Virové vakcíny na bázi buněčných kultur – účinná dezintegrace buněk pomocí sonikace
Sonikátory Hielscher usnadňují dezintegraci a solubilizaci buněčných kultur infikovaných viry (např. Vero) při sklizni viru při výrobě vakcín. Využijte spolehlivou a účinnou lyzi buněčných kultur pomocí vysoce výkonné sonikace!
Dezintegrace buněk pro sklizeň viru u vakcín na bázi buněčných kultur
Výroba vakcín na bázi buněčných kultur, např. v buněčných liniích Vero, MDCK, EB66, CHO nebo PER.C6, vyžaduje na konci infekčního cyklu získání viru z kultury. V závislosti na viru je velký podíl sklizeného viru asociován s buňkami, a to buď intracelulárně, nebo vázán na buněčnou membránu. Úplná a šetrná sklizeň proto závisí na účinné dezintegraci buněk a solubilizaci buněčné hmoty. Ultrazvuková lyze je spolehlivá a dlouhodobě zavedená metoda dezintegrace buněk a následného uvolňování virů, virových proteinů, DNA a RNA. Při zpracování buněčných kultur infikovaných viry sonikace – aplikace vysoce intenzivního ultrazvuku – otevírá buňky, odděluje virové částice od membrán a buněčných zbytků a homogenizuje sklizeň na čerpatelnou suspenzi s nízkou viskozitou, kterou lze přímo přivádět k čiření, centrifugaci a chromatografii.
Jak sonikace funguje?
Ultrazvuková dezintegrace buněk je založena výhradně na mechanických silách. Akustická kavitace vytváří intenzivní lokální smyk a mikroproudění, které narušují buněčné membrány a podporují přenos hmoty mezi vnitřkem buňky a okolním médiem.
Ultrazvukový systém pro výrobu vakcín: Průmyslový sonikátor UIP2000hdT s reaktorem z nerezové oceli
Jaké jsou výhody ultrazvukové dezintegrace buněk?
Tento mechanismus působení dává sonikaci rozhodující výhodu oproti chemické lyzi: nejsou zapotřebí žádné detergenty, lysozym, proteináza K ani jiná lytická činidla, která mohou změnit lyzát, narušovat následné čištění nebo musí být před dalším zpracováním odstraněna. Enzymatická dezintegrace naproti tomu vyžaduje dlouhou inkubaci a často poskytuje neopakovatelné výsledky. Protože lze intenzitu ultrazvukového zpracování přesně přizpůsobit biologickému vzorku, nedochází k nadměrnému zpracování, degradaci ani ztrátě výtěžku.
Sonikaci použijte k tomu, abyste:
- dezintegrovali a lyzovali buňky adherentních i suspenzních kultur infikované viry
- uvolnili intracelulární virové částice i částice asociované s membránou
- solubilizovali buněčnou hmotu a snížili viskozitu sklizně
- homogenizovali a deaglomerovali buněčné zbytky pro snazší čiření
- dispergovali shluky virů do jednotné suspenze
- inaktivovali patogeny při definované amplitudě, tlaku a době expozice
- zintenzivnili kroky lyze na bázi detergentů nebo enzymů, kde jsou požadovány
Ultrazvuková dezintegrace buněk v průmyslovém měřítku: Sonikátor UIP6000hdT s průtokovou celou z nerezové oceli pro kontinuální zpracování buněčných kultur infikovaných viry.
Sonikátor UP400St s průtokovou celou FC22K pro inline dezintegraci buněk
Proč používat sonikaci při sklizni viru?
Schéma inline zpracování monovalentního rotavirového bulku. Bulkový materiál byl asepticky zpracováván přímo z kultivační nádoby (CF-10), přenášen peristaltickým čerpadlem průtokovou celou sonikátoru za účelem dezintegrace zbývajících buněčných zbytků. Sonikovaný materiál byl poté filtračně vyčiřen, než byl uložen do mezilehlé nádoby pro stabilizaci.
Studie a obrázek: Langston a kol., 2026.
Výhody
- přesně nastavitelné podle procesu
- bezchemická, čistě mechanická lyze
- čisté a hygienické zpracování, průtokové cely kompatibilní s CIP/SIP
- vysoká reprodukovatelnost díky automatickému záznamu dat
- lineární škálování od laboratoře po výrobu
- snadná a bezpečná obsluha, dálkové ovládání přes prohlížeč
- spolehlivé a robustní zařízení pro provoz 24/7
- vysoká energetická účinnost, přibl. 80–90% ze zásuvky do kapaliny
Typické uspořádání procesu pro sklizeň viru
- Sklizeň a zakoncentrování. Získejte infikovanou buněčnou kulturu (sklizňový bujón, buněčný seškrab z bioreaktorů s fixním ložem nebo jednorázových bioreaktorů, nebo centrifugovaný buněčný pelet resuspendovaný v pufru).
- Úprava. Upravte pufr, pH a teplotu. Sonikace také zlepšuje promíchání a rozpouštění složek lyzačního pufru, pokud se používá krok podporovaný pufrem nebo detergentem.
- Ultrazvuková dezintegrace. Veďte suspenzi průtokovou celou s pláštěm a monitorováním teploty (recirkulace pro dávkovou práci, jeden nebo více průchodů pro kontinuální inline zpracování). Nastavte amplitudu a dobu zdržení na minimum, které dosáhne cílové míry dezintegrace, aby byly virové antigeny zachovány.
- Volitelná inaktivace. Použijte vyšší amplitudu, zvýšený tlak a delší expozici, nebo termosonikaci, pro inaktivaci patogenů v souladu s vakcinační strategií.
- Následné zpracování. Vyčiřte, odstřeďte a/nebo zfiltrujte nyní nízkoviskózní, homogenní lyzát, následně proveďte chromatografii, zakoncentrování a formulaci.
Po sklizni: formulace stejnou technologií
Stejná platforma Hielscher, která dezintegruje buňky, zvládá také formulační kroky vakcíny. Ultrazvukové dispergování a deaglomerace vytvářejí jednotné suspenze antigenů, včetně buněčných fragmentů a proteinových antigenů, v polymerech nebo liposomálních enkapsulacích. Adjuvancia na bázi hliníku, například Alhydrogel™, se skládají z drobných primárních částic, které snadno agregují; ultrazvukové dispergování zajišťuje homogenní distribuci antigenů a adjuvans, která je nezbytná pro úspěšnou integraci. Sonikátory Hielscher se dále používají k formulaci léčiv a vakcín do liposomů a nanostrukturovaných nosičů, jako jsou pevné lipidové nanočástice, s přesnou kontrolou velikosti nosiče, lepším nasycením léčivem a zvýšenou stabilitou. Odplynění hotové suspenze před plněním do lahviček nebo injekčních stříkaček je dalším standardním ultrazvukovým krokem.
Další podrobnosti naleznete zde: Ultrazvuk pro výrobu vakcín.
Bezpečné, čisté a připravené pro regulovanou výrobu
- Části přicházející do styku s médiem z titanu nebo nerezové oceli, autoklávovatelné
- K dispozici jsou reaktory s průtokovou celou kompatibilní s CIP/SIP
- Pouzdra z antibakteriálního plastu nebo nerezové oceli pro instalaci v čistých prostorech
- Automatická dokumentace procesu na kartě SD/USB, na které je manipulace zjistitelná
- Nepřetržitý provoz 24/7, nízká údržba, žádné nucené chlazení
- Žádné spotřební kuličky, žádné mlecí komory, žádná křížová kontaminace mezi šaržemi
Design, výroba a poradenství – kvalita vyrobená v Německu
Ultrazvukové přístroje Hielscher jsou známé svou nejvyšší kvalitou a konstrukčními standardy. Robustnost a snadná obsluha umožňují hladkou integraci našich ultrazvukových přístrojů do průmyslových zařízení. Drsné podmínky a náročná prostředí zvládají ultrazvukové přístroje Hielscher snadno.
Hielscher Ultrasonics je společnost s certifikací ISO a klade zvláštní důraz na vysoce výkonné ultrazvukové přístroje s nejmodernější technologií a uživatelskou přívětivostí. Ultrazvukové přístroje Hielscher samozřejmě vyhovují CE a splňují požadavky UL, CSA a RoHs.
Instalace 2x UIP1000hdT (každý 1kW, 20kHz) pro výrobu léčiv
Často kladené otázky o ultrazvukové dezintegraci buněk pro výrobu vakcín na bázi virů
Co je ultrazvuková dezintegrace buněk?
Ultrazvuková dezintegrace buněk využívá vysoce intenzivní ultrazvuk, typicky v rozsahu 20 až 30 kHz, k rozrušení buněčných membrán a uvolnění intracelulárního materiálu. Vysoce výkonné ultrazvukové vlny vytvářejí v kapalině kavitační bubliny. Když tyto bubliny kolabují, vytvářejí intenzivní lokální smykové síly a mikroproudění, které mechanicky narušují buňky a podporují přenos hmoty mezi vnitřkem buňky a okolním médiem. Při výrobě vakcín se toho využívá k lyzi buněčných kultur infikovaných viry a k uvolnění intracelulárních virových částic i částic asociovaných s membránou do sklizně.
Proč při sklizni viru používat sonikaci místo chemické nebo enzymatické lyze?
Sonikace funguje výhradně na mechanické síly. Nejsou zapotřebí žádné detergenty, lysozym, proteináza K ani jiná lytická činidla, která by mohla změnit lyzát, narušovat následné čištění nebo by musela být před dalším zpracováním odstraněna. Chemická činidla obvykle vyžadují časově náročnou vícekrokovou přípravu, aby se zabránilo inhibici následných testů a dalších kroků následného zpracování. Enzymatická dezintegrace vyžaduje dlouhou inkubaci a často poskytuje neopakovatelné výsledky. Ultrazvuková lyze také spojuje kroky resuspendace, dezintegrace a extrakce do jediné kontinuální operace. Pokud váš proces vyžaduje krok podporovaný detergentem nebo enzymem, sonikace jej zintenzivní, místo aby jej nahradila: kavitace oslabuje membrány a zlepšuje rovnoměrné vystavení všech buněk činidlu.
Jak se sonikace srovnává s mechanickými metodami homogenizace?
Sonikátory sondového typu přenášejí ultrazvukovou energii přímo a účinně, protože sonotroda je v přímém kontaktu se vzorkem. Mechanicky poháněné homogenizační techniky často vedou k nižší účinnosti přenosu energie. Ultrazvukové zpracování nepotřebuje spotřební mlecí kuličky ani rotující těsnění v proudu produktu, žádné trysky ani komory, které se mohou ucpat viskózní buněčnou hmotou, a nedochází ke křížové kontaminaci mezi šaržemi.
Může sonikace poškodit virus nebo antigen?
Toto je klíčový úkol optimalizace a je možné jej řídit. Úpravou parametrů ultrazvukového zpracování lze účinky sonikace přesně kontrolovat: nízká amplituda a krátká sonikace mají velmi jemné účinky, zatímco vysoké amplitudy, zvýšený tlak a delší doba sonikace vedou k intenzivnímu zpracování. Protože lze intenzitu přesně přizpůsobit biologickému vzorku, nedochází k nadměrnému zpracování, degradaci ani ztrátě výtěžku. V praxi se amplituda, doba zdržení a počet průchodů nastavují na minimum, které dosáhne cílové míry dezintegrace, s nepřetržitým monitorováním teploty a chlazením.
Snižuje ultrazvukové zpracování viskozitu sklizně?
Ano. Husté sklizně s vysokou hustotou buněk jsou viskózní a obtížně čerpatelné kvůli uvolněné, nefragmentované DNA hostitelských buněk. Ultrazvukové zpracování DNA a RNA stříhá a fragmentuje, solubilizuje buněčnou hmotu a deaglomeruje buněčné zbytky. Výsledkem je homogenní, čerpatelná suspenze, která účinněji zásobuje čiření, centrifugaci a chromatografii. Fragmentace DNA a RNA pomocí řízené sonikace je dobře zavedená laboratorní aplikace téže technologie.
Mohu proces provozovat v kontinuálním inline režimu?
Ano. Sonikátory Hielscher jsou navrženy pro nepřetržitý provoz 24/7 v průmyslovém prostředí a lze je konfigurovat s průtokovými celami a reaktory pro kontinuální inline sonikaci, recirkulační smyčky nebo integraci do výrobních skidů a procesních linek. Možný je provoz s jedním i s více průchody.
Jak provést škálování z laboratoře do výroby?
Lineárně, na základě měřitelného příkonu energie. Všechny výsledky sonikace získané ultrazvukovým homogenizátorem Hielscher lze lineárně škálovat na vyšší průtoky v průmyslové výrobě; parametry sonikace vyvinuté pomocí stolního sonikátoru lze přímo přenést na větší systémy Hielscher. Kritériem škálování je specifický příkon energie na objem spolu s amplitudou, dobou zdržení a teplotou. Procesní poradenství Hielscher zahrnuje doporučení pro optimalizaci parametrů (amplituda, specifická energie E/V, doba zdržení, regulace teploty a tlaku) vázaná na měřitelný příkon energie.
Je ultrazvuková dezintegrace buněk vhodná pro čisté prostory a výrobu ve stylu GMP?
Ultrazvukové přístroje Hielscher lze snadno instalovat v laboratořích s čistými prostory i ve výrobních zařízeních. Pouzdra jsou vyrobena z antibakteriálního plastu nebo nerezové oceli. Všechny části přicházející do styku s médiem, jako jsou sonotrody a průtokové cely, jsou vyrobeny z titanu nebo nerezové oceli a lze je autoklávovat. K dispozici jsou speciální reaktory s průtokovou celou splňující pokročilé požadavky CIP (clean-in-place) a SIP (sterilize-in-place). Měnič průmyslové řady UIP má krytí IP64 a lze jej instalovat i v náročných prostředích, zatímco generátor je umístěn odděleně. Protože sonikátory Hielscher přeměňují elektrickou energii na mechanické kmitání s velmi vysokou účinností přibližně 80–90% ze zásuvky do kapaliny, lze měnič zabudovat do uzavřených pouzder bez větracích štěrbin a není zapotřebí žádné nucené chlazení, například stlačeným vzduchem nebo vodou. To také znamená, že chladicí médium nepřichází do styku s procesem. Automatická dokumentace procesu podporuje dohledatelnost a reprodukovatelnost v regulované výrobě.
Může sonikace také inaktivovat virus pro inaktivovanou vakcínu?
Ano. Výkonový ultrazvuk nachází uplatnění při inaktivaci patogenů, jako jsou bakterie a viry. Při vhodné dávce a intenzitě sonikace lze buňky a mikroby ošetřit v souladu s cílem procesu, takže stejná platforma slouží k lyzi pro sklizeň i k inaktivaci. Kombinace sonikace a tepla, známá jako termosonikace, nabízí rychlejší sterilizaci při výrazně snížené tepelné intenzitě a době působení, což je výhodné pro zachování termolabilních sloučenin, jako jsou proteiny a antigeny. Ultrazvuková inaktivace se obvykle používá v kombinaci se zavedenou inaktivační chemií a úplná kinetika inaktivace musí být validována pro každý konkrétní virus.
Lze stejný systém použít pro formulační kroky po sklizni?
Ano. Stejná platforma zvládá dispergování antigenů do suspenzí, polymerů nebo liposomálních enkapsulací, deaglomeraci a jednotné rozložení antigenů a adjuvans na bázi hliníku, jako je Alhydrogel™, formulaci vakcín do liposomů a pevných lipidových nanočástic s přesnou kontrolou velikosti nosiče a krok odplynění před plněním do lahviček nebo injekčních stříkaček.
Literatura / odkazy
- Langston J. W.; Carroll M.; Whalen M. M.; Jaw, T. M.; Rojas L. V.; Hertel C. C.; Gote V., Balasundaram W.; Serbzhinzhskiy D.; Kapre S.; Olave, I. A. (2026): Novel non-aqueous rotavirus vaccine: Formulated for thermostability and easy administration. Human Vaccines & Immunotherapeutics, 22(1), 2026.
- Mohsen, M.O., Rothen, D., Balke, I. et al. (2021): Neutralization of MERS coronavirus through a scalable nanoparticle vaccine. npj Vaccines 6, 107 (2021).
- Mohsen M.O., Balke I., Zinkhan S. et al. (2022): A scalable and highly immunogenic virus-like particle-based vaccine against SARS-CoV-2. Allergy Vol 77, Issue 1; 2022. 243–257.
- Brittney Mott; Sanjay Thamake; Jamboor Vishwanatha; Harlan P. Jones (2013): Intranasal delivery of nanoparticle-based vaccine increases protection against S. pneumoniae. J Nanopart Res (2013) 15:1646.
Hielscher Ultrasonics vyrábí vysoce výkonné ultrazvukové homogenizátory od laboratorních až po průmyslové velikosti.