Sonicación para la Lisis Celular: Disrupción y extracción celular
La lisis celular por ultrasonidos es una técnica de preparación de muestras ampliamente utilizada en los laboratorios biotecnológicos modernos. Su objetivo principal es romper las membranas celulares o células enteras para liberar componentes intracelulares como proteínas, ácidos nucleicos u orgánulos. En el trabajo diario de laboratorio, esto significa que la sonicación es un método estándar para la disrupción celular controlada y la extracción eficaz de biomoléculas. La principal ventaja de los sonicadores reside en su capacidad para modular con precisión los parámetros críticos del proceso, como la intensidad de los ultrasonidos, la pulsación y el control de la temperatura. Este control permite a los investigadores conseguir una lisis fiable minimizando al mismo tiempo los daños térmicos o mecánicos a las biomoléculas sensibles, lo que da como resultado un proceso de extracción suave pero muy eficaz.
Lisis celular con sonicadores
La lisis celular ultrasónica utiliza la cavitación acústica para romper las membranas celulares y liberar moléculas intracelulares. Hielscher Ultrasonics ofrece el sonicador clásico de tipo sonda, así como sonicadores de múltiples muestras para el procesamiento estéril: el VialTweeter para múltiples tubos y viales y el sonicador de placas de 96 pocillos UIP400MTP para microplacas estándar.
Hielscher Ultrasonics suministra potentes sonicadores sin contacto para la preparación de muestras y análisis clínicos. El sonicador de placas de pocillos múltiples UIP400MTP, El VialTweeter, el cuerno de la copa y el sonicador de flujo GDmini2 procesar las muestras en condiciones estériles.
Homogeneizadores ultrasónicos UP100H (100 vatios) y UP400St (400 vatios): Sonicación para lisis y extracción celular.
Homogeneizadores ultrasónicos para la lisis y extracción celular
| Tipo de dispositivo ultrasónico | Enfoque de la aplicación | Volumen de la muestra | Caso típico | Ventajas | Modelos de ejemplo |
|---|---|---|---|---|---|
| Sondas sonoras | Sonicación de una sola muestra | 0.1 mL a ~1000 mL | Lisis celular, extracción de proteínas, fragmentación de ADN/ARN | Control preciso de la energía; varios sonotrodos; óptimo para muestras pequeñas y medianas | UP100H, UP200St, UP400St |
| VialTweeter / CupHorn | Procesamiento paralelo de múltiples viales sellados | 8-10 viales (~1-20 mL cada uno) | Lisis estandarizada de múltiples suspensiones celulares | Sonicación uniforme; evita la contaminación cruzada; resultados reproducibles | VialTweeter, CupHorn |
| Sonicador de placas de 96 pocillos | Sonicación de placas multipocillo y de microtitulación | Formato de microplaca | Cribado de alto rendimiento, proteómica, ensayos celulares | Sonicación simultánea y uniforme en todos los pocillos; ideal para flujos de trabajo con varias muestras | UIP400MTP |
| reactores de celda de flujo | Sonicación continua para mayores volúmenes | >1 L, escalable | Disrupción celular a escala industrial, producción de extractos | Procesamiento continuo; escalable; control total del proceso (amplitud, presión, temperatura) | UIP1000hdT, UIP2000hdT + célula de flujo |
| Sistemas de sonicación estéril / indirecta | Procesamiento de muestras sin contaminación | En función del vial/tubo/microplaca | Muestras sensibles, entornos estériles, entornos reglamentarios | Sin contacto con la sonda; evita el arrastre; mínimo esfuerzo de limpieza | VialTweeter, CupHorn, UIP400MTP |
Ventajas de utilizar la sonicación para la lisis celular
En comparación con otros métodos de lisis y extracción celular, la lisis celular ultrasónica tiene varias ventajas:
- Velocidad: La lisis y extracción celular ultrasónica es un método rápido que puede romper las células en cuestión de segundos. Esto es mucho más rápido que otros métodos como la homogeneización, la congelación-descongelación o el molienda de perlas.
- Eficiencia: La lisis y extracción celular por ultrasonidos puede utilizarse para tratar muestras pequeñas, grandes o múltiples a la vez, lo que la hace más eficaz que otros métodos que requieren el procesamiento individual de muestras pequeñas.
- Libre de químicos: La lisis y extracción celular por ultrasonidos es un método no invasivo que no requiere el uso de productos químicos agresivos o enzimas. Esto lo hace ideal para aplicaciones en las que es necesario mantener la integridad del contenido de la célula. Se puede evitar la contaminación no deseada de las muestras.
- Alto rendimiento: La lisis y extracción celular por ultrasonidos puede extraer un alto rendimiento de contenidos celulares, incluidos ADN, ARN y proteínas. Esto se debe a que las ondas sonoras de alta frecuencia rompen las paredes celulares y liberan el contenido en la solución circundante.
- Control de temperatura: Los sofisticados ultrasonidos permiten un control preciso de la temperatura de la muestra. Los sonicadores digitales de Hielscher están equipados con un sensor de temperatura enchufable y un software de control de temperatura.
- Reproducible: Los protocolos para la lisis celular ultrasónica pueden reproducirse fácilmente e incluso adaptarse a diferentes volúmenes de muestra más grandes o más pequeños mediante un simple escalado lineal.
- Versátil: La lisis y extracción celular por ultrasonidos puede utilizarse para extraer una amplia gama de tipos de células, como bacterias, levaduras, hongos, células de plantas y mamíferos. También se puede utilizar para extraer diferentes tipos de moléculas, incluidas proteínas, ADN, ARN y lípidos.
- Preparación simultánea de numerosas muestras: Hielscher Ultrasonics ofrece varias soluciones para procesar cómodamente numerosas muestras en exactamente las mismas condiciones de proceso. Esto hace que el paso de preparación de muestras de lisis y extracción sea altamente eficiente y ahorre tiempo.
- Fácil de usar: Los equipos de lisis y extracción celular por ultrasonidos son fáciles de usar y requieren una formación mínima. El equipo también es económico, ya que se trata de una inversión única, sin necesidad de volver a comprar los desechos. Esto lo hace atractivo para una amplia gama de investigadores y laboratorios.
En general, la lisis y extracción celular por ultrasonidos es un método rápido, eficaz, controlable con precisión y versátil para extraer contenidos celulares. Sus ventajas sobre los métodos alternativos lo convierten en una opción atractiva para una amplia gama de aplicaciones industriales y de investigación.
Principio de funcionamiento de la lisis celular ultrasónica
La lisis y extracción celular por ultrasonidos utiliza ondas sonoras de alta frecuencia para interrumpir las células y extraer su contenido. Las ondas sonoras crean cambios de presión en el líquido circundante, lo que hace que se formen pequeñas burbujas y colapsen en un proceso conocido como cavitación. Estas burbujas generan fuerzas mecánicas localizadas de alta intensidad que pueden romper las células y liberar su contenido en la solución circundante.
La lisis celular mediante un ultrasonido suele implicar los siguientes pasos:
- La muestra se coloca en un tubo o recipiente con un tampón líquido.
- Se inserta una sonda ultrasónica en la muestra y se aplican ondas sonoras de alta frecuencia con aprox. 20-30 kHz.
- Las ondas ultrasónicas provocan oscilación y cavitación en el líquido circundante, generando fuerzas localizadas que rompen las células y liberan su contenido.
- La muestra se centrifuga o filtra para eliminar cualquier residuo celular, y el contenido extraído se recoge para su análisis posterior.
Desventajas de los métodos comunes de lisis
Durante su trabajo en los laboratorios, es posible que ya haya experimentado la molestia de la lisis celular utilizando protocolos tradicionales de lisis mecánica o química.
- Lisis mecánica: Los métodos de lisis mecánica, como la molienda con mortero o la homogeneización con una prensa francesa, un molino de bolas o un sistema de rotor-estator, a menudo carecen de opciones de control y ajuste precisos. Esto significa que el uso de molienda y molienda puede generar rápidamente calor y fuerzas de cizallamiento que pueden dañar la muestra y desnaturalizar las proteínas. También pueden llevar mucho tiempo y requerir grandes cantidades de material de partida.
- Lisis química: Los métodos de lisis química, como la lisis a base de detergente, pueden dañar la muestra al alterar la bicapa lipídica y desnaturalizar las proteínas. También pueden requerir varios pasos y pueden dejar contaminantes residuales que interfieren con las aplicaciones posteriores. Encontrar la dosis óptima de detergente es un desafío adicional.
- Ciclos de congelación-descongelación: Los ciclos de congelación y descongelación pueden provocar la ruptura de las membranas celulares, pero los ciclos repetidos también pueden provocar la desnaturalización y degradación de las proteínas. Este método también puede requerir varios ciclos, lo que puede llevar mucho tiempo y, a menudo, resulta en rendimientos más bajos.
- Lisis enzimática: Los métodos de lisis enzimática pueden ser específicos para ciertos tipos de células y requieren varios pasos, lo que los hace lentos. También generan residuos y requieren una optimización cuidadosa para evitar la degradación de la muestra. Los kits de lisis enzimática suelen ser caros. Si su procedimiento actual de lisis enzimática no da resultados suficientes, se puede aplicar la sonicación como método sinérgico para intensificar la disrupción celular.
A diferencia de los métodos convencionales de lisis celular mecánicos y químicos, la sonicación es una herramienta muy eficaz y fiable para la desintegración celular que permite un control completo de los parámetros de sonicación. Esto garantiza una alta selectividad en la liberación de materiales y la pureza del producto. [cf. Balasundaram et al., 2009]
Es adecuado para todo tipo de células y fácilmente aplicable a pequeña y gran escala – siempre en condiciones controladas. Los ultrasonidos son fáciles de limpiar. Un homogeneizador ultrasónico siempre cuenta con funciones de limpieza in situ (CIP) y esterilización in situ (SIP). El sonotrodo consiste en una bocina de titanio masiva que se puede limpiar o enjuagar con agua o disolvente (dependiendo del medio de trabajo). El mantenimiento de los ultrasonidos es, debido a su robustez, casi despreciable.
Lisis ultrasónica y disrupción celular
Por lo general, la lisis de las muestras en el laboratorio tarda entre 15 segundos y 2 minutos. Dado que la intensidad de la sonicación es muy fácil de ajustar mediante el ajuste de la amplitud de un tiempo de sonicación, así como eligiendo el equipo adecuado, es posible alterar las membranas celulares de forma muy suave o muy brusca, dependiendo de la estructura celular y de la finalidad de la lisis (por ejemplo, la extracción de ADN requiere una sonicación más suave, la extracción completa de proteínas de bacterias requiere un tratamiento ultrasónico más intenso). La temperatura durante el proceso puede controlarse mediante un sensor de temperatura integrado y puede controlarse fácilmente mediante refrigeración (baño de hielo o celdas de flujo con camisas de refrigeración) o mediante sonicación en modo pulsado. Durante la sonicación en modo pulso, los ciclos cortos de ráfaga de sonicación de 1-15 segundos de duración permiten la disipación del calor y el enfriamiento durante los períodos intermitentes más largos.
Todos los procesos basados en ultrasonidos son completamente reproducibles y escalables linealmente.
El VialTweeter es un homogeneizador ultrasónico para la preparación estéril simultánea, uniforme y rápida de numerosas muestras.
- Preparación de la suspensión celular: Los gránulos celulares deben suspenderse completamente en una solución tampón mediante homogeneización (elija su solución tampón compatible con el análisis siguiente, por ejemplo, el método de cromatografía específico). Añadir lisozimas y/u otros aditivos, si es necesario (también deben ser compatibles con los medios de separación/purificación). Mezclar/homogeneizar la solución suavemente bajo una sonicación suave hasta conseguir una suspensión completa.
Más información sobre las sinergias de las lisozimas combinadas con la sonicación. - Lisis ultrasónica: Colocar la muestra en un baño de hielo. Para la disrupción celular, sonique la suspensión en ráfagas de 60-90 segundos (usando el modo de pulso de su sonicador).
- Separación: Centrifugar el lisado (por ejemplo, 10 min. a 10.000 x g; a 4ºC). Separe el sobrenadante de la pellet de la celda con cuidado. El sobrenadante es el lisado total de la célula. Después de la filtración del sobrenadante, se obtiene un líquido clarificado de la proteína celular soluble.
Las aplicaciones más comunes de los ultrasonidos en biología y biotecnología son:
- Preparación del extracto celular
- Alteración de levaduras, bacterias, células vegetales, tejido celular blando o duro, material nucleico
- Extracción de proteínas
- Preparación y aislamiento de enzimas
- Producción de antígenos
- Extracción de ADN y/o fragmentación dirigida
- preparación de liposomas
La disrupción celular con ultrasonidos de tipo sonda es un método eficaz de preparación de muestras.
Las múltiples aplicaciones de los ultrasonidos se ramifican en los sectores de la biotecnología, la bioingeniería, la microbiología, la biología molecular, la bioquímica, la inmunología, la bacteriología, la virología, la proteómica, la genética, la fisiología, la biología celular, la hematología y la botánica.
Lisis: Ruptura de estructuras celulares
Las células están protegidas por una membrana plasmática semipermeable que consiste en una bicapa fosfo-lipídica (también bicapa proteína-lípido; formada por lípidos hidrofóbicos y moléculas de fósforo hidrofílico con moléculas proteicas incrustadas) y crea una barrera entre el interior de la célula (citoplasma) y el entorno extracelular. Las células vegetales y las células procariotas están rodeadas por una pared celular. Debido a las múltiples capas de pared celular de celulosa, las células vegetales son más difíciles de lisar que las células animales. El interior de la célula, como los orgánulos, el núcleo, las mitocondrias, está estabilizado por el citoesqueleto.
Al lisar las células, se pretende extraer y separar los orgánulos, proteínas, ADN, ARNm u otras biomoléculas.
Métodos convencionales de lisis celular y sus inconvenientes
Existen varios métodos para lisar celdas, que se pueden dividir en métodos mecánicos y químicos, que incluyen el uso de detergentes o solventes, la aplicación de alta presión o el uso de un molino de bolas o de una prensa francesa. La desventaja más problemática de estos métodos es el difícil control y ajuste de los parámetros del proceso y, por lo tanto, del impacto.
La siguiente tabla muestra las principales desventajas de los métodos de lisis comunes:
Tabla: Los métodos convencionales de lisis celular tienen grandes desventajas
Procedimiento de lisis
La lisis es un proceso sensible. Durante la lisis se destruye la protección de la membrana celular, sin embargo, se debe evitar la inactivación, desnaturalización y degradación de las proteínas extraídas por un entorno no fisiológico (desviación del valor de pH). Por lo tanto, en general, la lisis se lleva a cabo en una solución tampón. La mayoría de las dificultades surgen de la disrupción celular incontrolada que resulta en una liberación no dirigida de todo el material intracelular y/o la desnaturalización del producto objetivo.
Preguntas frecuentes sobre la sonicación y la lisis celular
- ¿Se pueden lisar células con sonicación? Sí, la sonicación lisa eficazmente las células utilizando ondas ultrasónicas de alta frecuencia que inducen la cavitación, un fenómeno en el que se forman diminutas burbujas de vapor que colapsan violentamente dentro de la suspensión celular. Las fuerzas mecánicas resultantes rompen las membranas celulares y facilitan la liberación de componentes intracelulares en el líquido.
- ¿Cómo utilizar un sonicador para la lisis celular? La utilización de un sonicador para la lisis celular implica sumergir la sonda del sonicador en una suspensión celular y ajustar parámetros como la amplitud y la duración del pulso. El proceso debe ser monitoreado de cerca para optimizar la disrupción celular y minimizar la desnaturalización de proteínas y la inactivación de enzimas.
- ¿Cuál es el principio de la sonicación para la lisis celular? La sonicación funciona según el principio de cavitación acústica. La energía ultrasónica se transmite al medio líquido, lo que provoca rápidas fluctuaciones de presión que conducen a la formación e implosión de microburbujas. Estas implosiones generan intensas fuerzas de cizallamiento y altas temperaturas localizadas, alterando las estructuras celulares y mejorando la homogeneidad del lisado.
- ¿Cuánto tiempo tarda la sonicación de la lisis celular? La duración de la sonicación para la lisis celular puede variar significativamente en función de factores como el tipo de célula, la densidad celular, la potencia del sonicador y el protocolo específico utilizado. Los procedimientos típicos pueden durar desde varios segundos hasta unos pocos minutos, a menudo realizados en ciclos para gestionar la generación de calor y garantizar una interrupción celular uniforme.
- ¿Cuál es el objetivo de la sonicación en la extracción de proteínas? En la extracción de proteínas, la sonicación sirve para romper eficazmente las membranas celulares y solubilizar las proteínas. Este método es particularmente útil para liberar proteínas desde el interior de los compartimentos celulares, por lo que es esencial para preparar lisados a partir de los cuales se van a purificar o analizar las proteínas.
- ¿Por qué se utiliza la sonicación para la extracción? La sonicación se ve favorecida para la extracción debido a su rápida acción y capacidad para aplicar energía específica, rompiendo las estructuras celulares para liberar moléculas bioactivas sin el uso de tratamientos químicos agresivos, preservando así la integridad funcional de los compuestos extraídos.
- ¿La sonicación interrumpe las interacciones proteína-proteína? Aunque la sonicación puede alterar eficazmente las membranas celulares, también puede alterar las interacciones proteína-proteína. El nivel de perturbación depende de la intensidad de la sonicación y de la duración de la exposición, lo que puede conducir a la desnaturalización o disociación de los complejos proteicos, lo que podría afectar a los estudios analíticos o funcionales posteriores.
- ¿Se puede utilizar la sonicación para lisar la E. coli? Los sonicadores de Hielscher son especialmente eficaces para lisar células bacterianas como la E. coli, que tienen paredes celulares robustas. La técnica proporciona un método físico para cortar la pared celular y la membrana, lo que la convierte en un método preferido para preparar lisados bacterianos en laboratorios de biología molecular y bioquímica.
- ¿Cuáles son los procesos posteriores a la etapa de sonicación?
Los pasos posteriores a la lisis ultrasónica suelen incluir el fraccionamiento del lisado, el aislamiento selectivo de orgánulos y la extracción o purificación de proteínas.
A continuación, el lisado procesado se separa y se prepara para aplicaciones analíticas o funcionales, como la proteómica de alta resolución, la transcriptómica o los estudios de unión a receptores.
Literatura/Referencias
- Balasundaram, B.; Harrison, S.; Bracewell, D. G. (2009): Advances in product release strategies and impact on bioprocess design. Trends in Biotechnology 27/8, 2009. pp. 477-485.
- Vilkhu, K.; Manasseh, R.; Mawson, R.; Ashokkumar, M. (2011): Ultrasonic Recovery and Modification of Food ingredients. In: Feng/ Barbosa-Cánovas/ Weiss (2011): Ultrasound Technologies for Food and Bioprocessing. New York: Springer, 2011. pp. 345-368.
- Nico Böhmer, Andreas Dautel, Thomas Eisele, Lutz Fischer (2012): Recombinant expression, purification and characterisation of the native glutamate racemase from Lactobacillus plantarum NC8. Protein Expr Purif. 2013 Mar;88(1):54-60.
- Brandy Verhalen, Stefan Ernst, Michael Börsch, Stephan Wilkens (2012): Dynamic Ligand-induced Conformational Rearrangements in P-glycoprotein as Probed by Fluorescence Resonance Energy Transfer Spectroscopy. J Biol Chem. 2012 Jan 6;287(2): 1112-27.
- Claudia Lindemann, Nataliya Lupilova, Alexandra Müller, Bettina Warscheid, Helmut E. Meyer, Katja Kuhlmann, Martin Eisenacher, Lars I. Leichert (2013): Redox Proteomics Uncovers Peroxynitrite-Sensitive Proteins that Help Escherichia coli to Overcome Nitrosative Stress. J Biol Chem. 2013 Jul 5; 288(27): 19698–19714.
- Elahe Motevaseli, Mahdieh Shirzad, Seyed Mohammad Akrami, Azam-Sadat Mousavi, Akbar Mirsalehian, Mohammad Hossein Modarressi (2013): Normal and tumour cervical cells respond differently to vaginal lactobacilli, independent of pH and lactate. ed Microbiol. 2013 Jul; 62(Pt 7):1065-1072.