Virové vakcíny založené na buněčných kulturách – Účinné rozrušení buněk pomocí ultrazvuku

Často kladené otázky týkající se ultrazvukového rozrušování buněk při výrobě virových vakcín

Co je to ultrazvukové rozrušení buněk?

Ultrazvuková destrukce buněk využívá vysoce intenzivní ultrazvuk, obvykle v rozsahu 20 až 30 kHz, k rozrušení buněčných membrán a uvolnění intracelulárního materiálu. Vysoce výkonné ultrazvukové vlny vytvářejí v kapalině kavitační bubliny. Při kolapsu těchto bublin vznikají intenzivní lokální smykové síly a mikroproudění, které mechanicky rozrušují buňky a podporují přenos hmoty mezi vnitřkem buňky a okolním prostředím. Při výrobě vakcín se tato metoda používá k lýze buněčných kultur infikovaných virem a k uvolnění intracelulárních a membránově vázaných virových částic do získaného produktu.

Proč pro izolaci virů používat sonikaci namísto chemické nebo enzymatické lýzy?

Ultrazvuková léčba využívá čistě mechanické síly. Nejsou zapotřebí žádné detergenty, lysozym, proteináza K ani jiná lyzační činidla, která by mohla změnit složení lyzátu, narušit následné čištění nebo která by bylo nutné před dalším zpracováním odstranit. Chemická činidla obvykle vyžadují časově náročnou vícestupňovou přípravu, aby se zabránilo inhibici následných testů a dalších kroků po zpracování. Enzymatická disrupce vyžaduje dlouhé inkubační doby a často přináší nereprodukovatelné výsledky. Ultrazvuková lýza navíc spojuje kroky resuspenze, rozrušení a extrakce do jediného souvislého procesu. Pokud váš proces vyžaduje krok za pomoci detergentu nebo enzymu, sonikace jej spíše zesiluje, než nahrazuje: kavitace oslabuje membrány a zlepšuje rovnoměrné vystavení všech buněk činidlu.

Jak se sonikace liší od metod mechanické homogenizace?

Ultrazvukové zařízení se sondou přenášejí ultrazvukovou energii přímo a efektivně, protože sonotroda je v přímém kontaktu se vzorkem. Techniky homogenizace s mechanickým pohonem často vedou k nižší účinnosti přenosu energie. Ultrazvukové zpracování nevyžaduje žádné spotřební mlecí kuličky ani rotující těsnění v proudu produktu, žádné trysky ani komory, které by se mohly ucpat viskózní buněčnou hmotou, a nedochází k křížové kontaminaci mezi jednotlivými šaržemi.

Může ultrazvuk poškodit virus nebo antigen?

Jedná se o klíčový optimalizační úkol, který lze řídit. Úpravou parametrů ultrazvukového zpracování lze přesně regulovat účinky sonikace: nízká amplituda a krátká doba sonikace mají velmi mírné účinky, zatímco vysoké amplitudy, zvýšený tlak a delší doba sonikace vedou k intenzivnímu zpracování. Jelikož lze intenzitu přesně přizpůsobit biologickému vzorku, nedochází k nadměrnému zpracování, degradaci ani ke ztrátám výtěžku. V praxi se amplituda, doba zdržení a počet průchodů nastavují na minimum, které umožňuje dosáhnout cílové míry rozrušení, a to při nepřetržitém monitorování teploty a chlazení.

Snižuje ultrazvuková úprava viskozitu sklizeného materiálu?

Ano. Husté kultury s vysokou buněčnou hustotou jsou viskózní a obtížně čerpatelné kvůli uvolněné, nefragmentované DNA hostitelských buněk. Ultrazvukové zpracování rozštěpuje a fragmentuje DNA a RNA, rozpouští buněčnou hmotu a rozrušuje shluky buněčných zbytků. Výsledkem je homogenní, čerpatelná suspenze, která umožňuje efektivnější čiření, odstřeďování a chromatografii. Fragmentace DNA a RNA pomocí řízené sonikace je dobře zavedenou laboratorní aplikací této technologie.

Mohu tento proces spustit v nepřetržitém režimu inline?

Ano. Ultrazvukové přístroje Hielscher jsou navrženy pro nepřetržitý provoz 24 hodin denně, 7 dní v týdnu v průmyslovém prostředí a lze je konfigurovat s průtokovými komorami a reaktory pro nepřetržitou inline sonikaci, recirkulační smyčky nebo integraci do výrobních modulů a zpracovatelských linek. Je možný jak jednoprůchodový, tak i vícenásobný provoz.

Jak přejít z laboratorního prostředí do sériové výroby?

Lineárně, na základě měřitelného energetického vstupu. Všechny výsledky sonikace získané pomocí ultrazvukového homogenizátoru Hielscher lze lineárně škálovat na vyšší průtoky v průmyslové výrobě; parametry sonikace vyvinuté na stolním sonikátoru lze přímo přenést na větší systémy Hielscher. Kritériem pro škálování je specifický energetický příkon na objem spolu s amplitudou, dobou zdržení a teplotou. Poradenství společnosti Hielscher v oblasti procesů zahrnuje doporučení pro optimalizaci parametrů (amplituda, specifická energie E/V, doba zdržení, teplota a regulace tlaku) v závislosti na měřitelném energetickém příkonu.

Je ultrazvukové rozrušování buněk vhodné pro výrobu v čistých prostorách a v souladu s GMP?

Ultrazvukové přístroje Hielscher lze snadno instalovat v laboratořích a výrobních zařízeních s čistým prostorem. Kryty jsou vyrobeny z antibakteriálního plastu nebo nerezové oceli. Všechny části přicházející do styku s médiem, jako jsou sonotrody a průtokové komory, jsou vyrobeny z titanu nebo nerezové oceli a lze je sterilizovat v autoklávu. K dispozici jsou speciální průtokové reaktory splňující pokročilé požadavky CIP (clean-in-place) a SIP (sterilize-in-place). Převodník průmyslové řady UIP má stupeň krytí IP64 a lze jej instalovat do náročných prostředí, zatímco generátor je umístěn na dálku. Vzhledem k tomu, že sonikátory Hielscher přeměňují elektrickou energii na mechanické kmitání s velmi vysokou účinností přibližně 80–90 % od zástrčky do kapaliny, lze měnič zabudovat do uzavřených krytů bez větracích otvorů a není nutné žádné nucené chlazení, jako je stlačený vzduch nebo voda. To také znamená, že žádné chladicí médium nepřichází do styku s procesem. Automatická dokumentace procesu podporuje sledovatelnost a reprodukovatelnost v regulované výrobě.

Může ultrazvuk také inaktivovat virus pro výrobu inaktivované vakcíny?

Ano. Výkonný ultrazvuk nachází uplatnění při inaktivaci patogenů, jako jsou bakterie a viry. Při vhodné dávce a intenzitě sonikace lze buňky a mikroorganismy zpracovávat v souladu s cílem procesu, takže stejná platforma slouží jak k lýze za účelem izolace, tak k inaktivaci. Kombinace sonikace a tepla, známá jako termosonikace, nabízí rychlejší sterilizaci při výrazně snížené tepelné intenzitě a kratší době působení, což je výhodné pro zachování tepelně citlivých sloučenin, jako jsou proteiny a antigeny. Ultrazvuková inaktivace se obecně používá v kombinaci se zavedenými chemickými metodami inaktivace a pro každý konkrétní virus musí být ověřena kompletní kinetika inaktivace.

Lze stejný systém použít i pro jednotlivé kroky zpracování po sklizni?

Ano. Stejná platforma zajišťuje disperzi antigenů do suspenzí, polymery nebo do liposomálních kapslí, deaglomeraci a rovnoměrné rozptýlení antigenů a adjuvantů na bázi hliníku, jako je Alhydrogel™, přípravu vakcín do liposomů a pevných lipidových nanočástic s přesnou kontrolou velikosti nosiče a odplynění před plněním do lahviček nebo injekčních stříkaček.