Rakukultuuripõhised viirusvaktsiinid – tõhus rakkude lõhustamine ultraheliga
Hielscheri sonikaatorid hõlbustavad viirusega nakatunud rakukultuuride (nt Vero) rakkude lõhustamist ja solubiliseerimist viiruse kogumiseks vaktsiinitootmises. Kasutage ära rakukultuuride töökindlat ja tõhusat lüüsi suure jõudlusega ultrahelitöötluse abil!
Rakkude lõhustamine viiruse kogumiseks rakukultuuripõhistes vaktsiinides
Rakukultuuripõhine vaktsiinitootmine, nt Vero, MDCK, EB66, CHO või PER.C6 rakuliinides, nõuab viiruse eraldamist kultuurist nakkustsükli lõpus. Sõltuvalt viirusest on suur osa kogutud viirusest rakuga seotud, kas rakusisene või seotud rakumembraaniga. Täielik ja õrn viiruse kogumine sõltub seega rakkude tõhusast lõhustamisest ja rakumassi solubiliseerimisest. Ultrahelilüüs on usaldusväärne ja pikka aega kasutusel olnud meetod rakkude lõhustamiseks ning sellele järgnevaks viiruste, viirusvalkude, DNA ja RNA vabastamiseks. Viirusega nakatunud rakukultuuride töötlemisel avab ultrahelitöötlus – suure intensiivsusega ultraheli rakendamine – rakud, eraldab viirusosakesed membraanidest ja rakujääkidest ning homogeniseerib saagi pumbatavaks, väikese viskoossusega suspensiooniks, mida saab otse suunata selitamisele, tsentrifuugimisele ja kromatograafiale.
Kuidas ultrahelitöötlus toimib?
Rakkude lõhustamine ultraheliga põhineb puhtalt mehaanilistel jõududel. Akustiline kavitatsioon tekitab intensiivset kohalikku nihet ja mikrovoolu, mis purustavad rakumembraane ning soodustavad massiülekannet raku sisemuse ja ümbritseva keskkonna vahel.
Ultrahelivaktsiinitootmise süsteem: Tööstuslik sonikaator UIP2000hdT roostevabast terasest reaktoriga
Millised on rakkude ultrahelilõhustamise eelised?
See toimemehhanism annab ultrahelitöötlusele otsustava eelise keemilise lüüsi ees: vaja pole puhastusaineid, lüsosüümi, proteinaas K-d ega muid lüüsireagente, mis võivad lüsaati muuta, segada järgnevat puhastamist või tuleb enne edasist töötlemist eemaldada. Ensümaatiline lõhustamine seevastu vajab pikka inkubeerimisaega ja annab sageli mittereprodutseeritavaid tulemusi. Kuna ultrahelitöötluse intensiivsust saab bioloogilisele proovile täpselt kohandada, välditakse ületöötlemist, lagunemist ja saagise kadu.
Rakendage ultrahelitöötlust, et:
- lõhustada ja lüüsida viirusega nakatunud rakke nii adhesiivsetes kui ka suspensioonkultuurides
- vabastada rakusiseseid ja membraaniga seotud viirusosakesi
- solubiliseerida rakumass ja vähendada saagi viskoossust
- homogeniseerida ja deaglomereerida rakujäägid hõlpsamaks selitamiseks
- dispergeerida viirusekogumid ühtlaseks suspensiooniks
- inaktiveerida patogeene kindlaksmääratud amplituudi, rõhu ja töötlusaja juures
- tõhustada puhastusaine- või ensüümipõhiseid lüüsietappe, kus neid vaja on
Tööstusliku mastaabiga rakkude lõhustamine ultraheliga: Sonikaator UIP6000hdT roostevabast terasest läbivoolukambriga viirusega nakatunud rakukultuuride pidevaks töötlemiseks.
Sonikaator UP400St läbivoolukambriga FC22K rakkude inline-lõhustamiseks
Miks peaksin viiruse kogumiseks kasutama ultrahelitöötlust?
Monovalentse rotaviiruse bulkmaterjali inline-töötlemise skeem. Bulkmaterjali töödeldi aseptiliselt otse kultiveerimisanumast (CF-10), see suunati peristaltilise pumba abil läbi sonikaatori läbivoolukambri, et lõhustada kõik allesjäänud rakujäägid. Ultrahelitöödeldud materjal selitati seejärel filtreerimisega, enne kui see paigutati stabiliseerimiseks vahemahutisse.
Uuring ja pilt: Langston et al., 2026.
Eelised
- protsessile täpselt reguleeritav
- keemiavaba, puhtalt mehaaniline lüüs
- puhas ja hügieeniline töötlemine, CIP/SIP-ühilduvad läbivoolukambrid
- väga hästi reprodutseeritav automaatse andmete logimisega
- lineaarne skaleerimine laborist tootmiseni
- lihtne ja ohutu käsitsemine, kaugjuhtimine brauseri kaudu
- töökindlad ja vastupidavad seadmed 24/7 tööks
- kõrge energiatõhusus, ligikaudu 80–90% pistikupesast vedelikku
Tüüpiline protsessi seadistus viiruse kogumiseks
- Kogumine ja kontsentreerimine. Koguge nakatunud rakukultuur (kogumissööde, rakud, mis on kraabitud fikseeritud kihiga või ühekordsetest bioreaktoritest, või tsentrifuugitud rakusetted, mis on resuspendeeritud puhvris).
- Konditsioneerimine. Reguleerige puhvrit, pH-d ja temperatuuri. Ultrahelitöötlus parandab ka lüüsipuhvri komponentide segunemist ja lahustumist, kui kasutatakse puhvri- või puhastusainepõhist etappi.
- Lõhustamine ultraheliga. Juhtige suspensioon läbi mantliga ja temperatuuri jälgimisega läbivoolukambri (partiitöö korral retsirkulatsioon, pideva inline-töötluse korral ühe- või mitmekordne läbimine). Seadke amplituud ja viibeaeg miinimumini, mis tagab sihtlõhustamismäära, et viirusantigeenid säiliksid.
- Valikuline inaktiveerimine. Rakendage kõrgemat amplituudi, tõstetud rõhku ja pikemat töötlusaega või termosonikeerimist patogeenide inaktiveerimiseks vastavalt vaktsiinistrateegiale.
- Järgnev töötlemine. Selitage, tsentrifuugige ja/või filtreerige nüüdseks väikese viskoossusega homogeenne lüsaat, millele järgnevad kromatograafia, kontsentreerimine ja formuleerimine.
Pärast kogumist: formuleerimine sama tehnoloogiaga
Sama Hielscheri platvorm, mis rakke lõhustab, hakkab hakkama ka vaktsiini formuleerimisetappidega. Ultrahelidispergeerimine ja deaglomereerimine annavad antigeenide, sealhulgas rakufragmentide ja valkantigeenide, ühtlased suspensioonid polümeerides või liposomaalsetes kapseldustes. Alumiiniumipõhised adjuvandid, näiteks Alhydrogel™, koosnevad pisikestest primaarosakestest, mis kalduvad kergesti agregeeruma; ultrahelidispergeerimine tagab antigeenide ja adjuvandi homogeense jaotuse, mis on eduka integreerimise jaoks vajalik. Hielscheri sonikaatoreid kasutatakse lisaks ravimite ja vaktsiinide formuleerimiseks liposoomidesse ja nanostruktuursetesse kandjatesse, näiteks tahketesse lipiid-nanoosakestesse, kandja suuruse täpse kontrolli, parema ravimilaengu ja suurema stabiilsusega. Valmis suspensiooni degaseerimine enne viaalidesse või süstaldesse villimist on veel üks tavapärane ultrahelietapp.
Lisateavet leiate siit: Ultraheli vaktsiinitootmises.
Ohutu, puhas ja reguleeritud tootmiseks valmis
- Vedelikuga kokku puutuvad osad titaanist või roostevabast terasest, autoklaavitavad
- Saadaval on CIP/SIP-ühilduvad läbivoolukambriga reaktorid
- Antibakteriaalsest plastist või roostevabast terasest korpused paigaldamiseks puhasruumi
- Automaatne, manipuleerimist avastav protsessidokumentatsioon SD-/USB-kaardil
- Pidev 24/7 töö, vähene hooldus, sundjahutuseta
- Ei mingeid kulumaterjaliks olevaid helmeid ega jahvatuskambreid, partiide vahel ristsaastumist ei teki
Disain, tootmine ja nõustamine – kvaliteet Made in Germany
Hielscheri ultrahelisonikaatorid on tuntud kõrgeima kvaliteedi ja disainistandardite poolest. Vastupidavus ja lihtne käsitsemine võimaldavad meie ultrahelisonikaatorite sujuvat integreerimist tööstusrajatistesse. Hielscheri ultrahelisonikaatorid tulevad kergesti toime karmide tingimuste ja nõudlike keskkondadega.
Hielscher Ultrasonics on ISO-sertifitseeritud ettevõte ja pöörab erilist tähelepanu suure jõudlusega ultrahelisonikaatoritele, mis on varustatud uusima tehnoloogiaga ja on kasutajasõbralikud. Loomulikult vastavad Hielscheri ultrahelisonikaatorid CE-nõuetele ning UL-i, CSA ja RoHS-i nõuetele.
Paigaldus: 2x UIP1000hdT (kumbki 1kW, 20kHz) ravimite tootmiseks
Korduma kippuvad küsimused rakkude ultrahelilõhustamise kohta viirusepõhiste vaktsiinide tootmises
Mis on rakkude lõhustamine ultraheliga?
Rakkude lõhustamine ultraheliga kasutab suure intensiivsusega ultraheli, tavaliselt vahemikus 20 kuni 30 kHz, et rakumembraanid purustada ja rakusisene materjal vabastada. Suure võimsusega ultrahelilained tekitavad vedelikus kavitatsioonimulle. Kui need mullid kollabeeruvad, tekitavad nad intensiivseid kohalikke nihkejõude ja mikrovoolu, mis lõhustavad rakke mehaaniliselt ning soodustavad massiülekannet raku sisemuse ja ümbritseva keskkonna vahel. Vaktsiinitootmises kasutatakse seda viirusega nakatunud rakukultuuride lüüsimiseks ning rakusiseste ja membraaniga seotud viirusosakeste vabastamiseks saaki.
Miks kasutada viiruse kogumiseks keemilise või ensümaatilise lüüsi asemel ultrahelitöötlust?
Ultrahelitöötlus toimib puhtalt mehaaniliste jõududega. Vaja pole puhastusaineid, lüsosüümi, proteinaas K-d ega muid lüüsireagente, mis võivad lüsaati muuta, segada järgnevat puhastamist või tuleb enne edasist töötlemist eemaldada. Keemilised reagendid nõuavad tavaliselt aeganõudvat mitmeetapilist ettevalmistust, et vältida järgnevate analüüside ja muude järeltöötlusetappide pärssimist. Ensümaatiline lõhustamine vajab pikka inkubeerimisaega ja annab sageli mittereprodutseeritavaid tulemusi. Ultrahelilüüs ühendab ka resuspendeerimise, lõhustamise ja ekstraheerimise etapid üheks pidevaks toiminguks. Kui teie protsess nõuab puhastusaine- või ensüümipõhist etappi, tõhustab ultrahelitöötlus seda, mitte ei asenda: kavitatsioon nõrgestab membraane ja parandab kõigi rakkude ühtlast kokkupuudet reagendiga.
Kuidas ultrahelitöötlus mehaanilise homogeniseerimise meetoditega võrreldes toimib?
Sondtüüpi sonikaatorid kannavad ultrahelienergia üle otse ja tõhusalt, sest sonotrood on otseses kontaktis proovi endaga. Mehaaniliselt töötavad homogeniseerimistehnikad annavad sageli väiksema energiaülekande tõhususe. Ultrahelitöötlus ei vaja kulumaterjaliks olevaid jahvatushelmeid ega pöörlevaid tihendeid tootevoos, düüse ega kambreid, mis võivad viskoosse rakumassiga ummistuda, ning partiide vahel ristsaastumist ei teki.
Kas ultrahelitöötlus võib viirust või antigeeni kahjustada?
See on peamine optimeerimisülesanne ja seda saab kontrollida. Ultrahelitöötluse parameetreid kohandades saab ultrahelitöötluse mõju täpselt juhtida: madal amplituud ja lühike ultrahelitöötlus mõjuvad väga õrnalt, kõrged amplituudid, tõstetud rõhk ja pikem töötlusaeg aga annavad intensiivse töötluse. Kuna intensiivsust saab bioloogilisele proovile täpselt kohandada, välditakse ületöötlemist, lagunemist ja saagise kadu. Praktikas seatakse amplituud, viibeaeg ja läbimiste arv miinimumini, mis tagab sihtlõhustamismäära, pideva temperatuurijälgimise ja jahutusega.
Kas ultrahelitöötlus vähendab saagi viskoossust?
Jah. Tihedad, suure rakutihedusega saagid on viskoossed ja raskesti pumbatavad vabanenud, fragmenteerimata peremeesraku DNA tõttu. Ultrahelitöötlus nihutab ja fragmenteerib DNA-d ja RNA-d ning solubiliseerib rakumassi ja deaglomereerib rakujäägid. Tulemuseks on homogeenne, pumbatav suspensioon, mis toidab selitamist, tsentrifuugimist ja kromatograafiat tõhusamalt. DNA ja RNA fragmenteerimine kontrollitud ultrahelitöötlusega on sama tehnoloogia väljakujunenud laborirakendus.
Kas ma saan protsessi läbi viia pidevas inline-režiimis?
Jah. Hielscheri sonikaatorid on mõeldud pidevaks 24/7 tööks tööstuskeskkondades ning neid saab konfigureerida läbivoolukambrite ja reaktoritega pidevaks inline-ultrahelitöötluseks, retsirkulatsioonisilmusteks või integreerimiseks tootmisskidesse ja töötlusliinidesse. Võimalik on nii ühekordne kui ka mitmekordne läbimine.
Kuidas ma laborist tootmisse skaleerin?
Lineaarselt, mõõdetava energiasisendi alusel. Kõiki Hielscheri ultrahelihomogenisaatoriga saadud ultrahelitöötluse tulemusi saab lineaarselt skaleerida suuremale läbilaskevõimele tööstuslikus tootmises; laua-sonikaatoriga välja töötatud ultrahelitöötluse parameetreid saab otse üle kanda suurematele Hielscheri süsteemidele. Skaleerimiskriteerium on ruumalaühiku kohta antav erienergia koos amplituudi, viibeaja ja temperatuuriga. Hielscheri protsessinõustamine hõlmab soovitusi parameetrite optimeerimiseks (amplituud, erienergia E/V, viibeaeg, temperatuuri- ja rõhukontroll), mis on seotud mõõdetava energiasisendiga.
Kas rakkude lõhustamine ultraheliga sobib puhasruumi- ja GMP-laadsesse tootmisse?
Hielscheri ultrahelisonikaatoreid saab hõlpsasti paigaldada puhasruumilaboritesse ja tootmisrajatistesse. Korpused on valmistatud antibakteriaalsest plastist või roostevabast terasest. Kõik vedelikuga kokku puutuvad osad, näiteks sonotroodid ja läbivoolukambrid, on valmistatud titaanist või roostevabast terasest ning neid saab autoklaavida. Saadaval on spetsiaalsed läbivoolukambriga reaktorid, mis vastavad rangematele CIP (clean-in-place) ja SIP (sterilize-in-place) nõuetele. Tööstusliku seeria UIP muundur vastab kaitseastmele IP64 ning selle saab paigaldada nõudlikesse keskkondadesse, samal ajal kui generaator asub eemal. Kuna Hielscheri sonikaatorid muudavad elektrienergia mehaaniliseks võnkumiseks väga suure, ligikaudu 80–90% kasuteguriga pistikupesast vedelikku, saab muundurit ehitada suletud korpustesse ilma ventilatsiooniavadeta ning sundjahutust, näiteks suruõhku või vett, pole vaja. See tähendab ka, et jahutusvedelik protsessiga kokku ei puutu. Automaatne protsessidokumentatsioon toetab jälgitavust ja reprodutseeritavust reguleeritud tootmises.
Kas ultrahelitöötlus võib viiruse inaktiveerida ka inaktiveeritud vaktsiini jaoks?
Jah. Võimsat ultraheli kasutatakse patogeenide, näiteks bakterite ja viiruste inaktiveerimiseks. Sobiva ultrahelitöötluse doosi ja intensiivsuse korral saab rakke ja mikroobe töödelda vastavalt protsessi eesmärgile, nii et sama platvorm teenib nii lüüsi kogumiseks kui ka inaktiveerimist. Ultrahelitöötluse ja kuumuse kombinatsioon, mida nimetatakse termosonikeerimiseks, pakub kiiremat steriliseerimiskiirust oluliselt väiksema termilise intensiivsuse ja kestusega, mis on eeliseks kuumustundlike ühendite, näiteks valkude ja antigeenide säilitamisel. Ultrahelil põhinevat inaktiveerimist kasutatakse üldiselt koos väljakujunenud inaktiveerimiskeemiaga ning täielik inaktiveerimiskineetika tuleb iga konkreetse viiruse puhul valideerida.
Kas sama süsteemi saab kasutada formuleerimisetappideks pärast kogumist?
Jah. Sama platvorm tegeleb antigeenide dispergeerimisega suspensioonidesse, polümeeridesse või liposomaalsetesse kapseldustesse, antigeenide ja alumiiniumipõhiste adjuvantide, näiteks Alhydrogel™, deaglomereerimise ja ühtlase jaotamisega, vaktsiinide formuleerimisega liposoomidesse ja tahketesse lipiid-nanoosakestesse kandja suuruse täpse kontrolliga ning degaseerimisetapiga enne viaalidesse või süstaldesse villimist.
Kirjandus / viited
- Langston J. W.; Carroll M.; Whalen M. M.; Jaw, T. M.; Rojas L. V.; Hertel C. C.; Gote V., Balasundaram W.; Serbzhinzhskiy D.; Kapre S.; Olave, I. A. (2026): Novel non-aqueous rotavirus vaccine: Formulated for thermostability and easy administration. Human Vaccines & Immunotherapeutics, 22(1), 2026.
- Mohsen, M.O., Rothen, D., Balke, I. et al. (2021): Neutralization of MERS coronavirus through a scalable nanoparticle vaccine. npj Vaccines 6, 107 (2021).
- Mohsen M.O., Balke I., Zinkhan S. et al. (2022): A scalable and highly immunogenic virus-like particle-based vaccine against SARS-CoV-2. Allergy Vol 77, Issue 1; 2022. 243–257.
- Brittney Mott; Sanjay Thamake; Jamboor Vishwanatha; Harlan P. Jones (2013): Intranasal delivery of nanoparticle-based vaccine increases protection against S. pneumoniae. J Nanopart Res (2013) 15:1646.
Hielscher Ultrasonics toodab suure jõudlusega ultrahelihomogenisaatoreid laborisuurusest kuni tööstusliku suuruseni.