Sonicación para Lisis: Disrupción y extracción celular
La desintegración o lisis celular es una parte habitual de la preparación diaria de muestras en los laboratorios de biotecnología. El objetivo de la lisis es romper partes de la pared celular o la célula completa para liberar moléculas biológicas. Los homogeneizadores ultrasónicos se utilizan ampliamente para realizar con éxito la lisis celular. La principal ventaja de los ultrasonidos sofisticados es el control preciso de los parámetros del proceso, como la intensidad y la temperatura, que permite una disrupción y extracción celular suave pero muy eficaz.
Lisis celular mediante ultrasonidos
La lisis y extracción celular por ultrasonidos es un método utilizado para romper las células y extraer su contenido mediante ondas sonoras de alta frecuencia, es decir, ultrasonidos. La sonicación es una técnica de lisis ampliamente utilizada como método establecido y fiable de disrupción celular y extracción de material intracelular. La lisis ultrasónica es una técnica fiable para preparar lisados que contengan, por ejemplo, plásmidos, ensayos de receptores, proteínas, ADN, ARN, etc. Dado que la intensidad ultrasónica puede nivelarse ajustando los parámetros del proceso, la intensidad óptima de sonicación, de muy suave a intensa, puede ajustarse individualmente para cada sustancia y medio para satisfacer los requisitos específicos de la aplicación. Los siguientes pasos de la lisis son el fraccionamiento, el aislamiento de orgánulos y/o la extracción y purificación de proteínas. El material extraído (= lisado) debe separarse y es objeto de posteriores investigaciones o aplicaciones, por ejemplo, para la investigación proteómica.
Homogeneizadores ultrasónicos UP100H (100 vatios) y UP400St (400 vatios) para la preparación de muestras, como la lisis y la extracción.
En comparación con otros métodos de lisis y extracción celular, la lisis celular ultrasónica presenta varias ventajas:
- Velocidad: La lisis y extracción celular por ultrasonidos es un método rápido que puede romper las células en cuestión de segundos. Es mucho más rápido que otros métodos como la homogeneización, la congelación-descongelación o el fresado de microesferas.
- Eficiencia: La lisis y extracción celular por ultrasonidos puede utilizarse para tratar muestras pequeñas, grandes o múltiples a la vez, lo que la hace más eficaz que otros métodos que requieren el procesamiento individual de muestras pequeñas.
- Sin productos químicos: La lisis y extracción celular por ultrasonidos es un método no invasivo que no requiere el uso de productos químicos agresivos ni enzimas. Esto lo hace ideal para aplicaciones en las que es necesario mantener la integridad del contenido celular. Se puede evitar la contaminación no deseada de las muestras.
- Alto rendimiento: La lisis y extracción celular por ultrasonidos puede extraer un alto rendimiento de contenidos celulares, como ADN, ARN y proteínas. Esto se debe a que las ondas sonoras de alta frecuencia rompen las paredes celulares y liberan el contenido en la solución circundante.
- Control de temperatura: Los sofisticados ultrasonciadores permiten un control preciso de la temperatura de la muestra. Los sonicadores digitales Hielscher están equipados con un sensor de temperatura enchufable y un software de control de la temperatura.
- Reproducible: Los protocolos de lisis celular por ultrasonidos pueden reproducirse fácilmente e incluso adaptarse a diferentes volúmenes de muestra mayores o menores mediante un sencillo escalado lineal.
- Versátil: La lisis y extracción celular por ultrasonidos puede utilizarse para extraer una amplia gama de tipos celulares, como bacterias, levaduras, hongos, células vegetales y de mamíferos. También puede utilizarse para extraer distintos tipos de moléculas, como proteínas, ADN, ARN y lípidos.
- Preparación simultánea de numerosas muestras: Hielscher Ultrasonics ofrece varias soluciones para procesar cómodamente numerosas muestras bajo exactamente las mismas condiciones de proceso. Esto hace que el paso de preparación de la muestra de lisis y extracción sea altamente eficiente y ahorre tiempo.
- Fácil de usar: El equipo de lisis y extracción celular por ultrasonidos es fácil de usar y requiere una formación mínima. El equipo también es económico, ya que se trata de una única inversión sin necesidad de volver a comprar desechables. Esto lo hace atractivo para una amplia gama de investigadores y laboratorios.
En general, la lisis y extracción celular por ultrasonidos es un método rápido, eficaz, controlable con precisión y versátil para extraer contenidos celulares. Sus ventajas sobre otros métodos alternativos lo convierten en una opción atractiva para una amplia gama de aplicaciones industriales y de investigación.
Principio de funcionamiento de la lisis celular por ultrasonidos
La lisis y extracción celular por ultrasonidos utiliza ondas sonoras de alta frecuencia para desintegrar las células y extraer su contenido. Las ondas sonoras crean cambios de presión en el líquido circundante, lo que provoca la formación y el colapso de pequeñas burbujas en un proceso conocido como cavitación. Estas burbujas generan fuerzas mecánicas localizadas muy intensas que pueden romper las células y liberar su contenido en la solución circundante.
La lisis celular mediante ultrasonidos suele implicar los siguientes pasos:
- La muestra se coloca en un tubo o recipiente con un tampón líquido.
- Se inserta una sonda ultrasónica en la muestra y se aplican ondas sonoras de alta frecuencia de aproximadamente 20-30 kHz.
- Las ondas ultrasónicas causan oscilación y cavitación en el líquido circundante, generando fuerzas localizadas que rompen las células abiertas y liberan su contenido.
- La muestra se centrifuga o filtra para eliminar cualquier resto celular, y el contenido extraído se recoge para su análisis posterior.
Las potentes ondas ultrasónicas alteran la matriz celular de las estructuras biológicas y liberan los compuestos bioactivos. Se intensifica la transferencia de masa entre el material vegetal y el disolvente (por ejemplo, el tampón). (gráfico: ©Vilkhu et al., 2006)
Desventajas de los métodos habituales de lisis
Durante su trabajo en laboratorios, es posible que ya haya experimentado las molestias de la lisis celular mediante los protocolos tradicionales de lisis mecánica o química.
- Lisis mecánica: Los métodos de lisis mecánica, como la molienda con mortero o la homogeneización mediante prensa francesa, molino de bolas o sistema rotor-estator, carecen a menudo de opciones de control y ajuste precisos. Esto significa que el uso de molienda y trituración puede generar rápidamente calor y fuerzas de cizallamiento que pueden dañar la muestra y desnaturalizar las proteínas. También pueden requerir mucho tiempo y grandes cantidades de material de partida.
- Lisis química: Los métodos de lisis química, como la lisis basada en detergentes, pueden dañar la muestra al alterar la bicapa lipídica y desnaturalizar las proteínas. También pueden requerir múltiples pasos y dejar contaminantes residuales que interfieren con las aplicaciones posteriores. Encontrar la dosis óptima de detergente es un reto adicional.
- Ciclos de congelación-descongelación: Los ciclos de congelación-descongelación pueden provocar la ruptura de las membranas celulares, pero los ciclos repetidos también pueden causar la desnaturalización y degradación de las proteínas. Este método también puede requerir múltiples ciclos, lo que puede llevar mucho tiempo y a menudo da lugar a rendimientos más bajos.
- Lisis enzimática: Los métodos de lisis enzimática pueden ser específicos para determinados tipos de células y requieren múltiples pasos, por lo que consumen mucho tiempo. También generan residuos y requieren una cuidadosa optimización para evitar la degradación de la muestra. Los kits de lisis enzimática suelen ser caros. Si su actual procedimiento de lisis enzimática da resultados insuficientes, puede aplicarse la sonicación como método sinérgico para intensificar la disrupción celular.
En contraste con los métodos convencionales de lisis celular mecánica y química, la sonicación es una herramienta muy eficaz y fiable para la desintegración celular que permite un control completo de los parámetros de sonicación. Esto garantiza una alta selectividad en la liberación de materiales y la pureza del producto. [cf. Balasundaram et al., 2009].
Se adapta a todos los tipos de células y es fácilmente aplicable a pequeña y gran escala. – siempre en condiciones controladas. Los ultrasonidos son fáciles de limpiar. Un homogeneizador ultrasónico siempre dispone de funciones de limpieza in situ (CIP) y esterilización in situ (SIP). El sonotrodo consiste en un cuerno macizo de titanio que puede limpiarse o lavarse con agua o disolvente (según el medio de trabajo). Gracias a su robustez, el mantenimiento de los ultrasonidos es prácticamente despreciable.
Lisis ultrasónica y disrupción celular
Por lo general, la lisis de las muestras en el laboratorio dura entre 15 segundos y 2 minutos. Dado que la intensidad de la sonicación es muy fácil de ajustar mediante el ajuste de la amplitud y el tiempo de sonicación, así como mediante la elección del equipo adecuado, es posible romper las membranas celulares de forma muy suave o muy brusca, dependiendo de la estructura celular y del objetivo de la lisis (por ejemplo, la extracción de ADN requiere una sonicación más suave, mientras que la extracción completa de proteínas de bacterias requiere un tratamiento por ultrasonidos más intenso). La temperatura durante el proceso puede controlarse mediante un sensor de temperatura integrado y puede controlarse fácilmente por refrigeración (baño de hielo o celdas de flujo con camisas de refrigeración) o por sonicación en modo pulsado. Durante la sonicación en modo pulsado, los ciclos cortos de ráfagas de sonicación de 1-15 segundos de duración permiten la disipación del calor y la refrigeración durante los periodos intermitentes más largos.
Todos los procesos accionados por ultrasonidos son completamente reproducibles y linealmente escalables.
El VialTweeter es un homogeneizador ultrasónico para la preparación estéril simultánea, uniforme y rápida de numerosas muestras.
Homogeneizadores ultrasónicos para lisis y extracción celular
Los distintos tipos de dispositivos ultrasónicos permiten adaptarse al objetivo de preparación de la muestra y garantizar la facilidad de uso y la comodidad de manejo. Los ultrasonidos de sonda son los más comunes en el laboratorio. Son los más adecuados para la preparación de muestras pequeñas y medianas con volúmenes de 0,1 ml a 1.000 ml. Los diferentes tamaños de potencia y sonotrodos permiten adaptar el ultrasonicador al volumen de la muestra y al recipiente para obtener los resultados de sonicación más eficaces y eficientes. El dispositivo de sonda ultrasónica es la mejor opción cuando hay que preparar muestras individuales.
Si hay que preparar más muestras, por ejemplo 8-10 viales de solución celular, una sonicación indirecta intensa con sistemas ultrasónicos como el VialTweeter o un cuphorn ultrasónico son el método de homogeneización más adecuado para una lisis eficiente. Varios viales se sonican al mismo tiempo, a la misma intensidad. Esto no sólo ahorra tiempo, sino que también garantiza el mismo tratamiento de todas las muestras, lo que hace que los resultados entre las muestras sean fiables y comparables. Además, durante la sonicación indirecta se evita la contaminación cruzada por inmersión del sonotrodo ultrasónico (también conocido como sonda ultrasónica, cuerno, punta o dedo). Dado que se utilizan viales adaptados individualmente al tamaño de la muestra, se omiten las largas tareas de limpieza y la pérdida de muestras debida a la decantación de los recipientes. Para la sonicación uniforme de placas multipocillo o de microtitulación, Hielscher ofrece el UIP400MTP.
Para volúmenes mayores, por ejemplo para la producción comercial de extractos celulares, los sistemas ultrasónicos continuos con un reactor de celda de flujo son los más adecuados. El flujo continuo y uniforme del material procesado asegura una sonicación uniforme. Todos los parámetros del proceso de desintegración por ultrasonidos pueden optimizarse y ajustarse a los requisitos de la aplicación y del material celular específico.
Procedimiento ejemplar para la lisis ultrasónica de células bacterianas:
- Preparación de la suspensión celular: Los gránulos celulares deben suspenderse completamente en una solución tampón mediante homogeneización (elija una solución tampón compatible con el análisis siguiente, por ejemplo, un método de cromatografía específico). Añadir lisozimas y/u otros aditivos, si es necesario (también deben ser compatibles con los medios de separación/purificación). Mezclar/homogeneizar la solución suavemente mediante sonicación suave hasta conseguir una suspensión completa.
- Lisis ultrasónica: Colocar la muestra en un baño de hielo. Para la disrupción celular, sonicar la suspensión en ráfagas de 60-90 segundos (utilizando el modo de pulso de su ultrasonicador).
- Separación: Centrifugar el lisado (por ejemplo, 10 min. a 10.000 x g; a 4degC). Separar cuidadosamente el sobrenadante del sedimento celular. El sobrenadante es el lisado celular total. Tras la filtración del sobrenadante, se obtiene un líquido clarificado de la proteína celular soluble.
Las aplicaciones más comunes de los ultrasonidos en biología y biotecnología son:
- Preparación del extracto celular
- Disrupción de levaduras, bacterias, células vegetales, tejido celular blando o duro, material nucleico
- extracción de proteínas
- Preparación y aislamiento de enzimas
- Producción de antígenos
- Extracción de ADN y/o fragmentación dirigida
- preparación de liposomas
La disrupción celular con ultrasonidos tipo sonda es un método eficaz de preparación de muestras.
La siguiente tabla le ofrece una visión general de nuestros ultrasonidos para la disrupción y extracción celular. Haga clic en el tipo de dispositivo para obtener más información sobre cada homogeneizador ultrasónico. Nuestro personal técnico, bien formado y con una larga experiencia, estará encantado de ayudarle a elegir el ultrasonicador más adecuado para sus muestras.
| Volumen del lote | Tasa de flujo | Dispositivos recomendados |
|---|---|---|
| hasta 10 viales o tubos | n.a. | VialTweeter |
| placas multipocillo / microtiter | n.a. | UIP400MTP |
| varios tubos / recipientes | n.a. | CupHorn |
| 1 a 500 mL | 10 a 200 mL/min. | UP100H |
| De 10 a 1000 ml | 20 a 200mL/min | UP200Ht, UP200St |
| 10 a 2000 mL | 20 a 400 mL/min. | UP400St |
Las múltiples aplicaciones de los ultrasonidos se ramifican en los sectores de la biotecnología, la bioingeniería, la microbiología, la biología molecular, la bioquímica, la inmunología, la bacteriología, la virología, la proteómica, la genética, la fisiología, la biología celular, la hematología y la botánica.
Lisis: Romper las estructuras celulares
Las células están protegidas por una membrana plasmática semipermeable que consiste en una bicapa fosfolipídica (también bicapa proteico-lipídica; formada por lípidos hidrofóbicos y moléculas de fósforo hidrofílicas con moléculas proteicas incrustadas) y crea una barrera entre el interior celular (citoplasma) y el medio extracelular. Las células vegetales y procariotas están rodeadas por una pared celular. Debido a las múltiples capas de espesor de la pared celular de celulosa, las células vegetales son más difíciles de lisar que las células animales. El interior de la célula, como los orgánulos, el núcleo y la mitocondria, está estabilizado por el citoesqueleto.
Al lisar las células, se pretende extraer y separar los orgánulos, las proteínas, el ADN, el ARNm u otras biomoléculas.
Métodos convencionales de lisis celular y sus inconvenientes
Existen varios métodos para lisar células, que pueden dividirse en métodos mecánicos y químicos, que incluyen el uso de detergentes o disolventes, la aplicación de alta presión o el uso de un molino de bolas o de una prensa francesa. La desventaja más problemática de estos métodos es el difícil control y ajuste de los parámetros del proceso y, por tanto, su impacto.
La siguiente tabla muestra las principales desventajas de los métodos de lisis más comunes:
Tabla: Los métodos convencionales de lisis celular presentan importantes desventajas
Procedimiento de lisis
La lisis es un proceso delicado. Durante la lisis se destruye la protección de la membrana celular, pero debe evitarse la inactivación, desnaturalización y degradación de las proteínas extraídas por un entorno no fisiológico (desviación del valor de pH). Por lo tanto, en general la lisis se lleva a cabo en una solución tampón. La mayoría de las dificultades surgen de la disrupción celular incontrolada que resulta en una liberación no dirigida de todo el material intracelular o/y la desnaturalización del producto diana.
Literatura/Referencias
- Balasundaram, B.; Harrison, S.; Bracewell, D. G. (2009): Advances in product release strategies and impact on bioprocess design. Trends in Biotechnology 27/8, 2009. pp. 477-485.
- Vilkhu, K.; Manasseh, R.; Mawson, R.; Ashokkumar, M. (2011): Ultrasonic Recovery and Modification of Food ingredients. In: Feng/ Barbosa-Cánovas/ Weiss (2011): Ultrasound Technologies for Food and Bioprocessing. New York: Springer, 2011. pp. 345-368.
- Nico Böhmer, Andreas Dautel, Thomas Eisele, Lutz Fischer (2012): Recombinant expression, purification and characterisation of the native glutamate racemase from Lactobacillus plantarum NC8. Protein Expr Purif. 2013 Mar;88(1):54-60.
- Brandy Verhalen, Stefan Ernst, Michael Börsch, Stephan Wilkens (2012): Dynamic Ligand-induced Conformational Rearrangements in P-glycoprotein as Probed by Fluorescence Resonance Energy Transfer Spectroscopy. J Biol Chem. 2012 Jan 6;287(2): 1112-27.
- Claudia Lindemann, Nataliya Lupilova, Alexandra Müller, Bettina Warscheid, Helmut E. Meyer, Katja Kuhlmann, Martin Eisenacher, Lars I. Leichert (2013): Redox Proteomics Uncovers Peroxynitrite-Sensitive Proteins that Help Escherichia coli to Overcome Nitrosative Stress. J Biol Chem. 2013 Jul 5; 288(27): 19698–19714.
- Elahe Motevaseli, Mahdieh Shirzad, Seyed Mohammad Akrami, Azam-Sadat Mousavi, Akbar Mirsalehian, Mohammad Hossein Modarressi (2013): Normal and tumour cervical cells respond differently to vaginal lactobacilli, independent of pH and lactate. ed Microbiol. 2013 Jul; 62(Pt 7):1065-1072.