Ultrazvuková syntéza peptidů pomocí techniky TAGGING

Syntéza peptidů je základním kamenem farmaceutického výzkumu a vývoje, avšak konvenční metody – syntéza peptidů na pevné fázi (SPPS) a klasická kondenzace v roztoku – zůstávají pracné, nehospodárné ve spotřebě reagencií a obtížně škálovatelné. Účinnější alternativa se objevila v kombinaci dvou ortogonálních strategií: techniky TAGGING (temporary anchoring group, tj. dočasná ukotvovací skupina) pro sestavování peptidů v roztoku a ultrazvukového (sonochemického) zpracování ke zrychlení kroků kondenzace, odchránění a zpracování reakční směsi. Společně umožňují výrobu terapeutických peptidů – jako je antibiotický/protirakovinný lipopeptid lipobactin – v gramovém až velkoobjemovém měřítku s vysokou čistotou, sníženou zátěží při purifikaci a dramaticky menším počtem manuálních operací.

Jaké výhody přináší ultrazvuková syntéza peptidů?

• Ekonomika práce v roztoku: Reakce probíhají v roztoku s výrazně nižší spotřebou aminokyselin než u syntézy peptidů na pevné fázi
• Purifikace založená na filtraci: Peptid vázaný na TAG se v polárních rozpouštědlech vysráží, takže intermediáty se izolují jednoduchou filtrací – není nutná kolonová chromatografie ani charakterizace po každém kroku.
• Obrovská úspora práce: Vynechání mezioperační purifikace a spektrálních kontrol ušetří v průběhu celé syntetické kampaně značné množství lidských hodin.
• Sonochemické zrychlení: Sonikace zkracuje každý kritický krok – odchránění Fmoc, kondenzaci postranních řetězců, cyklizaci a globální odchránění – bez kompromisů v selektivitě.
• Vysoké výtěžky, vysoká čistota: Každá kondenzace fragmentů i finální sestavení lipobactinu probíhají s vysokým výtěžkem; globální odchránění poskytuje cílovou látku ve výtěžku ~83 %.
• Připravenost pro velkoobjemové měřítko: Technika TAGGING je výslovně popisována jako technika umožňující velkoobjemovou přípravu peptidů s nejvyšší čistotou, což z ní činí praktickou cestu ke gramovým a kilogramovým množstvím terapeuticky významných lipopeptidů.
• Plná kompatibilita metod: Tento přístup je plně kompatibilní s konvenční SPPS a s chemií v roztoku, takže existující strategie chránicích skupin (Fmoc, Alloc, Pbf, tBu) a kondenzační činidla (T3P, HATU, COMU, DIC/DMAP) lze převzít bez změn.

Co je technika TAGGING?

Při přístupu TAG je peptidový fragment kovalentně ukotven k odstranitelné ukotvovací skupině (TAG) podobné pryskyřici, která zůstává v roztoku. To umožňuje zacházet s rostoucím řetězcem jako s peptidem na pevné fázi, avšak v kapalné fázi:

• Po každé kondenzaci nebo každém odchránění se peptid vázaný na TAG získá jako pevná látka jednoduchou filtrací nebo srážením v polárním prostředí či v prostředí antisolventu, zatímco rozpustné nečistoty a vedlejší produkty se vymyjí.
• Protože peptid zůstává připojen k linkeru, kolonová chromatografie a plná charakterizace každého intermediátu jsou převážně odstraněny, což šetří značný čas a lidské úsilí.
• Reakce lze provádět v roztoku s použitím mnohem menšího množství aminokyselin než u SPPS a finální produkt se uvolní odštěpením skupiny TAG ke konci syntézy.

Pro lipobactin byly při retrosyntéze použity tři fragmenty – Fmoc-Ala-Arg-TAG, Alloc-Thr(Ile-Fmoc)-OH a lipidový fragment C₁₁H₂₃CONH-Ile-Ser(OᵗBu)-OH –, které byly spojeny strategií kondenzace fragmentů, aby byl dlouhý peptid získán ve velmi vysokých výtěžcích. (srov. Ramya et al., 2025)

Kompletní syntéza peptidu lipobactin s podporou TAG je zrychlena sonikací.
(Studie: Ramya et al., 2025)

Jak sonikace zlepšuje syntézu peptidů v roztoku

Ultrazvuk se používá k zintenzivnění a zkrácení klíčových kroků prováděných v roztoku. Při syntéze lipobactinu, jak ji popisují Ramya et al. (2025), se sonikace používá pro:

Protože chemie TAG již poskytuje intermediáty jako filtrovatelné pevné látky, jsou ultrazvuk a TAGGING komplementární: ultrazvuk zrychluje přenos hmoty, míchání a reakční kinetiku, zatímco ukotvení udržuje peptid jako znovu získatelnou pevnou látku pro čistý pracovní postup s minimem chromatografie.

Snadné zvětšování měřítka vysoce čistých peptidů pomocí sonikace

Častou výzvou při přenosu procesů s peptidy a peptidovými léčivy z laboratorního stolu do výroby je zachování sonochemického efektu při větších objemech a při kontinuálním průtoku. Hielscher to řeší souvislou řadou ultrazvukových procesorů od laboratorního až po plně průmyslové měřítko, které poskytují validovaný, reprodukovatelný výkon a dokumentovanou kontrolu procesu.

Průmyslový sonikátor UIP4000hdT (4000W, 20kHz) pro ultrazvukem zdokonalenou syntézu peptidů

Literatura / odkazy

• M. Ramya, Veeranjaneyulu Avula, S. Nandeesh, B. Kirankumar, G. Nagendra (2025): TAG assisted and ultrasonication mediated total synthesis of lipobactin. Results in Chemistry, Volume 18, 2025, 102842.
• Andrew M. Bray; Liana M. Lagniton; Robert M. Valerio; N.Joe Maeji (1994): Sonication-assisted cleavage of hydrophobic peptides. Application in multipin peptide synthesis. Tetrahedron Letters 35(48), 1994. 9079–9082.
• Raheem, Shvan J; Schmidt, Benjamin W; Solomon, Viswas Raja; Salih, Akam K; Price, Eric W (2020): Ultrasonic-Assisted Solid-Phase Peptide Synthesis of DOTA-TATE and DOTA-linker-TATE Derivatives as a Simple and Low-Cost Method for the Facile Synthesis of Chelator-Peptide Conjugates. ACS Bioconjugate Chemistry, 2020.
• M.V. Anuradha, B. Ravindranath (1995): Ultrasound in peptide synthesis. 4: Rapid cleavage of polymer-bound protected peptides by alkali and alkanolamines. Tetrahedron Volume 51, Issue 19, 1995. 5675-5680.