Lisis por ultrasonidos: Ruptura celular & extracción

Estructura celular

Las células están protegidos por una membrana de plasma semi-permeable que consiste en una bicapa fosfo-lípido (bicapa también proteína-lípido; formada por lípidos hidrófobos y moléculas de fósforo hidrófilos con moléculas de proteína incrustadas) y crea una barrera entre los interiores de células (citoplasma) y el medio extracelular. Las células vegetales y células procariotas están rodeados por una pared celular. Debido a las múltiples capas de la pared celular gruesa de celulosa, las células vegetales son más difíciles de lisar que las células animales. El interior de la célula, tales como orgánulos, núcleo, mitocondria, se estabiliza por el citoesqueleto.
Por lisar las células, que está dirigido a la extracción y la separación de los orgánulos, proteínas, ADN, ARNm o otras biomoléculas.

Fig. 1: extracción por ultrasonidos de las células: la sección transversal microscópica (TS) del tallo apical de menta (Mentha piperita) muestra el mecanismo de las acciones durante la extracción por ultrasonidos a partir de células (ampliación 2000x) [recurso: Vilkhu et al. 2011]

métodos

Hay varios métodos para lisado de células, que se pueden dividir en métodos mecánicos y químicos, que incluyen el uso de detergentes o disolventes, la aplicación de alta presión, o el uso de un molino de perlas o de una prensa francés. La desventaja más problemático de estos métodos es el difícil control y ajuste de parámetros de proceso y de este modo el impacto.
Las principales desventajas de métodos de lisis comunes:

Tabla: Los métodos convencionales de lisis celular tienen importantes desventajas

Por el contrario, la sonicación es una herramienta muy eficaz y fiable para la desintegración celular que permite un control completo de los parámetros de sonicación. Esto asegura una alta selectividad en la liberación de materiales y pureza del producto. Balasundaram et al. 2009] Es adecuado para todo tipo de células y de fácil aplicación en pequeña y gran escala. Los ultrasonidos son fáciles de limpiar. Un homogeneizador ultrasónico siempre cuenta con la función de limpieza in situ (CIP) y esterilización in situ (SIP). El sonotrodo consiste en un cuerno de titanio macizo que se puede limpiar o enjuagar con agua o disolvente (dependiendo del medio de trabajo). El mantenimiento de los ultrasonidos se debe a su robustez casi insignificante.

lisis

Lisis es un proceso sensible. Durante la lisis de la protección de la membrana celular se destruye, sin embargo, la inactivación, la desnaturalización y la degradación de las proteínas extraídas por un entorno no fisiológica (desviación del valor de pH) debe ser evitado. Por lo tanto, en la lisis en general se lleva a cabo en una solución tampón. La mayoría de las dificultades surgen de la ruptura celular incontrolada que resulta en una liberación no directo de todo el material intracelular y / o la desnaturalización del producto diana.

La lisis por ultrasonidos

En general, la lisis de las muestras en el laboratorio llevará entre 15 segundos y 2 minutos. Como la intensidad de la sonicación es muy fácil de ajustar ajustando la amplitud del tiempo de sonicación y eligiendo el equipo adecuado, es posible alterar las membranas celulares muy suavemente o muy abruptamente, dependiendo de la estructura celular y del propósito de la lisis ( por ejemplo, la extracción de ADN requiere una sonicación más suave, la extracción completa de proteínas de las bacterias requiere un tratamiento de ultrasonido más intenso). La temperatura durante el proceso puede controlarse mediante un sensor de temperatura integrado y puede controlarse fácilmente mediante enfriamiento (baño de hielo o celdas de flujo con camisas de enfriamiento) o mediante sonicación en modo pulsado. Durante la sonicación en modo de pulso, los ciclos de ráfaga de sonicación cortos de 1-15 segundos de duración permiten la disipación de calor y el enfriamiento durante los periodos intermitentes más largos.
Todos los procesos de ultrasonido impulsada son completamente reproducible y escalable linealmente.

homogeneizadores ultrasónicos

Varios tipos de dispositivos ultrasónicos permiten la coincidencia de la meta preparación de la muestra y para asegurar la facilidad de uso y comodidad de uso. De tipo sonda ultrasonicators son los dispositivos más comunes en el laboratorio. Ellos son los más adecuados para la preparación de las pequeñas y medianas muestras con volúmenes de 0,1 ml hasta 1000 ml. Diferentes potencias y sonotrodos permiten adaptar el ultrasonicador al volumen de la muestra y el recipiente para obtener resultados más eficaces y eficientes sonicación. El dispositivo de sonda ultrasónica es la mejor opción cuando las muestras individuales tienen que ser preparados.

Si se tienen que preparar más muestras, por ejemplo, 8 viales de solución de células, dispositivos como el VialTweeter o un cuphorn ultrasónico son el homogeneizador más adecuado para la lisis. Varios viales son sonicados al mismo tiempo, con la misma intensidad. Esto ahorra no solo tiempo, sino que también garantiza el mismo tratamiento para todas las muestras, lo que hace que los resultados entre las muestras sean confiables y comparables. Además, se evita la contaminación cruzada al sumergir el sonotrodo ultrasónico (también conocido como sonda ultrasónica, bocina, punta o dedo). Debido a que se usan viales, se omite la limpieza que requiere mucho tiempo y la pérdida de muestra debido a la decantación de los recipientes.
Para volúmenes mayores, por ejemplo, para la producción comercial de los extractos celulares, los sistemas de ultrasonidos continuos con un reactor de célula de flujo son los más adecuados. El flujo continuo y uniforme del material procesado asegura una sonicación incluso. Todos los parámetros del proceso de desintegración ultrasónica se pueden optimizar y se ajustan a los requisitos de la aplicación y el material celular específico.

1. Preparación de la suspensión de células: los sedimentos celulares deben estar completamente suspendidos en una solución tampón por homogeneización (elija su solución tampón compatible con el análisis siguiente, por ejemplo, método de cromatografía específico). Añadir lisozimas y / u otros aditivos, si es necesario (que debe ser también compatible con medios de separación / purificación). Mezclar / homogeneizar la solución suavemente bajo sonicación suave hasta que se logra la suspensión completa.
2. Ultrasónica lisis: Colocar la muestra en un baño de hielo. Para la ruptura celular, someter a ultrasonidos la suspensión a 60-90 segundos ráfagas (utilizando el modo de impulsos de su ultrasonicador).
3. (., Por ejemplo, 10 min a 10.000 x g; a 4degC): de separación por centrifugación del lisado. Separar el sobrenadante del sedimento celular con cuidado. El sobrenadante es el lisado celular total. Después de la filtración del sobrenadante, se obtiene un fluido clarificado de la proteína celular soluble.

Las aplicaciones más comunes para ultrasonicators en la biología y la biotecnología son:

• la preparación del extracto de la célula
• Ruptura de levadura, bacterias, células vegetales, suave & tejido celular duro, el material nucleico
• La extracción de proteínas
• Preparación y aislamiento de enzimas
• La producción de antígenos
• la extracción de ADN y / o dirigido fragmentación
• preparación de liposomas