Ultrazvuková izolace kmenových buněk
Sonikace je vysoce účinná mechanická metoda izolace kmenových buněk z lidské tukové tkáně. Ultrazvukem izolovaná stromální vaskulární frakce (SVF) vykazuje významný regenerační potenciál pro lékařské aplikace. Hielscher Ultrasonics nabízí řadu možností přímé a nepřímé sonikace pro získávání kmenových buněk. Najděte ideální sonikátor pro svůj proces izolace kmenových buněk!
Ultrazvuková izolace kmenových buněk
Tuková tkáň odebraná z lidského těla (liposukcí) se ošetří ultrazvukem, aby se tkáň oddělila od kmenových buněk a dalších růstových buněk. Tato oddělená část buněk je známa jako buňky stromální vaskulární frakce (SVF).
Technika ultrazvukové izolace kmenových buněk z tukové tkáně je založena výhradně na principu ultrazvukem vyvolané kavitace, která představuje čistě mechanický smyk. Tyto kavitační smykové síly narušují tukovou tkáň, takže se kmenové buňky uvolňují ze struktury tukové tkáně. Ultrazvuková izolace kmenových buněk je postup bez enzymů, který se vyhýbá použití kolagenázy, trypsinu nebo dispázy.
K oddělení extrahovaných kmenových buněk, mezenchymálních kmenových buněk, endoteliálních prekurzorů a dalších typů růstových buněk se sonikovaná tuková tkáň centrifuguje.
Oddělené kmenové buňky se shromáždí a analyzují z hlediska kvality, včetně počtu buněk, viability, endotoxinu a barvení podle Grama, a poté se ihned použijí k autologní transplantaci nebo se uchovají v kryogenním úložišti.
Proč se vyhnout enzymům?
Protože enzymatické štěpení při izolaci kmenových buněk je spojeno s vysokými náklady a možnými bezpečnostními riziky, jakož i s nedostatečnou účinností [Oberbauer et al. 2015], upřednostňují se neenzymatické izolační metody, jako je ultrazvuková kavitace. Krok ultrazvukové izolace nahrazuje enzymatické štěpení tím, že buňky a buněčné agregáty mechanicky oddělí od tukové tkáně.
GDmini2 na měniči UP200St-TD (200 wattů)
- Rychlá
- Účinná
- Reprodukovatelná
- Bezpečná
- Bez enzymů
- Nákladově efektivní
- Sterilní varianty
Kmenové buňky odvozené z tukové tkáně
Výtěžek kmenových buněk získaný sonikací
Publikovaná metoda izolace stromální vaskulární frakce pomocí ultrazvukové kavitace poskytuje 1,67–2,24 × 107 buněk s viabilitou 97,1–98,9% [Victor, S., 2014]. Výtěžky přibližně 2–4 miliony buněk/gram tukové tkáně byly získány ultrazvukovou lýzou zralých adipocytů v disociované tukové tkáni [Bright et al., 2014].
Ultrazvukem připravené buňky mají ve srovnání se standardní enzymatickou izolační metodou stejně vysoký adipogenní a osteogenní diferenciační potenciál [Oberbauer et al. 2015].
Ultrazvukové systémy pro izolaci kmenových buněk
Pro zajištění nejvyšší bezpečnosti a nejlepší kvality je klíčovým faktorem úspěšné léčby pacientů spolehlivé ultrazvukové zařízení, které umožňuje přesnou kontrolu nad ošetřením kmenových buněk. Hielscher Ultrasonics nabízí různé možnosti autologního separačního procesu pomocí ultrazvukové kavitace k izolaci a získávání kmenových a endoteliálních prekurzorových buněk.
Přímá sonikace pro izolaci kmenových buněk
Při procesu izolace kmenových buněk přímou sonikací se ultrazvuková sonotroda (ultrazvuková špička / sonda) ponoří do tukové tkáně. Prostřednictvím sonotrody se ultrazvukové vlny přenášejí přímo do autologního tuku, takže ultrazvuková kavitace uvolňuje kmenové buňky a stromální buňky ze zbytkové tkáně. Sonikátory Hielscher UP200Ht a UP200St se sonotrodou S26d14 jsou běžně používané systémy pro autologní léčbu kmenovými buňkami. Izolace stromální vaskulární frakce přímou sonikací je většinou vhodná pro použití v prostorách čistých místností.
Nepřímá sonikace pro izolaci kmenových buněk
Protože se kmenové buňky používají pro autologní aplikace, je sterilita procesu velmi důležitá. Proto Hielscher vyvinul několik možností nepřímé sonikace, jako jsou GDmini2, VialTweeter a další zakázkové systémy. Při nepřímé sonikaci se ultrazvukové vlny přenášejí stěnou nádoby do tukové tkáně. Stromální vaskulární frakce (SVF) se od tukové tkáně oddělí ultrazvukovou kavitací stejně jako při přímé sonikaci.
Proces nepřímé sonikace nabízí výhodu zpracování buněk v uzavřené nádobě za podmínek bez kontaminace díky tomu, že je vyloučeno riziko křížové kontaminace způsobené vložením ultrazvukové sonotrody. Izolace buněk probíhá v uzavřeném systému, který zajišťuje sterilní procesní podmínky.
Přečtěte si více o sterilních sonikátorech Hielscher!
Digitální sonikátory Hielscher lze přesně ovládat pomocí dotykového displeje nebo přes webový prohlížeč. Postupy sonikace lze předem nastavit prostřednictvím intuitivního menu. Ultrazvuková zařízení jsou vybavena automatickým záznamem dat (všechna procesní data sonikace se ukládají na integrovanou SD kartu). Příkon ultrazvuku lze přesně přizpůsobit protokolu izolace buněk.
Sonikátor VialTweeter je sterilní homogenizátor pro rovnoměrnou a rychlou sterilní přípravu vzorků.
Literatura/reference
- Oberbauer, Eleni; Steffenhagen, Carolin; Wurzer, Christoph; Gabriel, Christian; Redl, Heinz; Wolbank, Susanne (2015): Enzymatic and non-enzymatic isolation systems for adipose tissue-derived cells: current state of the art. Cell Regeneration (2015) 4:7.
- Stadlmann, J., Taubenschmid, J., Wenzel, D. et al. (2017): Comparative glycoproteomics of stem cells identifies new players in ricin toxicity. Nature 549, 2017. 538–542
- Haghjoo M., Azarbayjani M.A., Peeri M., Hosseini S.A. (2019): Effect of Training, Hyaluronic Acid, and Mesenchymal Stem Cell Therapies on Osteocalcin Gene Expression in Cartilage Tissue of Rats with Knee Osteoarthritis. Gene Cell Tissue 6, 2019.
- Zhu M., Kong D., Tian R., Pang M. , Mo M., Cheng, Y., Yang G., Cheng H.L., Lei X., Fang K., Cheng B., Wu Y. (2020): Platelet sonicates activate hair follicle stem cells and mediate enhanced hair follicle regeneration. Journal of Cellular and Molecular Medicine 24, 2020. 1786–1794.
Užitečná fakta
Co jsou kmenové buňky?
Kmenové buňky jsou nediferencované buňky mnohobuněčného organismu, které mají schopnost neomezeně produkovat další buňky stejného typu. Vyznačují se pozoruhodným potenciálem vyvinout se během raného stadia života a růstu v mnoho různých typů buněk v těle. Nejvýraznějším znakem kmenových buněk je jejich schopnost obnovovat se buněčným dělením a jejich schopnost přeměnit se v buňky specifické pro tkáň nebo orgán se zvláštními funkcemi. Pluripotentní kmenové buňky mají potenciál diferencovat se v kteroukoli ze tří zárodečných buněk: endoderm (vnitřní výstelka žaludku, gastrointestinální trakt, plíce), mezoderm (svaly, kosti, krev, urogenitální systém) nebo ektoderm (epidermální tkáně a nervový systém).
V některých orgánech, jako jsou střevo a kostní dřeň, se kmenové buňky pravidelně dělí, aby opravovaly a nahrazovaly opotřebované nebo poškozené tkáně. V jiných orgánech, jako jsou slinivka břišní a srdce, se kmenové buňky dělí pouze za zvláštních podmínek.
Mezenchymální stromální/kmenové buňky (MSC), které nabízejí vysoký potenciál pro rozmanité terapeutické aplikace v regenerativní a estetické medicíně, se nacházejí hlavně v kostní dřeni, ale lze je izolovat i z jiných tkání (např. chrupavky, tuku, svalových buněk). Mezenchymální kmenové buňky jsou považovány za prototypické dospělé kmenové buňky, které se vyznačují schopností sebeobnovy.
Výzkum kmenových buněk a léčba kmenovými buňkami se využívají ke kultivaci tkání a orgánů pro transplantační účely (tkáňové inženýrství). Další lékařské obory pro využití kmenových buněk zahrnují léčbu onemocnění mozku (např. Parkinsonovy a Alzheimerovy choroby), terapii buněčného deficitu, léčbu krevních onemocnění (např. leukémie), degenerace kloubů a chrupavek (např. osteoartrózy) a také kosmetická ošetření (např. anti-aging ošetření). Obecně mají kmenové buňky velikost přibližně 15–25 mikronů v průměru.
Mezenchymální kmenové buňky (MSC) jsou multipotentní stromální buňky, které mají schopnost diferencovat se v řadu typů buněk, včetně osteoblastů (kostních buněk), chondrocytů (chrupavkových buněk), myocytů (svalových buněk) a adipocytů (tukových buněk).
Co je stromální vaskulární frakce (SVF)?
Stromální vaskulární frakce (SVF) je složkou lipoaspirátu, který lze získat liposukcí z tukové tkáně v lidském těle. Lipoaspirát se skládá z heterogenní směsi buněk a má vysoký obsah kmenových buněk, známých jako kmenové buňky odvozené z tukové tkáně (ASC nebo ADSC), které vykazují podobnosti s kmenovými buňkami kostní dřeně, například schopnost diferencovat se v buňky více linií.
Heterogenní populace stromální vaskulární frakce zahrnuje mimo jiné endoteliální buňky, erytrocyty, fibroblasty, lymfocyty, monocyty/ makrofágy a pericyty, jakož i významný podíl kmenových buněk odvozených z tukové tkáně.
Co jsou stromální/kmenové buňky odvozené z tukové tkáně (ASC)?
Stromální/kmenové buňky odvozené z tukové tkáně (ASC / ADSC) uvolňují vysoké hladiny bioaktivních růstových faktorů, jako je epidermální růstový faktor (EGF), vaskulární endoteliální růstový faktor (VEGF), bazický fibroblastový růstový faktor (bFGF), keratinocytový růstový faktor (KGF), růstový faktor odvozený z krevních destiček (PDGF), hepatocytový růstový faktor (HGF), transformující růstový faktor beta (TGF-β), inzulinový růstový faktor (IGF) a mozkový neurotrofní faktor (BDNF). ACS neuvolňují pouze růstové faktory, ale také secernují cytokiny, včetně ligandu fms-příbuzné tyrozinkinázy 3 (Flt-3), faktoru stimulujícího kolonie granulocytů (G-CSF), faktoru stimulujícího kolonie granulocytů a makrofágů (GM-CSF), faktoru stimulujícího kolonie makrofágů (M-CSF), interleukinů (IL), jako jsou IL-6, IL-7, IL-8, IL-11 a IL-12, leukemického inhibičního faktoru (LIF) a tumor nekrotizujícího faktoru alfa (TNF-α).
Jak se kmenové buňky získávají?
Autologní dospělé kmenové buňky lze u člověka získat z následujících zdrojů:
- Kostní dřeň, která vyžaduje získání odběrem, tj. navrtáním kosti.
- Tuková tkáň (lipidové buňky), která vyžaduje získání liposukcí.
- Krev, která vyžaduje získání aferézou, při níž krev dárce prochází „dialyzačním“ přístrojem, v němž se extrahují kmenové buňky, zatímco ostatní složky krve se vracejí zpět dárci.