Rakukultuuril põhinevad viirusvaktsiinid – Rakkude tõhus purustamine ultraheliga

Korduma kippuvad küsimused viiruspõhiste vaktsiinide tootmiseks kasutatava ultrahelilise rakkude purustamise kohta

Mis on rakkude purustamine ultraheliga?

Ultrahelil põhinev rakkude purustamine kasutab suure intensiivsusega ultraheli, tavaliselt sagedusvahemikus 20–30 kHz, et purustada rakumembraanid ja vabastada rakusisene materjal. Suure võimsusega ultrahelilained tekitavad vedelikus kavitatsioonimulle. Kui need mullid kokku varisevad, tekitavad nad tugevaid kohalikke nihkejõude ja mikrovoolusid, mis purustavad rakke mehaaniliselt ning soodustavad massiülekannet raku sisemuse ja ümbritseva keskkonna vahel. Vaktsiinitootmises kasutatakse seda viirusega nakatunud rakukultuuride lüüsimiseks ning rakusiseste ja membraaniga seotud viirusosakeste vabastamiseks saagiks.

Miks kasutada viiruste eraldamiseks ultraheli asemel keemilist või ensümaatilist lüüsi?

Ultrahelitöötlus toimib puhtalt mehaaniliste jõudude abil. Ei ole vaja detergente, lüsoüümi, proteinaasi K ega muid lüüsireaktiive, mis võiksid lüsaati muuta, segada järgnevat puhastamist või mida tuleks enne edasist töötlemist eemaldada. Keemilised reagendid nõuavad tavaliselt aeganõudvat mitmeastmelist ettevalmistust, et vältida järgnevate analüüside ja muude järelkäsitlusetappide pärssimist. Ensümaatiline lagundamine nõuab pikki inkubatsiooniaegu ja annab sageli mittereplikatsiooni tulemusi. Ultrahelilüüs ühendab ka resuspensiooni, lagundamise ja ekstraheerimise etapid üheks pidevaks protsessiks. Kui teie protsess nõuab detergendi- või ensüümipõhist etappi, siis ultrahelitöötlus seda pigem tugevdab kui asendab: kavitatsioon nõrgendab membraane ja tagab kõigi rakkude ühtlase kokkupuute reagendiga.

Kuidas erineb ultrahelitöötlus mehaanilistest homogeniseerimismeetoditest?

Proovikujulised ultraheliseadmed edastavad ultrahelienergiat otseselt ja tõhusalt, kuna sonotrood on prooviga otseses kontaktis. Mehaaniliselt juhitavate homogeniseerimismeetodite puhul on energiaülekande tõhusus sageli madalam. Ultrahelitöötlemisel ei ole vaja tarbekaupu, nagu jahvatuskuulid või pöörlevad tihendid tootevoolus, ega pihusteid või kambreid, mis võivad viskoosse rakumassiga ummistuda, ning partiide vahel ei toimu ristsaastumist.

Kas ultrahelitöötlus võib viirust või antigeeni kahjustada?

See on peamine optimeerimisülesanne ja seda on võimalik kontrollida. Ultrahelitöötluse parameetreid reguleerides on võimalik sonikatsiooni mõju täpselt kontrollida: madal amplituud ja lühike sonikatsiooniaeg avaldavad väga õrna mõju, samas kui kõrged amplituudid, kõrgendatud rõhk ja pikem sonikatsiooniaeg toovad kaasa intensiivse töötluse. Kuna intensiivsust saab täpselt bioloogilise proovi järgi reguleerida, välditakse ületöötlemist, lagunemist ja saagikuse kaotust. Praktikas seatakse amplituud, viibeaeg ja läbiviimiste arv miinimumini, millega saavutatakse sihtmärgiks seatud lagundamiskiirus, samal ajal temperatuuri pidevalt jälgides ja jahutades.

Kas ultraheliravi vähendab saagi viskoossust?

Jah. Tihedad, suure rakutihedusega saagid on viskoossed ja neid on raske pumbata, kuna neis on vabanenud ja fragmenteerimata pereraku DNA. Ultrahelitöötlus lõikab ja fragmenteerib DNA-d ja RNA-d, lahustab rakumassi ning lagundab rakujäägid. Tulemuseks on homogeenne, pumbatav suspensioon, mis soodustab tõhusamalt selitamist, tsentrifuugimist ja kromatograafiat. DNA ja RNA fragmenteerimine kontrollitud ultrahelitöötluse abil on sama tehnoloogia hästi väljakujunenud laboratoorne rakendus.

Kas ma saan protsessi käivitada pidevas inline-režiimis?

Jah. Hielscheri ultraheliseadmed on mõeldud tööstuskeskkonnas ööpäevaringseks pidevaks tööks ning neid saab konfigureerida voolukambrite ja reaktoritega pidevaks inline-ultrahelitöötluseks, ringlusringideks või integreerimiseks tootmisplatvormidesse ja töötlemisliinidesse. Võimalik on nii ühekordne kui ka mitmekordne töötlemine.

Kuidas viia projekt laborist tootmisse?

Lineaarselt, lähtudes mõõdetavast energiasisendist. Kõiki Hielscheri ultrahelihomogenisaatoriga saadud ultrahelitöötlemise tulemusi on võimalik tööstuslikus tootmises lineaarselt suurendada suurema tootlikkuseni; laua-ultraheliseadmega välja töötatud ultrahelitöötlemise parameetreid saab otse üle kanda suurematele Hielscheri süsteemidele. Skaalustamise kriteeriumiks on mahuühiku kohta langev spetsiifiline energiasisend koos amplituudi, viibeaja ja temperatuuriga. Hielscheri protsessikonsultatsioon hõlmab soovitusi parameetrite optimeerimiseks (amplituud, spetsiifiline energia E/V, viibeaeg, temperatuuri- ja rõhureguleerimine), mis on seotud mõõdetava energiasisendiga.

Kas rakkude purustamine ultraheliga sobib puhasruumi- ja GMP-standarditele vastavaks tootmiseks?

Hielscheri ultraheliseadmeid saab hõlpsasti paigaldada puhasruumilaboritesse ja tootmisruumidesse. Korpused on valmistatud antibakteriaalsest plastikust või roostevabast terasest. Kõik vedelikuga kokkupuutuvad osad, nagu sonotroodid ja voolukambrid, on valmistatud titaanist või roostevabast terasest ning neid saab autoklaavida. Saadaval on spetsiaalsed voolukambriga reaktorid, mis vastavad kõrgetele CIP (clean-in-place) ja SIP (sterilize-in-place) nõuetele. Tööstusliku UIP-seeria andur on IP64-klassiga ja seda saab paigaldada nõudlikesse keskkondadesse, samal ajal kui generaator asub eemal. Kuna Hielscheri sonikaatorid muudavad elektrienergia mehaaniliseks võnkumiseks väga suure, ligikaudu 80–90% tõhususega alates voolupistikust kuni vedelikuni, saab anduri ehitada suletud korpustesse ilma õhutusrestideta ning sundjahutust, nagu suruõhk või vesi, ei ole vaja. See tähendab ka seda, et ükski jahutusaine ei puutu protsessiga kokku. Automaatne protsessidokumenteerimine toetab jälgitavust ja korratavust reguleeritud tootmises.

Kas ultrahelitöötlusega on võimalik viirust inaktiveerida ka inaktiveeritud vaktsiini valmistamiseks?

Jah. Võimsat ultraheli kasutatakse patogeenide, nagu bakterite ja viiruste, inaktiveerimiseks. Sobiva ultrahelidoosi ja -intensiivsuse korral on võimalik rakke ja mikroobe töödelda vastavalt protsessi eesmärgile, mistõttu sama platvormi abil saab teostada nii lüüsi saagi saamiseks kui ka inaktiveerimist. Ultrahelitöötluse ja kuumuse kombinatsioon, mida nimetatakse termosonikatsiooniks, võimaldab kiiremat steriliseerimist märkimisväärselt väiksema kuumuse intensiivsuse ja kestusega, mis on kasulik kuumustundlike ühendite, nagu valkude ja antigeenide, säilitamisel. Ultrahelipõhist inaktiveerimist kasutatakse üldjuhul koos väljakujunenud keemiliste inaktiveerimismeetoditega ning iga konkreetse viiruse puhul tuleb valideerida täielik inaktiveerimise kineetika.

Kas sama süsteemi saab kasutada ka saagikoristusejärgsetes töötlemisetappides?

Jah. Sama platvorm võimaldab antigeenide dispersiooni suspensioonidesse, polümeeridesse või liposomaalsetesse kapseldustesse, antigeenide ja alumiiniumipõhiste adjuvantide (nt Alhydrogel™) deagglomereerimist ja ühtlast jaotumist, vaktsiinide formuleerimist liposomidesse ja tahkete lipiidide nanokübemetesse, kontrollides täpselt kandja suurust, ning gaasistamise etappi enne ampullidesse või süstaldesse täitmist.