Ultrazvuková syntéza peptidů pomocí techniky TAGGING
Syntéza peptidů je základním kamenem farmaceutického výzkumu a vývoje, avšak konvenční metody – syntéza peptidů v pevné fázi (SPPS) a klasické spojování v roztokové fázi – zůstávají náročné na pracovní sílu, plýtvají reagenciemi a je obtížné je škálovat. Účinnější alternativou se ukázala kombinace dvou vzájemně se doplňujících strategií: technika TAGGING (temporary anchoring group) pro sestavování peptidů v roztokové fázi a ultrazvukové (sonochemické) zpracování k urychlení kroků spojování, odstraňování ochranných skupin a následného zpracování. Společně umožňují výrobu terapeutických peptidů v měřítku od gramů až po velkoobjemovou výrobu. – jako například antibiotikum a protinádorový lipopeptid lipobaktin – s vysokou čistotou, sníženou náročností na čištění a výrazně menším počtem ručních úkonů.
Jaké výhody přináší ultrazvuková syntéza peptidů?
- Ekonomika v roztokové fázi: Reakce probíhají v roztoku s výrazně nižší spotřebou aminokyselin než při syntéze peptidů v pevné fázi
- Čištění pomocí filtrace: Peptid vázaný na TAG se vysráží v polárních rozpouštědlech, takže meziprodukty se izolují jednoduchou filtrací – není nutná kolonová chromatografie ani charakterizace jednotlivých kroků.
- Výrazné úspory v oblasti lidských zdrojů: Odstranění mezilehlých fází čištění a spektrálních kontrol šetří značné množství pracovních hodin v rámci celé syntetické kampaně.
- Sonochemické zrychlení: Ultrazvuková обробка zkracuje každý klíčový krok – Odstranění Fmoc-skupiny, navázání postranního řetězce, cyklizace a celkové odstranění ochranných skupin – aniž by došlo ke snížení selektivity.
- Vysoké výtěžky, vysoká čistota: Každá reakce spojování fragmentů i finální sestavení lipobaktinu probíhají s vysokým výtěžkem; celková deprotekce vede k získání cílového produktu s výtěžkem ~83 %.
- Připravenost pro hromadné nasazení: Technika TAGGING je výslovně popsána jako metoda umožňující hromadnou přípravu peptidů s nejvyšší čistotou, což z ní činí praktický způsob získávání gramových a kilogramových množství terapeuticky významných lipopeptidů.
- Plná kompatibilita metod: Tento přístup je plně kompatibilní s konvenčními metodami SPPS a chemie v roztokové fázi, takže stávající strategie ochranných skupin (Fmoc, Alloc, Pbf, tBu) a spojovací činidla (T3P, HATU, COMU, DIC/DMAP) lze použít beze změn.
Povězte nám o výzvách, s nimiž se potýkáte při syntéze peptidů. Naši odborníci na ultrazvuk vám doporučí ideální konfiguraci ultrazvukového zařízení pro vaše cíle v oblasti výroby peptidů!
Průmyslový sonikátor UIP2000hdT s farmaceutickým šaržovým reaktorem pro vylepšenou syntézu peptidů
Co je to technika TAGGING?
V rámci TAG-metody je peptidový fragment kovalentně vázán na odnímatelnou, pryskyřici podobnou kotevní skupinu (TAG), která zůstává v roztoku. Díky tomu lze s rostoucím řetězcem zacházet jako s peptidem v pevné fázi, avšak v kapalné fázi:
- Po každém spojení nebo odstranění ochranné skupiny se peptid vázaný na TAG izoluje v pevném stavu jednoduchou filtrací nebo srážením v polárním médiu či anti-rozpouštědle, zatímco rozpustné nečistoty a vedlejší produkty se vyplaví.
- Vzhledem k tomu, že peptid zůstává navázán na spojovací řetězec, lze do značné míry upustit od kolonové chromatografie a úplné charakterizace každého meziproduktu, což přináší značnou úsporu času i lidské práce.
- Reakce lze provádět v roztokové fázi, přičemž se spotřebuje mnohem méně aminokyselin než při syntéze SPPS, a konečný produkt se uvolní štěpením skupiny TAG ke konci syntézy.
V případě lipobaktinu se při retrosyntéze použily tři fragmenty – Fmoc-Ala-Arg-TAG, Alloc-Thr(Ile-Fmoc)-OH a lipidový fragment C₁₁H₂₃CONH-Ile-Ser(OᵗBu)-OH – v kombinaci se strategií kondenzace fragmentů, která umožňuje získat dlouhý peptid s velmi vysokými výtěžky. (viz Ramya et al., 2025)
Kompletní syntéza peptidu lipobaktinu za pomoci TAG je urychlena ultrazvukem.
(Studie: Ramya a kol., 2025)
Jak sonikace zlepšuje syntézu peptidů v roztokové fázi
Ultrazvuk se používá k intenzifikaci a zkrácení klíčových kroků v roztokové fázi. Při syntéze lipobaktinu, jak ji popisují Ramya a kol. (2025), se ultrazvuk využívá k:
Vzhledem k tomu, že technologie TAG již produkuje meziprodukty ve formě filtrovatelných pevných látek, jsou ultrazvuková обробka a TAGGING vzájemně se doplňujícími postupy: ultrazvuk urychluje přenos hmoty, míchání a reakční kinetiku, zatímco kotva udržuje peptid ve formě izolovatelné pevné látky, což umožňuje čistý pracovní postup s minimálními chromatografickými kroky.
Sonicator UP200St: Reaktor s ultrazvukovým mícháním pro zrychlenou syntézu peptidů.
Snadné zvýšení výroby vysoce čistých peptidů pomocí ultrazvuku
Častým problémem při přechodu procesů výroby peptidů a peptidových léčiv z laboratorního prostředí do sériové výroby je zachování sonochemického účinku při větších objemech a v kontinuálním průtoku. Společnost Hielscher tento problém řeší pomocí ucelené řady ultrazvukových procesorů od laboratorního až po plně průmyslové provedení, které poskytují ověřený, reprodukovatelný výkon a zdokumentovanou kontrolu procesu.
Průmyslový ultrazvukový přístroj UIP4000hdT (4000 W, 20 kHz) pro syntézu peptidů s využitím ultrazvuku
Často kladené otázky týkající se syntézy TAG peptidů za pomoci ultrazvuku
Co je to syntéza peptidů v kapalné fázi (LPPS)?
Syntéza peptidů v kapalné fázi (LPPS) je metoda postupného sestavování peptidů v roztoku s využitím klasických nástrojů organické chemie. Jedná se o jednu ze čtyř hlavních metod tvorby peptidů a je známá jako nákladově efektivní, škálovatelná a nejšetrnější k životnímu prostředí ze všech přístupů k syntéze peptidů. Je obzvláště vhodná pro kratší peptidy, u delších sekvencí však může narážet na potíže kvůli problémům s udržením konzistentních reakcí, rozpustnosti a odstraňováním nežádoucích vedlejších produktů.
Jak ultrazvuk zlepšuje syntézu peptidů v kapalné fázi?
Ultrazvuk (sonikace) zvyšuje účinnost LPPS tím, že urychluje jak fázi navázání, tak fázi odstranění ochranné skupiny. Ultrazvukové vlny zlepšují přenos hmoty a reakční kinetiku, což vede k:
- Zkrácení reakčních časů: cykly zapínání a odpojování lze výrazně zkrátit
- Vyšší výnosy: úplnější převod v každém kroku
- Zvýšená čistota surového produktu: méně neúplných vedlejších produktů spojování
- Nižší spotřeba činidel: díky rychlejších a účinnějším reakcím je zapotřebí méně ekvivalentů vazebných činidel a aminokyselin
Co je to syntéza peptidů za pomoci technologie TAG (TAPS)?
Syntéza peptidů s využitím značek (TAPS) je zvláštním případem syntézy peptidů v kapalné fázi, při níž se peptidy sestavují krok za krokem v roztoku za použití rozpustných organických značek namísto pevného nosiče. Tyto značky, analogické k pevným nosičům v SPPS, zjednodušují izolaci po každém syntetickém kroku tím, že umožňují separaci srážením, filtrací nebo extrakcí. Značky se musí rozpouštět v organických rozpouštědlech a zároveň se musí odlišovat od ostatních látek.
Jak ultrazvuk zlepšuje proces ZNAČKOVÁNÍ?
Mezi výhody kombinace ultrazvuku se syntézou za pomoci TAG patří:
- Rychlejší cykly připojení a odpojení ochrany – ultrazvuk urychluje reakce v roztokové fázi, čímž zkracuje dobu trvání jednotlivých kroků
- Zlepšená rozpustnost a přenos hmoty – ultrazvuková kavitace pomáhá udržovat homogenitu značeného peptidu v roztoku, což je zásadní, protože rozpustnost je klíčovou výhodou metody TAPS oproti metodě SPPS
- Snížené množství reagentů – vyšší účinnost reakce znamená, že je zapotřebí méně ekvivalentů aminokyselin a kopulačních činidel
- Podrobnější reakce – snížení množství neúplných vedlejších produktů kopulace, což vede k vyšší čistotě suroviny a zjednodušení následného čištění
Významným příkladem je totální syntéza lipobaktinu za pomoci techniky TAG a za působení ultrazvuku, která prokázala, že technika TAGGING je plně kompatibilní s metodami v roztokové fázi a že ultrazvuk zajišťuje vysoké výtěžky v každém kroku. (srov. Ramya et al., 2025)
Jaké délky peptidů lze získat pomocí metody TAPS s využitím ultrazvuku?
Krátké až středně dlouhé peptidy (~5–20 aminokyselin) představují ideální rozsah, ve kterém systém TAPS zajišťuje vysokou čistotu a spolehlivé výsledky.
K delším peptidům lze dospět pomocí strategie kondenzace fragmentů: nejprve se syntetizují menší fragmenty (6–10-mery) s navázaným tagem, které se poté spojí dohromady, čímž vznikne cílový peptid v plné délce.
U velmi dlouhých nebo složitých cílů lze použít hybridní přístup SPPS/TAPS.
Zjistěte, jak ultrazvuk zlepšil syntézu peptidů v pevné fázi (SPPS)!
Je možné syntézu peptidů v kapalné fázi za pomoci ultrazvuku rozšířit na průmyslovou výrobu?
Ano, průmyslové ultrazvukové přístroje – jako například modely Hielscher UIP2000hdT nebo UIP4000hdT – lze integrovat do šaržových reaktorů a průtokových cel, což umožňuje výrobu peptidů ve velkém měřítku. Dodatečná instalace do stávajících reaktorů umožňuje zdokonalit zavedené procesy syntézy peptidů.
Jaké jsou hlavní výhody ultrazvukového LPPS oproti konvenčnímu LPPS?
- Rychlost: Reakční časy se při každém kroku spojování a odstranění ochranné skupiny výrazně zkracují.
- Efektivita: Vyšší výtěžky na jednotlivý krok vedou k vyššímu celkovému výtěžku u peptidů s více zbytky.
- Udržitelnost: méně ekvivalentů činidel a případně i méně rozpouštědla díky rychlejším reakcím.
- Přístupnost: vyžaduje pouze běžnou ultrazvukovou lázeň, žádné speciální přístroje.
- Kompatibilita: je kompatibilní se standardními spojovacími činidly (DIC, HATU, TBTU, Oxyma atd.) a strategiemi ochranných skupin (Boc, Fmoc).
Literatura / Reference
- M. Ramya, Veeranjaneyulu Avula, S. Nandeesh, B. Kirankumar, G. Nagendra (2025): TAG assisted and ultrasonication mediated total synthesis of lipobactin. Results in Chemistry, Volume 18, 2025, 102842.
- Andrew M. Bray; Liana M. Lagniton; Robert M. Valerio; N.Joe Maeji (1994): Sonication-assisted cleavage of hydrophobic peptides. Application in multipin peptide synthesis. Tetrahedron Letters 35(48), 1994. 9079–9082.
- Raheem, Shvan J; Schmidt, Benjamin W; Solomon, Viswas Raja; Salih, Akam K; Price, Eric W (2020): Ultrasonic-Assisted Solid-Phase Peptide Synthesis of DOTA-TATE and DOTA-linker-TATE Derivatives as a Simple and Low-Cost Method for the Facile Synthesis of Chelator-Peptide Conjugates. ACS Bioconjugate Chemistry, 2020.
- M.V. Anuradha, B. Ravindranath (1995): Ultrasound in peptide synthesis. 4: Rapid cleavage of polymer-bound protected peptides by alkali and alkanolamines. Tetrahedron Volume 51, Issue 19, 1995. 5675-5680.
Ultrazvukový CupHorn pro intenzivní sonikaci uzavřených zkumavek a lahviček při sonikaci sterilních peptidů.
Hielscher Ultrasonics vyrábí vysoce výkonné ultrazvukové homogenizátory od laboratoř k průmyslová velikost.