Zvětšování měřítka syntézy peptidů: Ultrazvukové strategie pro šaržovou a kontinuální výrobu
Syntéza peptidů za pomoci ultrazvuku kombinuje osvědčené postupy peptidové chemie s vysokofrekvenční mechanickou energií za účelem urychlení reakčních a transportních procesů. Akustická kavitace – vzniku a kolapsu mikroskopických bublin – vyvolává intenzivní lokální promíchávání, mikroproudy a smykové síly. Při syntéze peptidů tyto jevy zlepšují transport reagencií, smáčení pryskyřice, rozpouštění a rozrušování agregátů. Nízkofrekvenční ultrazvuk proto působí především jako nástroj pro intenzifikaci procesu: nenahrazuje chemické vazby, ale může výrazně zrychlit a zefektivnit navazování, odstraňování ochranných skupin, promývání, štěpení a následné zpracování.
Výzva spojená s rozšířením výroby peptidů
Zvětšení výroby peptidů z laboratorního měřítka na průmyslové je náročné, protože se během mnoha cyklů navázání a odstranění ochranných skupin hromadí drobné neefektivnosti, což snižuje výtěžek a zvyšuje množství nečistot, které se obtížně odstraňují. Větší reaktory s sebou přinášejí také omezení v oblasti míchání, přenosu tepla, bobtnání pryskyřice a transportu činidel, zatímco spotřeba rozpouštědel, nároky na čištění a výrobní náklady prudce stoupají. Úspěšné rozšíření výroby proto musí zachovat rovnoměrnost reakce a kvalitu produktu a zároveň zajistit reprodukovatelný průtok, efektivní využití zdrojů a přesnou kontrolu všech kritických parametrů procesu.
Farmaceutická šarže s ultrazvukovým zařízení UIP2000hdT pro zlepšení syntézy peptidů
Strategie syntézy peptidů za pomoci ultrazvuku
Ultrazvuková syntéza peptidů v pevné fázi
Synteza peptidů v pevné fázi (SPPS) s použitím Fmoc je nejrozsáhleji studovanou ultrazvukovou strategií. Ultrazvukové ozařování zlepšuje pronikání odstraňovacích a kopulačních činidel do nabobtnalých polymerových kuliček a zároveň snižuje rozsah stagnujících mezních vrstev kolem pryskyřice. Může také narušit agregaci na pryskyřici, což je významnou příčinou neúplné konverze u hydrofobních a jiných “obtížný” sekvence.
Experimentální studie prokázaly, že za popsaných podmínek je možné pomocí ultrazvuku syntetizovat biologicky aktivní peptidy obsahující až 44 aminokyselinových zbytků, a to při nižší spotřebě materiálu a kratších reakčních časech, aniž by došlo k pozorovanému nárůstu hlavních vedlejších reakcí. (viz Merlino a kol., 2019)
Další studie uváděla čtyřnásobné až čtrnáctinásobné zkrácení doby sestavování u vybraných peptidů; 25-mer s vysokým obsahem hydrofobních zbytků byl sestaven za 347 minut. (viz Silva a kol., 2021)
Ultrazvuk lze provést během:
- Nabobtnání pryskyřice a výměna činidel
- Odstranění ochranné skupiny Fmoc nebo Boc
- Aktivace a vazba aminokyselin
- Mezilehlé praní
- Cykliace přímo na pryskyřici
- Odštěpení hotového peptidu od nosiče
Syntéza v kapalné fázi a syntéza s využitím značek
Ultrazvuk může rovněž zefektivnit konvenční syntézu peptidů v kapalné fázi tím, že urychluje rozpouštění, disperzi činidel a přenos hmoty v heterogenních nebo viskózních směsích. Jeho přínos je obecně největší v případech, kdy je proces omezen mícháním nebo transportem; u zcela homogenní reakce, která je řízena pouze vlastní chemickou kinetikou, může být zlepšení menší.
Při syntéze peptidů s využitím značek se vznikající peptid váže na rozpustnou nebo srážlivou organickou kotvu. Reakce probíhají v roztoku, načež se značený meziprodukt izoluje srážením nebo filtrací. Ultrazvukové ošetření může urychlit vazbu, odstranění ochranných skupin, cyklizaci a odštěpení značky, přičemž udržuje špatně rozpustné meziprodukty v rozptýleném stavu.
| Technika | Jak to podporuje sonikace | Význam a omezení |
|---|---|---|
| Syntéza peptidů v pevné fázi pomocí Fmoc | Ultrazvuková léčba urychluje pronikání piperidinu a odstraňování Fmoc produktů; zlepšuje transport aktivovaných aminokyselin do nabobtnalé pryskyřice; narušuje agregaci na pryskyřici | Nejpřesvědčivější důkazy a obvykle největší přínos |
| Bocova syntéza v pevné fázi | Sonikace zlepšuje pronikání kyseliny, výměnu činidel, navázání a promývání podobně jako u Fmoc chemie | Při manipulaci s kyselinami a při jejich ohřívání je třeba postupovat opatrně |
| Syntéza v roztoku/v kapalné fázi | Ultrazvukové ozařování zlepšuje rozpouštění chráněných aminokyselin, rozptyluje sraženiny a zvyšuje kontakt v dvoufázových reakcích nebo reakcích se suspenzí | Zisk je menší, pokud je reakce již homogenní a její rychlost je omezena chemickými faktory. |
| Syntéza s použitím rozpustných značek nebo na bázi srážení | Ultrazvukové ošetření zajišťuje, že značené meziprodukty zůstávají během kopulace rozptýlené, a může zlepšit jejich rozpouštění před filtrací nebo vysrážením | Vhodné pro špatně rozpustné přípravky nebo přípravky s velkým objemem; ultrazvuk slouží především k usnadnění manipulace a přenosu hmoty |
| Průtoková nebo kontinuální syntéza | Ultrazvukové ozařování pomáhá udržovat kontakt mezi pryskyřicí a kapalinou a potlačuje vznik lokálních oblastí stagnace či agregace | Zvětšení měřítka s využitím konstrukce průtokové komory pro rovnoměrné vystavení ultrazvuku |
| Ligace a cyklizace fragmentů | Ultrazvukové ošetření může rozpustit hydrofobní fragmenty, rozbít agregáty a zlepšit mezimolekulární kontakty | To samo o sobě nezrychluje každou přirozenou chemickou ligaci či makrocyklizaci; dominantní může i nadále být nadměrné zředění nebo mezimolekulární agregace |
| Enzymatická syntéza peptidů | Při vhodné intenzitě může sonikace ovlivnit dynamiku enzymů a zlepšit přenos substrátu, zejména u imobilizovaných enzymů nebo ve dvoufázových médiích | Vysoce závislé na enzymové aktivitě; nadměrná energie způsobuje rozvinutí nebo inaktivaci |
| Ribozomální/rekombinantní syntéza | Žádný přímý vliv na překlad | Ultrazvuk se používá hlavně k rozrušení buněk po expresi |
Zvětšování měřítka ultrazvukových procesů: šaržové, recirkulační a kontinuální zpracování
Ultrazvukové přístroje Hielscher lze hladce začlenit do vašeho konkrétního výrobního systému pro syntézu peptidů.
Pro rozšíření výroby jsou relevantní tři konfigurace reaktorů:
- Dávkové sonikování je jednoduché a flexibilní, avšak s rostoucím objemem nádoby se stává obtížnější zajistit optimální a rovnoměrné sonikování.
- Při recirkulačním zpracování se obsah reaktoru opakovaně čerpá přes ultrazvukovou průtokovou celu, což zajišťuje rovnoměrnější zpracování při zachování flexibility šaržového provozu.
- V systému s kontinuálním průtokem prochází reakční proud jednou nebo více řízenými zónami sonikace. Doba zdržení, průtok a příkon energie lze přesně nastavit, což z tohoto uspořádání činí preferovanou volbu pro vysoce výkonnou a reprodukovatelnou výrobu.
U procesů založených na pryskyřici musí průtoková cesta, čerpadlo a ventily být dimenzovány tak, aby vyhovovaly velikosti kuliček, aniž by docházelo k jejich opotřebení nebo ucpání. Alternativou je zadržet pryskyřici v míchaném reaktoru a ultrazvukovou komorou cirkulovat pouze kapalnou fázi.
2 ks průmyslových ultrazvukových zařízení modelu UIP4000hdT napojený na průtokový reaktor z nerezové oceli určený k výrobě peptidů.
Často kladené otázky týkající se rozšíření syntézy peptidů pomocí ultrazvuku
Co je to ultrazvuková syntéza peptidů?
Ultrazvuková syntéza peptidů využívá zvukové vlny vysoké intenzity ke zlepšení míchání, přenosu hmoty a reakční kinetiky během sestavování peptidů. Akustická kavitace napomáhá pronikání reagencií do nabobtnalé pryskyřice, rozptyluje agregáty a urychluje kroky spojování, odstraňování ochranných skupin, promývání a štěpení.
Jak ultrazvuk zlepšuje syntézu peptidů v pevné fázi?
Při syntéze peptidů v pevné fázi za pomoci ultrazvuku (US-SPPS) zlepšuje sonikace kontakt mezi peptidem vázaným na pryskyřici a rozpuštěnými činidly. To může zkrátit reakční cykly, podpořit úplnější vazbu a omezit vynechání sekvencí, zejména při syntéze hydrofobních, k agregaci náchylných nebo jinak obtížně syntetizovatelných peptidů.
Může ultrazvuk zvýšit výtěžnost a čistotu peptidů?
Ultrazvukové ošetření může zlepšit konverzi, výtěžek surového produktu a čistotu tím, že podporuje rovnoměrné rozložení reagencií a omezuje neúplnou konjugaci. Výsledek závisí na sekvenci peptidu, pryskyřici, rozpouštědle, chemickém postupu konjugace a parametrech ultrazvuku, proto by měl být každý proces optimalizován a analyticky ověřen.
Které kroky syntézy peptidů lze provádět pomocí ultrazvuku?
Ultrazvuk může usnadnit bobtnání pryskyřice, odstranění ochranných skupin Fmoc nebo Boc, navázání aminokyselin, promývání, kondenzaci fragmentů, cyklizaci a odštěpení od pevného nosiče. Může také zlepšit rozpouštění a přenos hmoty při syntéze peptidů v kapalné fázi a při syntéze s využitím značek.
Seznamte se s ultrazvukovou syntézou peptidů – pro syntézu peptidů v pevné fázi a – syntéza metodou TAGGING v kapalné fázi!
Je ultrazvuková syntéza peptidů vhodná pro složité sekvence?
Ano. Ultrazvuk je obzvláště užitečný u hydrofobních sekvencí a sekvencí náchylných k agregaci, protože kavitace a mikroproudění pomáhají narušit agregaci na pryskyřici a zlepšit přístup reagencií k reaktivním místům. U obtížných vazeb může být i nadále nutné použít optimalizované reagencie, opakovat vazbu nebo upravit reakční podmínky.
Je možné zvýšit výrobní kapacitu ultrazvukové syntézy peptidů?
Syntezu peptidů pomocí ultrazvuku lze přenést z laboratorních pokusů do šaržové, recirkulační nebo kontinuální výroby. Zvětšení měřítka se dosahuje zachováním klíčových parametrů, jako jsou amplituda, specifická energie, teplota a doba zdržení, při současném zvýšení ultrazvukového výkonu, plochy sonotrody nebo počtu zpracovatelských modulů.
Co znamená lineární škálovatelnost v oblasti ultrazvuku?
Lineární škálovatelnost znamená, že průtok se může zvyšovat přibližně úměrně s instalovaným ultrazvukovým výkonem, pokud požadovaná energie na jednotku objemu a další procesní podmínky zůstávají konstantní. Například zdvojnásobení efektivního ultrazvukového výkonu může přibližně zdvojnásobit průtok, za předpokladu, že se zachová geometrie reaktoru, teplota a cíle týkající se kvality produktu.
Proč jsou ultrazvukové přístroje Hielscher vhodné pro rozšíření výroby peptidů?
Ultrazvukové přístroje Hielscher pokrývají výkonové rozsahy pro laboratorní, pilotní i průmyslové použití a vyznačují se konzistentními a regulovatelnými provozními parametry. Díky nastavitelné amplitudě, automatickému záznamu dat, monitorování teploty a tlaku, kompatibilitě s průtokovými komůrkami a modulární konfiguraci podporují reprodukovatelný přenos procesů a spolehlivou výrobu.
Mohou sonikátory Hielscher fungovat při nepřetržité výrobě peptidů?
Ano. Průmyslové ultrazvukové zařízení společnosti Hielscher lze integrovat do recirkulačních smyček a kontinuálních průtokových reaktorů. Tyto konfigurace umožňují regulovat dobu zdržení a přísun energie a zároveň snižují rozdíly mezi jednotlivými šaržemi. Průmyslové systémy jsou navrženy pro nepřetržitý provoz 24 hodin denně, 7 dní v týdnu, a to i v náročných výrobních podmínkách.
Co je pro syntézu peptidů vhodnější: ultrazvukové lázně nebo sondové sonikátory?
Ultrazvukové lázně mohou být vhodné pro počáteční screening a souběžnou úpravu malých uzavřených nádob. Ultrazvukové generátory sondového typu přivádějí ultrazvuk přímo do média, čímž zajišťují vyšší intenzitu, lepší kontrolu parametrů a větší škálovatelnost. Z tohoto důvodu se pro pilotní i průmyslovou výrobu obecně upřednostňují sondy a průtokové komory.
Jak se reguluje teplota při ultrazvukové syntéze peptidů?
Vzhledem k tomu, že sonikace vnáší do reakční směsi energii, je nezbytné účinné chlazení. Sonikátory Hielscher jsou k dispozici s plášťovými nádobami, externími výměníky tepla, recirkulací s regulací teploty a pulzní sonikací, což účinně zabraňuje přehřátí. Zásuvné teplotní senzory a programovatelné teplotní limity umožňují spolehlivé sledování a zaznamenávání teploty během celého vývoje i výroby.
Jak si mám vybrat sonikátor značky Hielscher pro syntézu peptidů?
Výběr závisí na objemu šarže, požadovaném průtoku, rozpouštědle, viskozitě, koncentraci pevných látek nebo pryskyřice, požadované měrné energii a výrobním plánu. Laboratorní testy stanoví efektivní procesní rozsah, na jehož základě lze dimenzovat ultrazvukový přístroj Hielscher, sonotrodu a konfiguraci průtokové komory pro zamýšlený výkon.
Literatura / Reference
- Merlino, F., Tomassi, S., Yousif, A. M., Messere, A., Marinelli, L., Grieco, P., Novellino, E., Cosconati, S., Di Maro, S. (2019): Boosting Fmoc Solid-Phase Peptide Synthesis by Ultrasonication. Organic Letters, 21(16), 2019. 6378–6382.
- M. Ramya, Veeranjaneyulu Avula, S. Nandeesh, B. Kirankumar, G. Nagendra (2025): TAG assisted and ultrasonication mediated total synthesis of lipobactin. Results in Chemistry, Volume 18, 2025, 102842.
- Silva, R., Franco Machado, J., Gonçalves, K., Lucas, F. M., Batista, S., Melo, R., Morais, T. S., & Correia, J. (2021): Ultrasonication Improves Solid Phase Synthesis of Peptides Specific for Fibroblast Growth Factor Receptor and for the Protein-Protein Interface RANK-TRAF6. Molecules (Basel, Switzerland), 26(23), 7349.
- Raheem, Shvan J; Schmidt, Benjamin W; Solomon, Viswas Raja; Salih, Akam K; Price, Eric W (2020): Ultrasonic-Assisted Solid-Phase Peptide Synthesis of DOTA-TATE and DOTA-linker-TATE Derivatives as a Simple and Low-Cost Method for the Facile Synthesis of Chelator-Peptide Conjugates. ACS Bioconjugate Chemistry, 2020.
- Salvatore Mottola, Alessandra Del Bene, Vincenzo Mazzarella, Roberto Cutolo, Ida Boccino, Francesco Merlino, Sandro Cosconati, Salvatore Di Maro, Anna Messere (2015): Sustainable Ultrasound-Assisted Solid-Phase peptide synthesis (SUS-SPPS): Less Waste, more efficiency. Ultrasonics Sonochemistry, Volume 114, 2025.
Hielscher Ultrasonics vyrábí vysoce výkonné ultrazvukové homogenizátory od laboratoř k průmyslová velikost.