Hielscher – Tecnología de Ultrasonidos

Lisis por ultrasonidos: Ruptura celular & extracción

La desintegración celular o lisis es una parte común de la preparación diaria de muestras en los laboratorios de biotecnología. El objetivo de la lisis es interrumpir partes de la pared celular o la célula completa para liberar moléculas biológicas. El llamado lisado puede consistir, por ejemplo, en plásmidos, ensayos de receptores, proteínas, ADN, ARN, etc. Los siguientes pasos de la lisis son el fraccionamiento, el aislamiento de organelos y/o la extracción y purificación de proteínas. El material extraído (= lisado) tiene que ser separado y está sujeto a nuevas investigaciones o aplicaciones, por ejemplo, para la investigación proteómica. Los homogeneizadores ultrasónicos son una herramienta común para la lisis celular exitosa. Como la intensidad ultrasónica se puede nivelar ajustando los parámetros de proceso, la intensidad de sonicación óptima, de muy suave a muy dura, se puede ajustar individualmente para cada sustancia y medio para cumplir con los requisitos de la aplicación específica.

Estructura celular

Las células están protegidas por una membrana plasmática semipermeable que consiste en una bicapa fosfolípida (también bilayer proteína-lípido; formada por lípidos hidrofóbicos y moléculas de fósforo hidrófilo con moléculas de proteínas incrustadas) y crea una barrera entre el interior de la célula (citoplasma) y el entorno extracelular. Las células vegetales y las células procarióticas están rodeadas por una pared celular. Debido a las múltiples capas de pared celular gruesa de celulosa, las células vegetales son más difíciles de lisar que las células animales. El interior de la célula, como organelos, núcleo, mitocondria, es estabilizado por el citoesqueleto.
Mediante el lisado de las células, se pretende extraer y separar los orgánulos, proteínas, ADN, ARNm u otras biomoléculas.

Los ultrasonidos son una herramienta de uso común para la preparación de muestras de materia celular.

Fig. 1: Extracción ultrasónica de células: la sección transversal microscópica (ST) del tallo apical de la menta (Mentha piperita) muestra el mecanismo de acción durante la extracción ultrasónica de células (aumento 2000x)[recurso: Vilkhu et al. 2011].

Métodos

Existen varios métodos para lisar las células, que pueden dividirse en métodos mecánicos y químicos, que incluyen el uso de detergentes o disolventes, la aplicación de alta presión, o el uso de un molino de bolas o de una prensa francesa. La desventaja más problemática de estos métodos es el difícil control y ajuste de los parámetros del proceso y, por lo tanto, el impacto.
Las principales desventajas de los métodos de lisis comunes:

Diferentes técnicas de lisis

Mesa: Los métodos convencionales de lisis celular tienen grandes desventajas

Por el contrario, la sonicación es una herramienta muy eficaz y fiable para la desintegración celular que permite un control completo de los parámetros de sonicación. Esto asegura una alta selectividad en la liberación de materiales y pureza del producto. Balasundaram et al. 2009] Es adecuado para todo tipo de células y de fácil aplicación en pequeña y gran escala. Los ultrasonidos son fáciles de limpiar. Un homogeneizador ultrasónico siempre cuenta con la función de limpieza in situ (CIP) y esterilización in situ (SIP). El sonotrodo consiste en un cuerno de titanio macizo que se puede limpiar o enjuagar con agua o disolvente (dependiendo del medio de trabajo). El mantenimiento de los ultrasonidos se debe a su robustez casi insignificante.

lisis

La lisis es un proceso sensible. Durante la lisis se destruye la protección de la membrana celular, pero se debe evitar la inactivación, desnaturalización y degradación de las proteínas extraídas por un entorno no fisiológico (desviación del valor pH). Por lo tanto, en general la lisis se realiza en una solución tampón. La mayoría de las dificultades se deben a la interrupción incontrolada de las células, que da lugar a la liberación no intencionada de todo el material intracelular o a la desnaturalización del producto diana.

La lisis celular ultrasónica se puede utilizar para la preparación de muestras en el laboratorio y para la producción de grandes volúmenes. Haga clic para ampliar!

Fig. 1: Homogeneizador ultrasónico de 200 vatios de potencia UP200Ht con control digital y registro automático de datos para una lisis celular fiable y reproducible.

Lisis ultrasónica

Generalmente, la lisis de las muestras en el laboratorio toma entre 15 segundos y 2 minutos. Dado que la intensidad de la sonicación es muy fácil de ajustar mediante el ajuste de la amplitud del tiempo de sonicación, así como mediante la elección del equipo adecuado, es posible interrumpir las membranas celulares de forma muy suave o muy abrupta, dependiendo de la estructura celular y de la finalidad de la lisis (por ejemplo, la extracción del ADN requiere una sonicación más suave, la extracción completa de proteínas de las bacterias requiere un tratamiento de ultrasonido más intenso). La temperatura durante el proceso puede ser monitoreada por un sensor de temperatura integrado y puede ser fácilmente controlada por enfriamiento (baño de hielo o celdas de flujo con camisas de refrigeración) o por sonicación en modo pulsado. Durante la sonicación en modo pulso, los ciclos cortos de explosión de sonicación de 1-15 segundos de duración permiten la disipación de calor y el enfriamiento durante los períodos intermitentes más largos.
Todos los procesos impulsados por ultrasonidos son completamente reproducibles y linealmente escalables.

Homogeneizador ultrasónico VialTweeter para la preparación simultánea de muestras de hasta 10 tubos de ensayo. (Haga clic para ampliar!)

El dispositivo de ultrasonidos VialTweeter permite la preparación simultánea de muestras de hasta 10 viales en las mismas condiciones de proceso.

homogeneizadores ultrasónicos

Varios tipos de dispositivos ultrasónicos permiten alcanzar el objetivo de preparación de la muestra y garantizar la facilidad de uso y la comodidad de uso. Los ultrasonidos tipo sonda son los dispositivos más comunes en el laboratorio. Son ideales para la preparación de muestras pequeñas y medianas con volúmenes de 0.1mL hasta 1000mL. Diferentes tamaños de potencia y sonotrodos permiten adaptar el ultrasonido al volumen de la muestra y al recipiente para obtener los resultados de sonorización más efectivos y eficientes. El dispositivo de sonda ultrasónica es la mejor opción cuando hay que preparar muestras individuales.

Si hay que preparar más muestras, por ejemplo, 8 viales de solución celular, dispositivos como el VialTweeter o un cuphorn ultrasónico son los homogeneizadores más adecuados para la lisis. Varias ampollas se sondean al mismo tiempo, con la misma intensidad. Esto no sólo ahorra tiempo, sino que también garantiza el mismo tratamiento de todas las muestras, lo que hace que los resultados entre las muestras sean fiables y comparables. Además, se evita la contaminación cruzada por inmersión del sonotrodo ultrasónico (también conocido como sonda ultrasónica, cuerno, punta o dedo). Dado que se utilizan viales, se omiten la limpieza que requiere mucho tiempo y la pérdida de muestras debido a la decantación de los recipientes.
Para volúmenes mayores, por ejemplo para la producción comercial de extractos celulares, los sistemas de ultrasonidos continuos con un reactor de celda de flujo son los más adecuados. El flujo continuo y uniforme del material procesado asegura una sonicación uniforme. Todos los parámetros del proceso de desintegración por ultrasonidos pueden ser optimizados y ajustados a los requerimientos de la aplicación y al material celular específico.

Procedimiento ejemplar para el lisado ultrasónico de células bacterianas:

  1. Preparación de la suspensión celular: Los gránulos celulares deben estar completamente suspendidos en una solución tampón mediante homogeneización (elija una solución tampón compatible con el análisis siguiente, por ejemplo, un método de cromatografía específico). En caso necesario, añadir lisozimas y/u otros aditivos (también deben ser compatibles con medios de separación/purificación). Mezclar/ homogeneizar la solución suavemente bajo sonicación suave hasta que se logre la suspensión completa.
  2. Lisis ultrasónica: Colocar la muestra en un baño de hielo. Para la interrupción celular, sonique la suspensión a ráfagas de 60-90 segundos (usando el modo de pulso de su ultrasonido).
  3. Separación: Centrifugar el lisado (por ejemplo, 10 min. a 10.000 x g; a 4degC). Separar cuidadosamente el sobrenadante del sedimento celular. El sobrenadante es el lisado celular total. Después de la filtración del sobrenadante, se obtiene un líquido clarificado de la proteína celular soluble.



Las aplicaciones más comunes de los ultrasonidos en biología y biotecnología son:

  • Preparación del extracto celular
  • Interrupción de la levadura, bacterias, células vegetales, células blandas & tejido celular duro, material nucleico
  • Extracción de proteínas
  • Preparación y aislamiento de enzimas
  • Producción de antígenos
  • Extracción de ADN y/o fragmentación de objetivos
  • preparación de liposomas
Los homogeneizadores de ultrasonido de alta potencia como el UIP1000hd se utilizan para la interrupción y extracción de células en modo discontinuo o de flujo continuo. (Haga clic para ampliar!)

Sistemas ultrasónicos de sobremesa como el UIP1000hd (1kW) puede procesar grandes volúmenes de material biológico.

Las múltiples aplicaciones del ultrasonido se ramifican en los sectores de biotecnología, bioingeniería, microbiología, biología molecular, bioquímica, inmunología, bacteriología, virología, proteómica, genética, fisiología, biología celular, hematología y botánica.

Para la evaluación y optimización de las aplicaciones de los clientes, Hielscher Ultrasonics ofrece una solución totalmente equipada. Laboratorio de Procesos Ultrasónicos. Póngase en contacto con nosotros para más información!

Literatura/Referencias

  • Balasundaram, B.; Harrison, S.; Bracewell, D. G. (2009): Avances en las estrategias de liberación de productos e impacto en el diseño de bioprocesos. Tendencias en Biotecnología 27/8, 2009. pp. 477-485.
  • Vilkhu, K.; Manasseh, R.; Mawson, R.; Ashokkumar, M. (2011): Recuperación ultrasónica y modificación de ingredientes alimentarios. In: Feng/ Barbosa-Cánovas/ Weiss (2011): Tecnologías de Ultrasonido para Alimentos y Bioprocesamiento. Nueva York: Springer, 2011. pp. 345-368.

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