Lisis por ultrasonidos: Ruptura celular & extracción

Estructura celular

Las células están protegidas por una membrana plasmática semipermeable que consiste en una bicapa fosfolípida (también bilayer proteína-lípido; formada por lípidos hidrofóbicos y moléculas de fósforo hidrófilo con moléculas de proteínas incrustadas) y crea una barrera entre el interior de la célula (citoplasma) y el entorno extracelular. Las células vegetales y las células procarióticas están rodeadas por una pared celular. Debido a las múltiples capas de pared celular gruesa de celulosa, las células vegetales son más difíciles de lisar que las células animales. El interior de la célula, como organelos, núcleo, mitocondria, es estabilizado por el citoesqueleto.
Mediante el lisado de las células, se pretende extraer y separar los orgánulos, proteínas, ADN, ARNm u otras biomoléculas.

Fig. 1: Extracción ultrasónica de células: la sección transversal microscópica (ST) del tallo apical de la menta (Mentha piperita) muestra el mecanismo de acción durante la extracción ultrasónica de células (aumento 2000x)[recurso: Vilkhu et al. 2011].

Métodos

Existen varios métodos para lisar las células, que pueden dividirse en métodos mecánicos y químicos, que incluyen el uso de detergentes o disolventes, la aplicación de alta presión, o el uso de un molino de bolas o de una prensa francesa. La desventaja más problemática de estos métodos es el difícil control y ajuste de los parámetros del proceso y, por lo tanto, el impacto.
Las principales desventajas de los métodos de lisis comunes:

Mesa: Los métodos convencionales de lisis celular tienen grandes desventajas

Por el contrario, la sonicación es una herramienta muy eficaz y fiable para la desintegración celular que permite un control completo de los parámetros de sonicación. Esto asegura una alta selectividad en la liberación de materiales y pureza del producto. Balasundaram et al. 2009] Es adecuado para todo tipo de células y de fácil aplicación en pequeña y gran escala. Los ultrasonidos son fáciles de limpiar. Un homogeneizador ultrasónico siempre cuenta con la función de limpieza in situ (CIP) y esterilización in situ (SIP). El sonotrodo consiste en un cuerno de titanio macizo que se puede limpiar o enjuagar con agua o disolvente (dependiendo del medio de trabajo). El mantenimiento de los ultrasonidos se debe a su robustez casi insignificante.

lisis

La lisis es un proceso sensible. Durante la lisis se destruye la protección de la membrana celular, pero se debe evitar la inactivación, desnaturalización y degradación de las proteínas extraídas por un entorno no fisiológico (desviación del valor pH). Por lo tanto, en general la lisis se realiza en una solución tampón. La mayoría de las dificultades se deben a la interrupción incontrolada de las células, que da lugar a la liberación no intencionada de todo el material intracelular o a la desnaturalización del producto diana.

Lisis ultrasónica

Generalmente, la lisis de las muestras en el laboratorio toma entre 15 segundos y 2 minutos. Dado que la intensidad de la sonicación es muy fácil de ajustar mediante el ajuste de la amplitud del tiempo de sonicación, así como mediante la elección del equipo adecuado, es posible interrumpir las membranas celulares de forma muy suave o muy abrupta, dependiendo de la estructura celular y de la finalidad de la lisis (por ejemplo, la extracción del ADN requiere una sonicación más suave, la extracción completa de proteínas de las bacterias requiere un tratamiento de ultrasonido más intenso). La temperatura durante el proceso puede ser monitoreada por un sensor de temperatura integrado y puede ser fácilmente controlada por enfriamiento (baño de hielo o celdas de flujo con camisas de refrigeración) o por sonicación en modo pulsado. Durante la sonicación en modo pulso, los ciclos cortos de explosión de sonicación de 1-15 segundos de duración permiten la disipación de calor y el enfriamiento durante los períodos intermitentes más largos.
Todos los procesos impulsados por ultrasonidos son completamente reproducibles y linealmente escalables.

homogeneizadores ultrasónicos

Varios tipos de dispositivos ultrasónicos permiten alcanzar el objetivo de preparación de la muestra y garantizar la facilidad de uso y la comodidad de uso. Los ultrasonidos tipo sonda son los dispositivos más comunes en el laboratorio. Son ideales para la preparación de muestras pequeñas y medianas con volúmenes de 0.1mL hasta 1000mL. Diferentes tamaños de potencia y sonotrodos permiten adaptar el ultrasonido al volumen de la muestra y al recipiente para obtener los resultados de sonorización más efectivos y eficientes. El dispositivo de sonda ultrasónica es la mejor opción cuando hay que preparar muestras individuales.

Si hay que preparar más muestras, por ejemplo, 8 viales de solución celular, dispositivos como el VialTweeter o un cuphorn ultrasónico son los homogeneizadores más adecuados para la lisis. Varias ampollas se sondean al mismo tiempo, con la misma intensidad. Esto no sólo ahorra tiempo, sino que también garantiza el mismo tratamiento de todas las muestras, lo que hace que los resultados entre las muestras sean fiables y comparables. Además, se evita la contaminación cruzada por inmersión del sonotrodo ultrasónico (también conocido como sonda ultrasónica, cuerno, punta o dedo). Dado que se utilizan viales, se omiten la limpieza que requiere mucho tiempo y la pérdida de muestras debido a la decantación de los recipientes.
Para volúmenes mayores, por ejemplo para la producción comercial de extractos celulares, los sistemas de ultrasonidos continuos con un reactor de celda de flujo son los más adecuados. El flujo continuo y uniforme del material procesado asegura una sonicación uniforme. Todos los parámetros del proceso de desintegración por ultrasonidos pueden ser optimizados y ajustados a los requerimientos de la aplicación y al material celular específico.

1. Preparación de la suspensión celular: Los gránulos celulares deben estar completamente suspendidos en una solución tampón mediante homogeneización (elija una solución tampón compatible con el análisis siguiente, por ejemplo, un método de cromatografía específico). En caso necesario, añadir lisozimas y/u otros aditivos (también deben ser compatibles con medios de separación/purificación). Mezclar/ homogeneizar la solución suavemente bajo sonicación suave hasta que se logre la suspensión completa.
2. Lisis ultrasónica: Colocar la muestra en un baño de hielo. Para la interrupción celular, sonique la suspensión a ráfagas de 60-90 segundos (usando el modo de pulso de su ultrasonido).
3. Separación: Centrifugar el lisado (por ejemplo, 10 min. a 10.000 x g; a 4degC). Separar cuidadosamente el sobrenadante del sedimento celular. El sobrenadante es el lisado celular total. Después de la filtración del sobrenadante, se obtiene un líquido clarificado de la proteína celular soluble.

Las aplicaciones más comunes de los ultrasonidos en biología y biotecnología son:

• Preparación del extracto celular
• Interrupción de la levadura, bacterias, células vegetales, células blandas & tejido celular duro, material nucleico
• Extracción de proteínas
• Preparación y aislamiento de enzimas
• Producción de antígenos
• Extracción de ADN y/o fragmentación de objetivos
• preparación de liposomas