Kitiini ja Kitosani tootmine seentest

Ultraheliuur on väga tõhus meetod kitiini ja kitosaani vabastamiseks seenallikatest, näiteks seentest. Kvaliteetse biopolümomeetri saamiseks tuleb kitiin ja kitosaan deatsetüülida. Ultraheli abil deatsetülatsioon on väga tõhus, lihtne ja kiire tehnika, mille tulemuseks on kvaliteetsed chitosanid, millel on kõrge molekulmass ja suurepärane biosaadavus.

Kitiin ja kitosaan seentest

Toiduna kasutatakse laialdaselt söödavaid ja ravilikke seeni, nagu Lentinus edodes (shiitake), Ganoderma lucidum (Lingzhi või reishi), Inonotus obliquus (pässik), Agaricus bisporus (nööbi seened), Hericium erinaceus (lõvi karv), Cordyceps sinensis (röövel seen), Grifola frondosa (kana-of-the-wood), Trametes versicolor (Coriolus versicolor, Polyporus versicolor, kalkunisaba) ja paljud teised seeneliigid. Neid seeni ja jääkide töötlemist (seenejäätmeid) saab kasutada chitosani tootmiseks. Ultraheliuuring mitte ainult ei soodusta kitiini vabanemist seente rakuseina struktuurist, vaid juhib ka chitioni muundamist väärtuslikuks chitosaniks ultraheli depolümerisatsiooni kaudu.

Lokituse deatsetüülatsiooni on reklaamitud ultraheliga

kitiin, mis on N-atsetüülglunukosamiini polümeer (polü-(β-(1–4)-N-atsetüül-D-glükoosamiin), on looduslikult esinev polüsahhariid, mida leidub selgrootute, nagu koorikloom ja putukad, kalmaari ja seepia sisemine skelett ning seente rakuseinad. Seente rakuseinte struktuuris on kitiin vastutav seente rakuseina kuju ja jäikuse eest. Paljude rakenduste puhul muundatakse kitiin depolümerisatsiooniprotsessi kaudu nõrgestatud derivaadiks, mida nimetatakse kitosaaniks.
kitosaan on kõige levinum ja väärtuslikum kitiini derivaat. See on kõrge molekulmassiga polüsahhariid, mis on seotud b-1,4 glükosiidiga, mis koosneb N-atsetüül-glükoosamiinist ja glükoosamiinist.
Kitosaani saab tuletada keemilise või ensümaatilise abil n-deatsetüülimine. Keemiliselt juhitud deatsetüülimisprotsessis atsetüülrühm (R-NHCOCH₃) on kõrgetel temperatuuridel tugeva leelise poolt maha lõigatud. Teise võimalusena saab kitosaani sünteesida ensümaatilise deatsetülatsiooni teel. Kuid tööstusliku tootmise skaalal on eelistatud tehnika keemiline deatsetüülimine, kuna ensümaatiline deatsetüülimine on deatsetülaasi ensüümide kõrge hinna ja saadud madala kitosaani saagikuse tõttu oluliselt vähem tõhus. Ultraheliuuringut kasutatakse (1→4) keemilise lagunemise intensiivistamiseks / β-sidemega (depolümeriseerimine) ja kitiini deatsetüülimiseks kvaliteetse kitosaani saamiseks. Kui ultrahelitöötlust rakendatakse ensümaatilise deatsetüülimise eeltöötlusena, paraneb ka kitosaani saagikus ja kvaliteet.

Tööstuslik kitosaani tootmine seentest ultraheliga

Kaubanduslik kitiini ja kitosaani tootmine põhineb peamiselt meretööstuse jäätmetel (st kalapüük, karpkalade koristamine jne). Erinevad tooraineallikad põhjustavad erinevaid kitiini ja kitosaani omadusi, mis tulenevad tootmisest ja hooajalistest kalapüügi erinevustest tingitud kvaliteedi kõikumistest. Lisaks pakub seenallikatest saadud kitosaan teadaolevalt paremaid omadusi, nagu homogeenne polümeeri pikkus ja suurem lahustuvus võrreldes mereallikatest pärit kitosaaniga. (vrd Ghormade et al., 2017) Ühtlase kitosaani tarnimiseks on kitiini ekstraheerimine seenliikidest muutunud stabiilseks alternatiivseks tootmiseks. Seente kitiini ja tsitiosani tootmist saab ultraheli ekstraheerimise ja deatsetülatsioonitehnoloogia abil kergesti ja usaldusväärselt saavutada. Intensiivne ultrahelitöötlus häirib rakustruktuure kitiini vabastamiseks ja soodustab massiülekannet veelahust lahustites, et tagada hea kitiini saagikus ja ekstraheerimise efektiivsus. Järgnev ultraheli deatsetülatsioon muudab kitiini väärtuslikuks kitosaaniks. Nii ultraheli kitiini ekstraheerimist kui ka deatsetüülimist chitosanile saab lineaarselt skaleerida mis tahes kaubandusliku tootmistasemeni.

Ultrahelitöötlus intensiivistab seente tštosaani tootmist ja muudab tootmise tõhusamaks ja ökonoomsemaks.
(pilt ja uuring: © Zhu jt, 2019)

Väga tõhus tšitosaani süntees ultrahelitöötluse kaudu

Traditsioonilise keemilise ja ensümaatilise kitiini deatseetlüsatsiooni puuduste (st madala efektiivsuse, kõrge energiakulu, pikk töötlemisaeg, toksilised lahustid) ületamiseks on kitiini ja kitosaani töötlemiseks integreeritud suure intensiivsusega ultraheli. Suure intensiivsusega ultrahelitöötlus ja sellest tulenev akustilise kavitatsiooni mõju põhjustavad polümeerahelate kiiret käänet ja vähendavad polüdispersitsust, soodustades seeläbi kitosaani sünteesi. Lisaks intensiivistavad ultraheli nihejõud lahuses massiülekannet, nii et paraneb keemiline, hüdrolüütiline või ensümaatiline reaktsioon.

Ultraheli abil keemiline deatsetüülimine ja depolümeriseerimine

Kuna kitiin on mittereageeriv ja lahustumatu biopolümeer, peab see lahustuva ja bioatüssiivse tštosaani saamiseks läbima demineraliseerimise, deproteiniseerimise ja depolümerisatsiooni / deatsetüülimise protsessietapid. Need protsessietapid hõlmavad tugeva happega ravi, nagu HCl ja tugevad alused nagu NaOH ja KOH. Kuna need tavapärased protsessietapid on ebaefektiivsed, aeglased ja nõuavad suuri energiaid, parandab protsessi intensiivistamine ultrahelitöötluse teel märkimisväärselt chitosani tootmist. Võimsus ultraheli rakendamine suurendab kitosaani saagikust ja kvaliteeti, vähendab protsessi päevadest mõne tunnini, võimaldab kergemaid lahusteid ja muudab kogu protsessi energiatõhusamaks.

Chitini ultraheli täiustatud deproteiniseerimine

Vallejo-Dominguez jt (2021) leidsid kitiini deproteinisatsiooni uurimisel, et "ultraheli kasutamine biopolümeeride tootmiseks vähendas nii valgusisaldust kui ka kitiini osakeste suurust. Suure deatsetüülimiskraadi ja keskmise molekulmassiga kitosaan toodeti ultraheli abil.

Ultraheli hüdrolüüs chitiini depolümerisatsiooniks

Keemilise hüdrolüüsi puhul kasutatakse kitiini deatsetüütimiseks kas happeid või leelisi, kuid leelise deatsetüülimist (nt naatriumhüdroksiid NaOH) kasutatakse laialdasemalt. Happe hüdrolüüs on vahelduv meetod traditsioonilisele keemilisele deatsetüülimisele, kus chitiini ja kitosaani depolümeriseerimiseks kasutatakse orgaanilisi happelahuseid. Happe hüdrolüüsi meetodit kasutatakse enamasti siis, kui kitiini ja kitosaani molekulmass peab olema homogeenne. Seda tavapärast hüdrolüüsiprotsessi nimetatakse aeglaseks ja energia- ja kulumahukaks. Tugevate hapete, kõrgete temperatuuride ja rõhkude nõue on tegurid, mis muudavad hüdrolüütilise kitosaani protsessi väga kulukaks ja aeganõudvaks protseduuriks. Kasutatavad happed vajavad järgnevaid protsesse, nagu neutraliseerimine ja soolamine.
Suure võimsusega ultraheli integreerimisega hüdrolüüsiprotsessi saab kitiini ja kitosaani hüdrolüütilise lõhustumise temperatuuri ja rõhu nõudeid oluliselt vähendada. Lisaks võimaldab ultrahelitöötlus vähendada happe kontsentratsiooni või kasutada kergemaid happeid. See muudab protsessi jätkusuutlikumaks, tõhusamaks, kulutõhusamaks ja keskkonnasõbralikumaks.

Ultraheli abil keemiline deatsetüülimine

Kitiini ja kitosaani keemiline lagunemine ja deatsetülatsioon saavutatakse peamiselt kitiini või kitosaani töötlemisel mineraalhapetega (nt soolhape HCl), naatriumnitritiga (NaNO).₂) või vesinikperoksiid (H₂O₂). Ultraheli parandab deatsetülatsioonikiirust, lühendades seeläbi reaktsiooniaega, mis on vajalik deatsetülatsiooni sihipärase astme saamiseks. See tähendab, et ultrahelitöötlus vähendab nõutavat töötlemisaega 12-24 tundi mõne tunnini. Lisaks võimaldab ultrahelitöötlus oluliselt vähendada keemilisi kontsentratsioone, näiteks 40% (w / w) naatriumhüdroksiidi ultrahelitöötluse abil, samas kui 65% (w / w) on vajalik ilma ultraheli kasutamiseta.

Ultraheli-ensümaatiline deatsetüülimine

Kuigi ensümaatiline deatsetüülimine on kerge, keskkonnasõbraliku töötlemisvormiga, on selle tõhusus ja kulud ebamajanduslikud. Ensüümide keerulise, töömahuka ja kuluka järgneva isolatsiooni ning lõpptootest puhastamise tõttu ei rakendata ensümaatilise kitiini deatsetülatsiooni kaubanduslikus tootmises, vaid kasutatakse ainult teadusuuringute laboris.
Ultraheli eeltöötlus enne ensümaatilise deatsematlütatsiooni fragmente chitiini molekulid, suurendades seeläbi pindala ja muutes ensüümidele rohkem pinda kättesaadavaks. Suure jõudlusega ultrahelitöötlus aitab parandada ensümaatilist deatsetüülimist ja muudab protsessi ökonoomsemaks.

Ultraheli kitiini ja kitosaani deatsetüülimise uurimistulemused

Zhu jt (2018) järeldavad oma uuringus, et ultraheli deatsetülatsioon on osutunud oluliseks läbimurdeks, muutes β-kitiini chitosaniks 83–94% deatsetüülimisega vähendatud reaktsioonitemperatuuril. Vasakul pildil on SEM-pilt ultraheli deatsetüülitud kitosaanist (90 W, 15 min, 20 w/ v% NaOH, 1:15 (g: mL) (pilt ja uuring: © Zhu jt, 2018)
Oma protokollis valmistati NaOH lahus (20 w/v %), lahustades NaOH helvesed DI vees. Seejärel lisati leeliselahus GLSP settetele (0,5 g) tahke vedeliku suhtega 1:20 (g: ml) tsentrifuugitorusse. Chitosan lisati NaCl-ile (40 ml, 0,2 M) ja äädikhappele (0,1 M) 1: 1 lahuse mahu suhtega. Seejärel tehti suspensioonile ultraheli kergel temperatuuril 25 °C 60 minuti jooksul, kasutades sondi tüüpi ultraheliatorit (250W, 20kHz). (vrd Zhu et al., 2018)
Pandit jt (2021) leidsid, et kitosaanilahuste lagunemise kiirust mõjutavad harva polümeeri lahustumiseks kasutatava happe kontsentratsioonid ja see sõltub suuresti polümeeri lahustamiseks kasutatava meedia temperatuurist, intensiivsusest ja ioonilisest tugevusest. (vrd Pandit et al., 2021)

Teises uuringus kasutas Zhu jt (2019) seente toorainena Ganoderma lucidum spoori pulbreid ja uuris ultraheli abil hüüetavat deatsetülatsiooni ja selliste töötlemisparameetrite mõju nagu ultrahelitöötlusaeg, tahke ja vedeliku suhe, NaOH kontsentratsioon ja kiiritusvõimsus kirtosaani diaatsetüüli (DD) astmele. Kõrgeim DD väärtus saadi järgmistel ultraheli parameetritel: 20 min ultrahelitöötlus 80W juures, 10% (g:ml) NaOH, 1:25 (g:ml). Ultraheli saadud kitosaani pinna morfoloogiat, keemilisi rühmi, termilist stabiilsust ja kristallilisust uuriti SEM, FTIR, TG ja XRD abil. Uurimisrühm teatab ultraheli toodetud kitosaani deatsetüülimise (DD), dünaamilise viskoossuse ([η]) ja molekulmassi (Mv ̄) olulisest paranemisest. Tulemused rõhutasid seente ultraheli deatsetülatsiooni tehnikat, mis on väga tugev kitosaani tootmismeetod, mis sobib biomeditsiinilisteks rakendusteks. (vrd Zhu et al., 2019)

SEM-pildid kitiinidest ja kitosaanidest kahest seeneliigist: a) Kitiin L. vellereusest; b) Kitiin P. ribisest; c) Chitosan L.vellereusest; d) chitosan P. ribis.
pilt ja uuring: © Erdoğan jt, 2017

Suurepärane chitosani kvaliteet ultraheli deatsetüülimisega

Ultrahelipõhised kitiini / kitosaani ekstraheerimise ja depolümerisatsiooni protsessid on täpselt kontrollitavad ja ultraheli protsessi parameetreid saab kohandada tooraine ja sihitud lõpptoote kvaliteediga (nt molekulmass, deatsetüülimise aste). See võimaldab kohandada ultraheliprotsessi väliste teguritega ja seada optimaalsed parameetrid suurepärase tulemuse ja tõhususe saavutamiseks.
Ultraheli deatsetüülitud kitosaan näitab suurepärast biosaadavust ja biosobivust. Kui ultraheli valmistatud kitosaani biopolümeere võrreldakse biomeditsiiniliste omaduste osas termiliselt saadud kitosaaniga, on ultraheli toodetud kitosaanil oluliselt paranenud fibroblasti (L929 rakk) elujõulisus ja suurenenud antibakteriaalne aktiivsus nii Escherichia coli (E. coli) kui ka Staphylococcus aureus (S. aureus).
(vrd Zhu et al., 2018)

Kuidas chitiini ultraheli ekstraheerimine ja deatsetülatsioon toimib?

Kui võimsuse ultraheli lained on paarid vedelikuks või lägaks (nt lahusti kitiinist koosnev suspensioon), liiguvad ultraheli lained läbi vedeliku, põhjustades vahelduvaid kõrgsurve / madala rõhu tsükleid. Madala rõhu tsüklite ajal tekivad minuti vaakummullid (nn kavitatsioonimullid), mis kasvavad mitme rõhutsükli jooksul. Teatud suuruses, kui mullid ei suuda rohkem energiat absorbeerida, lagunevad nad kõrgsurvetsükli ajal vägivaldselt. Mulli implosiooni iseloomustavad intensiivsed kavitatsioonilised (või sonomehaanilised) jõud. Need sonomehaanilised tingimused esinevad lokaalses kuumas kohas ja neid iseloomustavad väga kõrged temperatuurid ja rõhud vastavalt kuni 4000K ja 1000atm; samuti vastavad kõrge temperatuuri ja rõhu erinevused. Tekib furtehrmore, mikro-turbulentsid ja vedelad voolud kiirusega kuni 100 m / s. Kitiini ja kitosaani ultraheli ekstraheerimine seentest ja koorikloomadest, samuti kitiini depolümeriseerimine ja deatsetüülimine on peamiselt põhjustatud sonomehaanilistest mõjudest: agitatsioon ja turbulentsid häirivad rakke ja soodustavad massiülekannet ning võivad lõigata ka polümeerahelaid koos happeliste või leeliseliste lahustitega.
Kitiini ekstraheerimise tööpõhimõte ultraheli abil: Ultraheli ekstraheerimine katkestab tõhusalt seente rakustruktuuri ja vabastab rakusisesed ühendid rakuseinast ja raku sisemusest (st polüsahhariidid nagu kitiin ja kitosaan ning muud bioaktiivsed fütokemikaalid) lahustisse. Ultraheli ekstraheerimine põhineb akustilise kavitatsiooni tööpõhimõttel. Ultraheli / akustilise kavitatsiooni mõju on kõrge nihejõuga jõud, turbulentsid ja intensiivsed rõhuerinevused. Need sonomehaanilised jõud purustavad rakustruktuure, nagu kitiinsed seenerakkude seinad, soodustavad massiülekannet seente biomaterjali ja lahusti vahel ning põhjustavad kiire protsessi käigus väga suurt ekstraktisaagist. Lisaks soodustab ultrahelitöötlus ekstraktide steriliseerimist bakterite ja mikroobide tapmise teel. Mikroobide inaktiveerimine ultrahelitöötluse teel on rakumembraani hävitavate kavitatsioonijõudude, vabade radikaalide tootmise ja lokaliseeritud kuumutamise tulemus.
Depolümeriseerimise ja deatsetülatsiooni tööpõhimõte ultraheliuuringu kaudu: Polümeeriketid püütakse mulli ümber nihkeväljale ja polümeeri mähise ahela segmendid kokkuvariseva õõnsuse lähedal liiguvad suurema kiirusega kui kaugemal. Seejärel tekivad polümeeriahelas pinged polümeeri segmentide ja lahustite suhtelise liikumise tõttu ning need on piisavad lõhenemise tekitamiseks. Protsess on seega sarnane teiste lõikamisefektidega polümeerilahustes ~2° ja annab väga sarnaseid tulemusi. (vrd Price et al., 1994)

Suure jõudlusega ultraheli seadmed seente kitiini ja kitosani töötlemiseks

Skaneerimine elektronmikroskoopia (SEM) pilte suurendus 100 × a) gladiuse, b) ultraheli-töödeldud gladius, c) β-chitin, d) ultraheli-töödeldud β-chitin ja e) (Allikas: Preto et al. 2017)

Kitiini killustatus ja kitiini detüülimine kitosaanile nõuab võimsaid ja usaldusväärseid ultraheliseadmeid, mis võivad pakkuda suuri amplituudi, pakuvad täpset kontrollitavust protsessi parameetrite üle ja seda saab kasutada 24/7 raske koormuse all ja nõudlikes keskkondades. Hielscheri ultraheli tootevalik vastab nendele nõuetele usaldusväärselt. Lisaks silmapaistvale ultraheli jõudlusele on Hielscheri ultraheliatoritel suur energiatõhusus, mis on märkimisväärne majanduslik eelis. – eriti kui seda kasutatakse suuremahulises kaubanduslikus tootmises.
Hielscheri ultraheliatorid on suure jõudlusega süsteemid, mida saab varustada selliste tarvikutega nagu sonotroodid, võimendid, reaktorid või voolurakud, et sobitada oma protsessi vajadusi optimaalselt. Koos tugevuse ja suure kandevõimega on Hielscheri ultrahelisüsteemid teie usaldusväärne tööhobune tootmises. 
Kitiini killustatus ja deatsetülatsioon nõuab võimsat ultraheli, et saada sihitud muundamine ja kvaliteetne lõplik tšitosaanitoode. Eriti kitiinihelveste killustatuse ja depolümerisatsiooni / deatsetüülimise sammude jaoks on olulised suured amplituudid ja kõrgendatud rõhk. Hielscheri ultraheli tööstuslikud ultraheliprotsessorid pakuvad kergesti väga kõrgeid amplituudi. Kuni 200 μm amplituudi saab pidevalt käivitada 24/7 töös. Veelgi suuremate amplituudide jaoks on saadaval kohandatud ultraheli sonotroodid. Hielscheri ultrahelisüsteemide võimsus võimaldab tõhusat ja kiiret deatsetülatsiooni ohutus ja kasutajasõbralikus protsessis.
Alljärgnev tabel annab teile ülevaate meie ultrahelihitiste ligikaudse töötlemisvõimsusest: