Sonicación para la lisis celular: ruptura celular y extracción
La lisis celular ultrasónica es una técnica de preparación de muestras ampliamente utilizada en los laboratorios biotecnológicos modernos. Su objetivo principal es romper las membranas celulares o las células enteras para liberar componentes intracelulares, como proteínas, ácidos nucleicos u orgánulos. En el trabajo diario de laboratorio, esto significa que la sonicación es un método habitual para la ruptura celular controlada y la extracción eficiente de biomoléculas. La principal ventaja de los sonicadores reside en su capacidad para modular con precisión parámetros críticos del proceso, como la intensidad de los ultrasonidos, el funcionamiento por pulsos y el control de la temperatura. Este control permite a los investigadores conseguir una lisis fiable y minimizar los daños térmicos o mecánicos en las biomoléculas sensibles, lo que da lugar a un proceso de extracción suave y, a la vez, muy eficiente.
Lisis celular con sonicadores
La lisis celular ultrasónica utiliza la cavitación acústica para romper las membranas celulares y liberar moléculas intracelulares. Hielscher Ultrasonics ofrece tanto el sonicador clásico de tipo sonda como sonicadores para múltiples muestras destinados al procesamiento estéril: el VialTweeter para múltiples tubos y viales y el sonicador de placas de 96 pocillos UIP400MTP para microplacas estándar.
Hielscher Ultrasonics suministra potentes sonicadores sin contacto para la preparación de muestras y el análisis clínico. El sonicador de placas multipocillo UIP400MTP, el VialTweeter, el CupHorn y el sonicador de flujo GDmini2 procesan las muestras en condiciones estériles.
Homogeneizadores ultrasónicos UP100H (100 vatios) y UP400St (400 vatios): sonicación para la lisis celular y la extracción.
Homogeneizadores ultrasónicos para la lisis celular y la extracción
| Tipo de equipo ultrasónico | Aplicación principal | Volumen de muestra | Uso típico | Ventajas | Modelos de ejemplo |
|---|---|---|---|---|---|
| Sonicadores de tipo sonda | Sonicación de una sola muestra | De 0,1 mL a ~1000 mL | Lisis celular, extracción de proteínas, fragmentación de ADN/ARN | Control preciso de la energía; diversos sonotrodos; óptimos para muestras pequeñas y medianas | UP100H, UP200St, UP400St |
| VialTweeter / CupHorn | Procesamiento en paralelo de múltiples viales sellados | 8–10 viales (~1–20 mL cada uno) | Lisis estandarizada de múltiples suspensiones celulares | Sonicación uniforme; evita la contaminación cruzada; resultados reproducibles | VialTweeter, CupHorn |
| Sonicador de placas de 96 pocillos | Sonicación de placas multipocillo y de microtitulación | Formato de microplaca | Cribado de alto rendimiento, proteómica, ensayos celulares | Sonicación simultánea y uniforme en todos los pocillos; ideal para flujos de trabajo con múltiples muestras | UIP400MTP |
| Reactores de celda de flujo | Sonicación continua para volúmenes mayores | >1 L, escalable | Ruptura celular a escala industrial, producción de extractos | Procesamiento continuo; escalable; control completo del proceso (amplitud, presión, temperatura) | UIP1000hdT, UIP2000hdT + celda de flujo |
| Sistemas de sonicación estéril / indirecta | Procesamiento de muestras sin contaminación | Depende del vial/tubo/microplaca | Muestras sensibles, entornos estériles, entornos sujetos a requisitos normativos | Sin contacto con la sonda; evita el arrastre de material entre muestras; mínimo esfuerzo de limpieza | VialTweeter, CupHorn, UIP400MTP |
Ventajas de utilizar la sonicación para la lisis celular
En comparación con otros métodos de lisis celular y extracción, la lisis celular ultrasónica presenta varias ventajas:
- Rapidez: La lisis celular y la extracción ultrasónicas constituyen un método rápido que puede romper las células en cuestión de segundos. Es mucho más rápido que otros métodos, como la homogeneización, la congelación y descongelación o la molienda con perlas.
- Eficiencia: La lisis celular y la extracción ultrasónicas pueden utilizarse para tratar muestras pequeñas, grandes o múltiples muestras a la vez, lo que las hace más eficientes que otros métodos que requieren procesar individualmente las muestras pequeñas.
- Sin productos químicos: La lisis celular y la extracción ultrasónicas constituyen un método no invasivo que no requiere el uso de productos químicos agresivos ni enzimas. Esto lo hace ideal para aplicaciones en las que debe mantenerse la integridad del contenido celular. Se puede evitar la contaminación no deseada de las muestras.
- Alto rendimiento de extracción: La lisis celular y la extracción ultrasónicas permiten obtener un alto rendimiento de extracción del contenido celular, incluidos ADN, ARN y proteínas. Esto se debe a que las ondas sonoras de alta frecuencia rompen las paredes celulares y liberan el contenido en la solución circundante.
- Control de la temperatura: Los sonicadores avanzados permiten controlar con precisión la temperatura de la muestra. Los sonicadores digitales de Hielscher están equipados con un sensor de temperatura conectable y software de monitorización de la temperatura.
- Reproducibilidad: Los protocolos de lisis celular ultrasónica pueden reproducirse fácilmente e incluso adaptarse a distintos volúmenes de muestra, mayores o menores, mediante un sencillo escalado lineal.
- Versatilidad: La lisis celular y la extracción ultrasónicas pueden utilizarse para extraer el contenido de una amplia variedad de tipos celulares, incluidos bacterias, levaduras, hongos, células vegetales y células de mamíferos. También pueden utilizarse para extraer distintos tipos de moléculas, como proteínas, ADN, ARN y lípidos.
- Preparación simultánea de numerosas muestras: Hielscher Ultrasonics ofrece varias soluciones para procesar cómodamente numerosas muestras en exactamente las mismas condiciones de proceso. Esto hace que la etapa de lisis y extracción en la preparación de muestras sea muy eficiente y ahorre tiempo.
- Facilidad de uso: Los equipos de lisis celular y extracción ultrasónicas son fáciles de usar y requieren una formación mínima. También son económicos, ya que suponen una única inversión y no requieren la compra recurrente de consumibles desechables. Esto los hace atractivos para una amplia variedad de investigadores y laboratorios.
En general, la lisis celular y la extracción ultrasónicas constituyen un método rápido, eficiente, versátil y controlable con precisión para extraer el contenido celular. Sus ventajas frente a otros métodos las convierten en una opción atractiva para una amplia variedad de aplicaciones de investigación e industriales.
Principio de funcionamiento de la lisis celular ultrasónica
La lisis celular y la extracción ultrasónicas utilizan ondas sonoras de alta frecuencia para romper las células y extraer su contenido. Las ondas sonoras crean cambios de presión en el líquido circundante, lo que provoca la formación y el colapso de pequeñas burbujas en un proceso conocido como cavitación. Estas burbujas generan fuerzas mecánicas localizadas de gran intensidad que pueden romper las células y liberar su contenido en la solución circundante.
La lisis celular con un sonicador suele incluir los siguientes pasos:
- La muestra se coloca en un tubo o recipiente con una solución tampón líquida.
- Se introduce una sonda ultrasónica en la muestra y se aplican ondas sonoras de alta frecuencia de aproximadamente 20-30 kHz.
- Las ondas ultrasónicas provocan oscilación y cavitación en el líquido circundante, generando fuerzas localizadas que rompen las células y liberan su contenido.
- La muestra se centrifuga o filtra para eliminar los restos celulares y se recoge el contenido extraído para su análisis posterior.
Desventajas de los métodos de lisis habituales
Durante su trabajo en el laboratorio, es posible que ya haya experimentado las dificultades de la lisis celular con protocolos tradicionales de lisis mecánica o química.
- Lisis mecánica: Los métodos de lisis mecánica, como la trituración con mortero y mano de mortero o la homogeneización con una prensa francesa, un molino de perlas o un sistema de rotor-estator, suelen carecer de opciones de control y ajuste precisos. Esto significa que la molienda y la trituración pueden generar rápidamente calor y fuerzas de cizallamiento capaces de dañar la muestra y desnaturalizar las proteínas. También pueden requerir mucho tiempo y grandes cantidades de material de partida.
- Lisis química: Los métodos de lisis química, como la lisis con detergentes, pueden dañar la muestra al romper la bicapa lipídica y desnaturalizar las proteínas. También pueden requerir varios pasos y dejar contaminantes residuales que interfieran con las aplicaciones posteriores. Encontrar la dosis óptima de detergente supone un reto adicional.
- Ciclos de congelación y descongelación: Los ciclos de congelación y descongelación pueden provocar la ruptura de las membranas celulares, pero los ciclos repetidos también pueden causar la desnaturalización y degradación de las proteínas. Este método también puede requerir múltiples ciclos, lo que puede llevar mucho tiempo y a menudo da lugar a rendimientos menores.
- Lisis enzimática: Los métodos de lisis enzimática pueden ser específicos para determinados tipos celulares y requerir varios pasos, por lo que llevan mucho tiempo. También generan residuos y requieren una optimización cuidadosa para evitar la degradación de la muestra. Los kits de lisis enzimática suelen ser caros. Si su procedimiento actual de lisis enzimática ofrece resultados insuficientes, puede aplicarse la sonicación como método sinérgico para intensificar la ruptura celular.
A diferencia de los métodos convencionales de lisis celular mecánica y química, la sonicación es una herramienta muy eficiente y fiable para la desintegración celular que permite controlar por completo los parámetros de sonicación. Esto garantiza una elevada selectividad en la liberación de materiales y una alta pureza del producto. [cf. Balasundaram et al., 2009]
Es adecuada para todos los tipos celulares y puede aplicarse fácilmente a pequeña y gran escala – siempre en condiciones controladas. Los sonicadores son fáciles de limpiar. Un homogeneizador ultrasónico siempre dispone de funciones de limpieza in situ (CIP) y esterilización in situ (SIP). El sonotrodo consiste en una bocina maciza de titanio que puede limpiarse con un paño o enjuagarse con agua o disolvente (según el medio de trabajo). Gracias a su robustez, las necesidades de mantenimiento de los sonicadores son prácticamente insignificantes.
Lisis ultrasónica y ruptura celular
Por lo general, la lisis de muestras en el laboratorio tarda entre 15 segundos y 2 minutos. Como la intensidad de la sonicación puede ajustarse muy fácilmente mediante la amplitud y el tiempo de sonicación, así como mediante la elección del equipo adecuado, es posible romper las membranas celulares de forma muy suave o muy brusca, según la estructura celular y el objetivo de la lisis (por ejemplo, la extracción de ADN requiere una sonicación más suave, mientras que la extracción completa de proteínas de bacterias requiere un tratamiento ultrasónico más intenso). La temperatura durante el proceso puede monitorizarse mediante un sensor de temperatura integrado y controlarse fácilmente mediante refrigeración (baño de hielo o celdas de flujo con camisas de refrigeración) o mediante sonicación en modo pulsado. Durante la sonicación en modo pulsado, los ciclos breves de sonicación de 1-15 segundos de duración permiten disipar el calor y enfriar la muestra durante los intervalos más largos entre pulsos.
Todos los procesos impulsados por ultrasonidos son completamente reproducibles y escalables de forma lineal.
El VialTweeter es un homogeneizador ultrasónico para la preparación estéril, simultánea, uniforme y rápida de numerosas muestras.
- Preparación de la suspensión celular: los sedimentos celulares deben suspenderse por completo en una solución tampón mediante homogeneización (elija una solución tampón compatible con el análisis posterior, por ejemplo, con el método cromatográfico específico). Añada lisozimas y/u otros aditivos si es necesario (también deben ser compatibles con los métodos de separación/purificación). Mezcle/homogeneice suavemente la solución mediante una sonicación suave hasta conseguir una suspensión completa.
¡Lea más sobre las sinergias de las lisozimas combinadas con la sonicación! - Lisis ultrasónica: coloque la muestra en un baño de hielo. Para la ruptura celular, someta la suspensión a sonicación en ráfagas de 60-90 segundos (utilizando el modo pulsado de su sonicador).
- Separación: centrifugue el lisado (por ejemplo, 10 min. a 10.000 x g; a 4degC). Separe con cuidado el sobrenadante del sedimento celular. El sobrenadante es el lisado celular total. Tras filtrar el sobrenadante, obtendrá un líquido clarificado que contiene las proteínas celulares solubles.
Las aplicaciones más habituales de los sonicadores en biología y biotecnología son:
- Preparación de extractos celulares
- Ruptura de levaduras, bacterias, células vegetales, tejidos celulares blandos o duros, material nucleico
- Extracción de proteínas
- Preparación y aislamiento de enzimas
- Producción de antígenos
- Extracción de ADN y/o fragmentación dirigida
- Preparación de liposomas
La ruptura celular con un sonicador de tipo sonda es un método eficiente de preparación de muestras.
Las múltiples aplicaciones de los ultrasonidos abarcan los sectores de la biotecnología, la bioingeniería, la microbiología, la biología molecular, la bioquímica, la inmunología, la bacteriología, la virología, la proteómica, la genética, la fisiología, la biología celular, la hematología y la botánica.
Lisis: ruptura de las estructuras celulares
Las células están protegidas por una membrana plasmática semipermeable que consiste en una bicapa fosfolipídica (también una bicapa de proteínas y lípidos; formada por lípidos hidrófobos y moléculas de fósforo hidrófilas con moléculas proteicas integradas) y crea una barrera entre el interior celular (citoplasma) y el medio extracelular. Las células vegetales y las células procariotas están rodeadas por una pared celular. Debido a su gruesa pared celular de celulosa formada por múltiples capas, las células vegetales son más difíciles de lisar que las células animales. El interior celular, incluidos los orgánulos, el núcleo y la mitocondria, está estabilizado por el citoesqueleto.
La lisis celular tiene como objetivo extraer y separar los orgánulos, las proteínas, el ADN, el ARNm u otras biomoléculas.
Métodos convencionales de lisis celular y sus inconvenientes
Existen varios métodos para lisar células, que pueden dividirse en métodos mecánicos y químicos e incluyen el uso de detergentes o disolventes, la aplicación de alta presión o el uso de un molino de perlas o una prensa francesa. La desventaja más problemática de estos métodos es la dificultad para controlar y ajustar los parámetros del proceso y, por tanto, sus efectos.
La tabla siguiente muestra las principales desventajas de los métodos de lisis habituales:
Tabla: los métodos convencionales de lisis celular presentan desventajas importantes
Procedimiento de lisis
La lisis es un proceso delicado. Durante la lisis se destruye la protección que proporciona la membrana celular; sin embargo, debe evitarse la inactivación, desnaturalización y degradación de las proteínas extraídas debido a un entorno no fisiológico (desviación del valor de pH). Por ello, la lisis suele realizarse en una solución tampón. La mayoría de las dificultades surgen de una ruptura celular no controlada que provoca la liberación indiscriminada de todo el material intracelular y/o la desnaturalización del producto objetivo.
Preguntas frecuentes sobre la sonicación y la lisis celular
- ¿Se pueden lisar células mediante sonicación? Sí, la sonicación lisa eficazmente las células mediante ondas ultrasónicas de alta frecuencia que inducen cavitación, un fenómeno en el que se forman diminutas burbujas de vapor que colapsan violentamente dentro de la suspensión celular. Las fuerzas mecánicas resultantes rompen las membranas celulares y facilitan la liberación de los componentes intracelulares en el líquido.
- ¿Cómo se utiliza un sonicador para la lisis celular? Utilizar un sonicador para la lisis celular implica sumergir la sonda del sonicador en una suspensión celular y ajustar parámetros como la amplitud y la duración de los pulsos. El proceso debe monitorizarse de cerca para optimizar la ruptura celular y minimizar la desnaturalización de las proteínas y la inactivación de las enzimas.
- ¿Cuál es el principio de la sonicación para la lisis celular? La sonicación se basa en el principio de la cavitación acústica. La energía ultrasónica se transmite al medio líquido y provoca rápidas fluctuaciones de presión que dan lugar a la formación e implosión de microburbujas. Estas implosiones generan intensas fuerzas de cizallamiento y altas temperaturas localizadas, lo que rompe las estructuras celulares y mejora la homogeneidad del lisado.
- ¿Cuánto tarda la sonicación para la lisis celular? La duración de la sonicación para la lisis celular puede variar considerablemente según factores como el tipo celular, la densidad celular, la potencia del sonicador y el protocolo específico utilizado. Los procedimientos habituales pueden durar desde varios segundos hasta unos pocos minutos y suelen realizarse en ciclos para controlar la generación de calor y garantizar una ruptura celular uniforme.
- ¿Cuál es el objetivo de la sonicación en la extracción de proteínas? En la extracción de proteínas, la sonicación sirve para romper eficazmente las membranas celulares y solubilizar las proteínas. Este método es especialmente útil para liberar proteínas del interior de los compartimentos celulares, por lo que resulta esencial para preparar lisados a partir de los cuales se purificarán o analizarán las proteínas.
- ¿Por qué se utiliza la sonicación para la extracción? La sonicación es una opción preferida para la extracción por su acción rápida y su capacidad para aplicar energía de forma dirigida, desintegrando las estructuras celulares para liberar moléculas bioactivas sin utilizar tratamientos químicos agresivos y preservando así la integridad funcional de los compuestos extraídos.
- ¿La sonicación altera las interacciones proteína-proteína? Aunque la sonicación puede romper eficazmente las membranas celulares, también puede alterar las interacciones proteína-proteína. El grado de alteración depende de la intensidad de la sonicación y de la duración de la exposición, y puede provocar la desnaturalización o disociación de los complejos proteicos, lo que podría afectar a los estudios analíticos o funcionales posteriores.
- ¿Se puede utilizar la sonicación para lisar E. coli? Los sonicadores de Hielscher son especialmente eficaces para lisar células bacterianas como E. coli, que tienen paredes celulares resistentes. La técnica proporciona un método físico para romper por cizallamiento la pared y la membrana celulares, lo que la convierte en un método preferido para preparar lisados bacterianos en laboratorios de biología molecular y bioquímica.
- ¿Qué procesos se realizan después de la etapa de sonicación?
Las etapas posteriores a la lisis ultrasónica suelen incluir el fraccionamiento del lisado, el aislamiento dirigido de orgánulos y la extracción o purificación adicional de proteínas.
A continuación, el lisado procesado se separa y prepara para aplicaciones analíticas o funcionales, como la proteómica de alta resolución, la transcriptómica o los estudios de unión a receptores.
Bibliografía/Referencias
- Balasundaram, B.; Harrison, S.; Bracewell, D. G. (2009): Advances in product release strategies and impact on bioprocess design. Trends in Biotechnology 27/8, 2009. pp. 477-485.
- Vilkhu, K.; Manasseh, R.; Mawson, R.; Ashokkumar, M. (2011): Ultrasonic Recovery and Modification of Food ingredients. In: Feng/ Barbosa-Cánovas/ Weiss (2011): Ultrasound Technologies for Food and Bioprocessing. New York: Springer, 2011. pp. 345-368.
- Nico Böhmer, Andreas Dautel, Thomas Eisele, Lutz Fischer (2012): Recombinant expression, purification and characterisation of the native glutamate racemase from Lactobacillus plantarum NC8. Protein Expr Purif. 2013 Mar;88(1):54-60.
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- Claudia Lindemann, Nataliya Lupilova, Alexandra Müller, Bettina Warscheid, Helmut E. Meyer, Katja Kuhlmann, Martin Eisenacher, Lars I. Leichert (2013): Redox Proteomics Uncovers Peroxynitrite-Sensitive Proteins that Help Escherichia coli to Overcome Nitrosative Stress. J Biol Chem. 2013 Jul 5; 288(27): 19698–19714.
- Elahe Motevaseli, Mahdieh Shirzad, Seyed Mohammad Akrami, Azam-Sadat Mousavi, Akbar Mirsalehian, Mohammad Hossein Modarressi (2013): Normal and tumour cervical cells respond differently to vaginal lactobacilli, independent of pH and lactate. ed Microbiol. 2013 Jul; 62(Pt 7):1065-1072.