atsetüülrühmade eemaldamist kitiini molekulist, mille tulemusel moodustub kitosaan. Intensiivne ultraheli energia, eelkõige kavitatsiooni käigus tekkivad kõrged temperatuurid ja rõhud, kiirendab deatsetüülimisreaktsiooni. Kavitatsiooni tekitatud reaktiivsed tingimused aitavad katkestada kitiini atsetüülsidemeid, mille tulemusel vabaneb äädikhape ja kitiin muundub kitosaaniks.
Kokkuvõttes tõhustab intensiivne ultraheli töötlus nii depolümerisatsiooni kui ka deatsetüülimist, andes vajaliku mehaanilise ja keemilise energia kitiini polümeeri lagundamiseks ning kitosaaniks muundamise hõlbustamiseks. See tehnika pakub kiiret ja tõhusat meetodit kitosaani tootmiseks kitiinist ning sellel on arvukalt rakendusi erinevates tööstusharudes, sealhulgas farmaatsias, põllumajanduses ja biomeditsiinitehnikas.

Tööstuslik kitosaani tootmine seentest võimsa ultraheli abil

Kaubanduslik kitiini ja kitosaani tootmine põhineb peamiselt mereätööstuse jäätmetel (nt kalapüük, karpide ja koorloomade koristamine jms). Erinevad toorainoallikad annavad erineva kvaliteediga kitiini ja kitosaani, mistõttu esinevad hooajalistest kalapüügi kõikumistest tingitud tootmis- ja kvaliteedikõikumised. Lisaks on seeneallikatest saadud kitosaanil väidetavalt paremad omadused, näiteks ühtlane polümeeri pikkus ja parem lahustuvus võrreldes mereallikatest pärit kitosaaniga. (vrd Ghormade et al., 2017) Ühtlase kitosaani tagamiseks on kitiini ekstraheerimisest seenaliikidest saanud stabiilne alternatiivne tootmisviis. Kitiini ja kitosaani tootmist seentest on ultraheliekstraheerimise ja deatsetüülimistehnoloogia abil võimalik saavutada lihtsalt ja usaldusväärselt. Intensiivne ultraheli töötlus lõhub rakustruktuure kitiini vabastamiseks ning soodustab massiülekannet vesilahustes, tagades suurema kitiinisaagise ja ekstraheerimise tõhususe. Järgnev ultraheli deatsetüülimine muundab kitiini väärtuslikuks kitosaaniks. Nii ultraheli kitiiniekstraktsiooni kui ka deatsetüülimist kitosaaniks saab lineaarselt skaleerida mis tahes kaubandusliku tootmismahuni.

Ultraheli töötlus intensiivistab seentest pärit kitosaani tootmist ning muudab tootmise tõhusamaks ja ökonoomsemaks.
(pilt ja uuring: © Zhu et al., 2019)

Ultraheli kitiini ja kitosaani deatsetüülimise uuringutulemused

Zhu et al. (2018) järeldavad oma uuringus, et ultraheli deatsetüülimine on osutunud otsustavaks läbimurdeks, muundades β-kitiini kitosaaniks 83–94% deatsetüülimisastmega alandatud reaktsioonitemperatuuridel. Vasakpoolsel pildil on SEM-kujutis ultraheliga deatsetüülitud kitosaanist (90 W, 15 min, 20 w/v% NaOH, 1:15 (g: mL) (pilt ja uuring: © Zhu et al., 2018)
Nende protokolli kohaselt valmistati NaOH lahus (20 w/v %) NaOH helveste lahustamisel deioniseeritud vees. Seejärel lisati leeliselahus tsentrifuugitorusse GLSP setele (0,5 g) tahke aine ja vedeliku suhtega 1:20 (g: mL). Kitosaan lisati NaCl-le (40 mL, 0,2 M) ja äädikhappele (0,1 M) lahuse mahusuhtega 1:1. Suspensioon allutati seejärel ultrahelile leebel temperatuuril 25°C 60 min jooksul, kasutades sondtüüpi ultraheli sonikaatorit (250W, 20kHz). (vrd Zhu et al., 2018)

Pandit et al. (2021) leidsid, et kitosaanilahuste lagunemiskiirust mõjutavad polümeeri lahustamiseks kasutatud happe kontsentratsioonid harva ning see sõltub suurel määral temperatuurist, ultrahelilainete intensiivsusest ja polümeeri lahustamiseks kasutatud keskkonna ioontugevusest. (vrd Pandit et al., 2021)

Teises uuringus kasutasid Zhu et al. (2019) fungaalse toorainena Ganoderma lucidum eoste pulbrit ning uurisid ultraheliga toetatud deatsetüleerimist ja töötlusparameetrite, nagu ultraheli töötluse kestus, tahke aine ja vedeliku suhe, NaOH kontsentratsioon ning kiirgusvõimsus, mõju kitosaani deatsetüleerituse astmele (DD). Kõrgeim DD väärtus saavutati järgmiste ultraheliparameetritega: 20 min ultraheli töötlust võimsusel 80W, 10% (g:ml) NaOH, 1:25 (g:ml). Ultraheliga saadud kitosaani pinna morfoloogiat, keemilisi rühmi, termilist stabiilsust ja kristallilisust uuriti SEM-i, FTIR-i, TG ja XRD abil. Uurimisrühm teatab ultraheliga toodetud kitosaani deatsetüleerituse astme (DD), dünaamilise viskoossuse ([η]) ja molekulmassi (Mv¯) märkimisväärsest paranemisest. Tulemused tõid esile, et seente ultraheliga deatsetüleerimise meetod on kitosaani väga tõhus tootmismeetod, mis sobib biomeditsiinilisteks rakendusteks. (vrd Zhu et al., 2019)

Parem kitosaani kvaliteet ultraheliga depolümeriseerimisel ja deatsetüleerimisel

Ultraheliga juhitavad kitiini / kitosaani ekstraheerimise ja depolümeriseerimise protsessid on täpselt kontrollitavad ning ultraheli protsessiparameetreid saab kohandada toorainele ja soovitud lõpptoote kvaliteedile (nt molekulmass, deatsetüleerituse aste). See võimaldab kohandada ultraheliprotsessi väliste teguritega ning seada optimaalsed parameetrid parema tulemuse ja tõhususe saavutamiseks.
Ultraheliga deatsetüleeritud kitosaan näitab suurepärast biosaadavust ja biosobivust. Kui ultraheliga valmistatud kitosaani biopolümeere võrreldakse biomeditsiiniliste omaduste poolest termiliselt saadud kitosaaniga, näitab ultraheliga toodetud kitosaan märkimisväärselt paranenud fibroblastide (L929 rakud) elumust ja tugevamat antibakteriaalset toimet nii Escherichia coli (E. coli) kui ka Staphylococcus aureus (S. aureus) vastu.
(vrd Zhu et al., 2018)

Skaneeriva elektronmikroskoopia (SEM) pildid 100× suurendusega: a) gladius, b) ultrahelitöödeldud gladius, c) β-kitiin, d) ultrahelitöödeldud β-kitiin ja e) kitosaan (allikas: Preto et al. 2017)

Suure jõudlusega ultraheliseadmed kitiini ja kitosaani töötlemiseks

Chitiini fragmenteerimine ja chitiini deatsetüleerimine chitosaaniks nõuab võimsaid ja töökindlaid ultraheliseadmeid, mis suudavad tagada suuri amplituude, pakuvad protsessiparameetrite täpset reguleeritavust ning mida saab kasutada 24/7 suure koormuse all ja nõudlikes keskkondades. Hielscher Ultrasonicsi tootevalik täidab need nõuded töökindlalt. Lisaks silmapaistvale ultraheli jõudlusele on Hielscheri ultrasonikaatoritel kõrge energiatõhusus, mis on oluline majanduslik eelis – eriti kommertsmahtudes suuremahulises tootmises.
Hielscheri ultrasonikaatorid on suure jõudlusega süsteemid, mida saab varustada lisaseadmetega, nagu sonotroodid, boosterid, reaktorid või läbivoolukambrid, et need vastaksid optimaalselt teie protsessi vajadustele. Digitaalse värvilise ekraani, ultraheli töötluse eelseadistamise võimaluse, integreeritud SD-kaardile toimuva automaatse andmesalvestuse, brauseri kaudu toimiva kaugjuhtimise ja paljude muude funktsioonidega tagavad Hielscheri ultrasonikaatorid parima protsessikontrolli ja kasutajasõbralikkuse. Koos töökindluse ja suure koormustaluvusega on Hielscheri ultraheli süsteemid teie töökindel tööhobune tootmises. Chitiini fragmenteerimine ja deatsetüleerimine nõuab võimsat ultraheli, et saavutada soovitud muundumine ja kvaliteetne lõplik chitosaani toode. Eriti chitiinihelveste fragmenteerimiseks ning depolümerisatsiooni / deatsetüleerimise etappideks on otsustava tähtsusega suured amplituudid ja kõrgendatud rõhk. Hielscher Ultrasonicsi tööstuslikud ultraheliprotsessorid tagavad hõlpsasti väga suured amplituudid. Kuni 200µm amplituude saab pidevalt kasutada 24/7 töörežiimis. Veelgi suuremate amplituudide jaoks on saadaval kohandatud ultraheli sonotroodid. Hielscheri ultraheli süsteemide võimsus võimaldab tõhusat ja kiiret depolümerisatsiooni ning deatsetüleerimist ohutus ja kasutajasõbralikus protsessis.

Ultraheli abil täiustatud sünergiline chitiini töötlus

Traditsioonilise keemilise ja ensümaatilise chitiini deatsetüleerimise puuduste (nt madal tõhusus, suur energiakulu, pikk töötlusaeg, toksilised lahustid) ületamiseks on suure intensiivsusega ultraheli integreeritud chitiini ja chitosaani töötlusse. Suure intensiivsusega ultraheli töötlus ja sellest tulenevad akustilise kavitatsiooni efektid põhjustavad polümeeriahelate kiiret lõhustumist ning vähendavad polüdispersiivsust, edendades seeläbi chitosaani sünteesi. Lisaks intensiivistavad ultraheli nihkejõud massiülekannet lahuses, nii et keemilised, hüdrolüütilised või ensümaatilised reaktsioonid tugevnevad. Ultraheli chitiinitöötlust saab kombineerida juba olemasolevate chitiini töötlemise tehnikatega, nagu keemilised meetodid, hüdrolüüs või ensümaatilised protseduurid.

Ultraheli abil toetatud keemiline deatsetüleerimine ja depolümerisatsioon

Kuna chitiin on mittereaktiivne ja lahustumatu biopolümeer, peab see läbima demineraliseerimise, deproteiniseerimise ning depolümerisatsiooni / deatsetüleerimise protsessietapid, et saada lahustuvat ja biosaadavat chitosaani. Need protsessietapid hõlmavad töötlemist tugevate hapetega, nagu HCl, ja tugevate alustega, nagu NaOH ja KOH. Kuna need tavapärased protsessietapid on ebatõhusad, aeglased ja nõuavad palju energiat, parandab protsessi intensiivistamine ultraheli töötlusega chitosaani tootmist oluliselt. Võimsa ultraheli kasutamine suurendab chitosaani saagist ja kvaliteeti, lühendab protsessi päevadelt mõnele tunnile, võimaldab leebemaid lahusteid ja muudab kogu protsessi energiatõhusamaks.

Ultraheli abil parandatud chitiini deproteiniseerimine

Vallejo-Dominguez et al. (2021) leidsid oma kitiini deproteiniseerimise uuringus, et „ultraheli kasutamine biopolümeeride tootmisel vähendas nii kitiini valgusisaldust kui ka osakeste suurust. Ultraheli abil toodeti kõrge deatsetüleerumisastmega ja keskmise molekulmassiga kitosaani.“

Ultraheli hüdrolüüs kitiini depolümerisatsiooniks

Keemilises hüdrolüüsis kasutatakse kitiini deatsetüleerimiseks kas happeid või leeliseid, kuid laiemalt on kasutusel leeliseline deatsetüleerimine (nt naatriumhüdroksiid NaOH). Happeline hüdrolüüs on traditsioonilisele keemilisele deatsetüleerimisele alternatiivne meetod, mille puhul kasutatakse kitiini ja kitosaani depolümeriseerimiseks orgaaniliste hapete lahuseid. Happelise hüdrolüüsi meetodit kasutatakse enamasti siis, kui kitiini ja kitosaani molekulmass peab olema ühtlane. See tavapärane hüdrolüüsiprotsess on tuntud kui aeglane ning energia- ja kulumahukas. Tugevate hapete, kõrgete temperatuuride ja rõhkude vajadus on tegurid, mis muudavad kitosaani hüdrolüütilise tootmisprotsessi väga kalliks ja ajamahukaks. Kasutatavad happed nõuavad järgnevaid töötlusetappe, nagu neutraliseerimine ja soolade eemaldamine.
Kui hüdrolüüsiprotsessi integreeritakse suure võimsusega ultraheli, saab kitiini ja kitosaani hüdrolüütilise lõhustamise temperatuuri- ja rõhunõudeid oluliselt vähendada. Lisaks võimaldab ultraheli töötlus kasutada madalamaid happekontsentratsioone või leebemaid happeid. See muudab protsessi jätkusuutlikumaks, tõhusamaks, kuluefektiivsemaks ja keskkonnasõbralikumaks.

Ultraheli abil toimuv keemiline deatsetüleerimine

Kitiini ja kitosaani keemiline desintegreerimine ja deatsetüleerimine toimub peamiselt kitiini või kitosaani töötlemisel mineraalhapetega (nt vesinikkloriidhape HCl), naatriumnitritiga (NaNO₂) või vesinikperoksiidiga (H₂O₂). Ultraheli kiirendab deatsetüleerimist ja lühendab seeläbi reaktsiooniaega, mis on vajalik soovitud deatsetüleerumisastme saavutamiseks. See tähendab, et ultraheli töötlus lühendab vajalikku töötlusaega 12–24 tunnilt mõne tunnini. Lisaks võimaldab ultraheli töötlus kasutada oluliselt madalamaid kemikaalide kontsentratsioone, näiteks 40% (w/w) naatriumhüdroksiidi ultraheli töötlusega, samas kui ilma ultraheli kasutamiseta on vaja 65% (w/w).

Ultraheli ja ensüümidega deatsetüleerimine

Kuigi ensümaatiline deatsetüleerimine on leebe ja keskkonnasõbralik töötlusviis, on selle tõhusus ja kulud ebaökonoomsed. Ensüümide keeruka, töömahuka ja kalli järgneva eraldamise ning puhastamise tõttu lõpptootest ei rakendata ensümaatilist kitiini deatsetüleerimist tööstuslikus tootmises, vaid kasutatakse ainult teadusuuringute laboris.
Ultraheli eeltöötlus enne ensümaatilist deatsetüleerimist killustab kitiini molekule, suurendades seeläbi pindala ja muutades ensüümidele kättesaadavaks rohkem pinda. Suure jõudlusega ultraheli töötlus aitab parandada ensümaatilist deatsetüleerimist ja muudab protsessi ökonoomsemaks.