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Lisis por ultrasonidos: Ruptura celular & Extracción

La desintegración o lisis celular es una parte común de la preparación diaria de muestras en laboratorios de biotecnología. El objetivo de la lisis es romper partes de la pared celular o la célula completa para liberar moléculas biológicas. El denominado lisado puede consistir, por ejemplo, en plásmidos, ensayos de receptores, proteínas, ADN, ARN, etc. Los siguientes pasos de la lisis son el fraccionamiento, el aislamiento de orgánulos y / y la extracción y purificación de proteínas. El material extraído (= lisado) debe separarse y está sujeto a nuevas investigaciones o aplicaciones, por ejemplo, para investigación proteómica. Los homogeneizadores ultrasónicos son una herramienta común para la lisis celular exitosa. Como la intensidad ultrasónica se puede nivelar mediante el ajuste de los parámetros del proceso, la intensidad de sonicación óptima desde muy suave a muy duro se puede configurar individualmente para que cada sustancia y medio cumplan los requisitos específicos de la aplicación.

Estructura celular

Las células están protegidos por una membrana de plasma semi-permeable que consiste en una bicapa fosfo-lípido (bicapa también proteína-lípido; formada por lípidos hidrófobos y moléculas de fósforo hidrófilos con moléculas de proteína incrustadas) y crea una barrera entre los interiores de células (citoplasma) y el medio extracelular. Las células vegetales y células procariotas están rodeados por una pared celular. Debido a las múltiples capas de la pared celular gruesa de celulosa, las células vegetales son más difíciles de lisar que las células animales. El interior de la célula, tales como orgánulos, núcleo, mitocondria, se estabiliza por el citoesqueleto.
Por lisar las células, que está dirigido a la extracción y la separación de los orgánulos, proteínas, ADN, ARNm o otras biomoléculas.

Ultrasonicators son una herramienta que se utiliza comúnmente para la preparación de la muestra de la materia celular.

Fig. 1: extracción por ultrasonidos de las células: la sección transversal microscópica (TS) del tallo apical de menta (Mentha piperita) muestra el mecanismo de las acciones durante la extracción por ultrasonidos a partir de células (ampliación 2000x) [recurso: Vilkhu et al. 2011]

métodos

Hay varios métodos para lisado de células, que se pueden dividir en métodos mecánicos y químicos, que incluyen el uso de detergentes o disolventes, la aplicación de alta presión, o el uso de un molino de perlas o de una prensa francés. La desventaja más problemático de estos métodos es el difícil control y ajuste de parámetros de proceso y de este modo el impacto.
Las principales desventajas de métodos de lisis comunes:

Diferentes técnicas de lisis

Tabla: Los métodos convencionales de lisis celular tienen importantes desventajas

Por el contrario, la sonicación es una herramienta muy eficaz y fiable para la desintegración celular que permite un control completo sobre los parámetros de sonicación. Esto asegura una alta selectividad sobre la liberación de los materiales y la pureza del producto. [Balasundaram et al. 2009] Es adecuado para todos los tipos de células y fácilmente aplicable en pequeña y gran escala. Ultrasonicators son fáciles de limpiar. Un homogeneizador ultrasónico siempre dispone de limpieza in situ (CIP) y la función de esterilizar in situ (SIP). El sonotrodo consiste en un cuerno masiva de titanio que se puede limpiar o enrojecida en agua o disolvente (en función del medio de trabajo). El mantenimiento de ultrasonicators es debido a su robustez casi despreciable.

lisis

Lisis es un proceso sensible. Durante la lisis de la protección de la membrana celular se destruye, sin embargo, la inactivación, la desnaturalización y la degradación de las proteínas extraídas por un entorno no fisiológica (desviación del valor de pH) debe ser evitado. Por lo tanto, en la lisis en general se lleva a cabo en una solución tampón. La mayoría de las dificultades surgen de la ruptura celular incontrolada que resulta en una liberación no directo de todo el material intracelular y / o la desnaturalización del producto diana.

lisis celular por ultrasonidos se puede utilizar para la preparación de muestras en el laboratorio y para la producción de grandes volúmenes. ¡Click para agrandar!

Fig. 1: 200 vatios homogeneizador ultrasónico potente UP200Ht con control digital y la grabación automática de datos para la lisis celular fiable y reproducible.

La lisis por ultrasonidos

En general, la lisis de las muestras en el laboratorio llevará entre 15 segundos y 2 minutos. Como la intensidad de la sonicación es muy fácil de ajustar ajustando la amplitud del tiempo de sonicación y eligiendo el equipo adecuado, es posible alterar las membranas celulares muy suavemente o muy abruptamente, dependiendo de la estructura celular y del propósito de la lisis ( por ejemplo, la extracción de ADN requiere una sonicación más suave, la extracción completa de proteínas de las bacterias requiere un tratamiento de ultrasonido más intenso). La temperatura durante el proceso puede controlarse mediante un sensor de temperatura integrado y puede controlarse fácilmente mediante enfriamiento (baño de hielo o celdas de flujo con camisas de enfriamiento) o mediante sonicación en modo pulsado. Durante la sonicación en modo de pulso, los ciclos de ráfaga de sonicación cortos de 1-15 segundos de duración permiten la disipación de calor y el enfriamiento durante los periodos intermitentes más largos.
Todos los procesos de ultrasonido impulsada son completamente reproducible y escalable linealmente.

Ultrasonic VialTweeter homogeneizador para la preparación de la muestra simultánea de hasta 10 tubos de ensayo. (¡Click para agrandar!)

El dispositivo de ultrasonidos VialTweeter permite la preparación de la muestra simultánea de hasta 10 viales bajo mismas condiciones de proceso.

Los homogeneizadores ultrasónicos

Varios tipos de dispositivos ultrasónicos permiten la coincidencia de la meta preparación de la muestra y para asegurar la facilidad de uso y comodidad de uso. De tipo sonda ultrasonicators son los dispositivos más comunes en el laboratorio. Ellos son los más adecuados para la preparación de las pequeñas y medianas muestras con volúmenes de 0,1 ml hasta 1000 ml. Diferentes potencias y sonotrodos permiten adaptar el ultrasonicador al volumen de la muestra y el recipiente para obtener resultados más eficaces y eficientes sonicación. El dispositivo de sonda ultrasónica es la mejor opción cuando las muestras individuales tienen que ser preparados.

Si se tienen que preparar más muestras, por ejemplo, 8 viales de solución de células, dispositivos como el VialTweeter o un cuphorn ultrasónico son el homogeneizador más adecuado para la lisis. Varios viales son sonicados al mismo tiempo, con la misma intensidad. Esto ahorra no solo tiempo, sino que también garantiza el mismo tratamiento para todas las muestras, lo que hace que los resultados entre las muestras sean confiables y comparables. Además, se evita la contaminación cruzada al sumergir el sonotrodo ultrasónico (también conocido como sonda ultrasónica, bocina, punta o dedo). Debido a que se usan viales, se omite la limpieza que requiere mucho tiempo y la pérdida de muestra debido a la decantación de los recipientes.
Para volúmenes mayores, por ejemplo, para la producción comercial de los extractos celulares, los sistemas de ultrasonidos continuos con un reactor de célula de flujo son los más adecuados. El flujo continuo y uniforme del material procesado asegura una sonicación incluso. Todos los parámetros del proceso de desintegración ultrasónica se pueden optimizar y se ajustan a los requisitos de la aplicación y el material celular específico.

procedimiento ejemplar para lisis por ultrasonidos de células bacterianas:

  1. Preparación de la suspensión de células: los sedimentos celulares deben estar completamente suspendidos en una solución tampón por homogeneización (elija su solución tampón compatible con el análisis siguiente, por ejemplo, método de cromatografía específico). Añadir lisozimas y / u otros aditivos, si es necesario (que debe ser también compatible con medios de separación / purificación). Mezclar / homogeneizar la solución suavemente bajo sonicación suave hasta que se logra la suspensión completa.
  2. Ultrasónica lisis: Colocar la muestra en un baño de hielo. Para la ruptura celular, someter a ultrasonidos la suspensión a 60-90 segundos ráfagas (utilizando el modo de impulsos de su ultrasonicador).
  3. (., Por ejemplo, 10 min a 10.000 x g; a 4degC): de separación por centrifugación del lisado. Separar el sobrenadante del sedimento celular con cuidado. El sobrenadante es el lisado celular total. Después de la filtración del sobrenadante, se obtiene un fluido clarificado de la proteína celular soluble.



Las aplicaciones más comunes para ultrasonicators en la biología y la biotecnología son:

  • la preparación del extracto de la célula
  • Ruptura de levadura, bacterias, células vegetales, suave & tejido celular duro, el material nucleico
  • La extracción de proteínas
  • Preparación y aislamiento de enzimas
  • La producción de antígenos
  • la extracción de ADN y / o dirigido fragmentación
  • preparación de liposomas
homogeneizadores de alta ultrasonidos de potencia como el UIP1000hd se utilizan para la disrupción celular y la extracción por lotes o en modo de flujo, aunque continua. (¡Click para agrandar!)

sistemas de sobremesa de ultrasonidos tales como la UIP1000hd (1 kW) puede procesar grandes volúmenes de material biológico.

Las múltiples aplicaciones de las ramas de ultrasonido en los sectores de la biotecnología, bioingeniería, microbiología, biología molecular, bioquímica, inmunología, bacteriología, virología, la proteómica, la genética, la fisiología, la biología celular, la hematología y la botánica.

Para la evaluación y optimización de aplicaciones de los clientes, Hielscher Ultrasonidos ofrece un completo equipamiento laboratorio proceso ultrasónico. Por favor, póngase en contacto con nosotros para más información!

Literatura/Referencias

  • Balasundaram, B .; Harrison, S .; Bracewell, D. G. (2009): Los avances en las estrategias de lanzamiento de productos y el impacto en el diseño de bioprocesos. Tendencias en Biotecnología 27/8, 2009. pp. 477-485.
  • Vilkhu, K .; Manasés, R .; Mawson, R .; Ashokkumar, M. (2011): Ultrasonidos de recuperación y modificación de ingredientes alimentarios. En: Feng / Barbosa-Cánovas / Weiss (2011): Ultrasound Technologies para la Alimentación y Bioprocesos. Nueva York: Springer, 2011. pp 345-368..

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