Ultrazvučna izolacija matičnih ćelija
- Ultrazvučna kavitacija je visoko efikasna mehanička metoda za izolaciju matičnih ćelija iz ljudskog masnog tkiva.
- Ultrazvučno izolirana stromalna vaskularna frakcija (SVF) pokazuje visok regenerativni potencijal za medicinske primjene.
- Hielscher Ultrasonics nudi različite mogućnosti direktne i indirektne sonikacije za prikupljanje matičnih stanica.
Ultrazvučna izolacija matičnih ćelija
Iz ljudskog tijela ekstrahirano masno tkivo (putem liposukcije) se tretira ultrazvukom kako bi se uklonilo tkivo iz matičnih stanica i drugih stanica rasta. Ovaj odvojeni dio ćelija poznat je kao ćelije stromalne vaskularne frakcije (SVF).
Tehnika ultrazvučne izolacije matičnih ćelija iz masnog tkiva zasniva se isključivo na principu rada ultrazvučne kavitacije, a to je mehaničko smicanje. Kavitacijske sile smicanja remete masno tkivo, tako da se matične ćelije oslobađaju iz strukture masnog tkiva. Ultrazvučna izolacija matičnih stanica je postupak bez enzima, izbjegavajući upotrebu kolagenaze, tripsina ili dispaze.
Da bi se odvojile ekstrahovane matične ćelije, mezenhimske matične ćelije, endotelni prekursori i drugi tipovi ćelija rasta, sonicirano masno tkivo se centrifugira.
Odvojene matične ćelije se sakupljaju i analiziraju na njihov kvalitet, uključujući broj ćelija, vitalnost, endotoksin i bojenje po gramu prije nego što se odmah koriste za autolognu transplantaciju ili se čuvaju u krio-skladištu.
Zašto izbjegavati enzime?
Budući da je enzimska probava za izolaciju matičnih ćelija praćena visokim troškovima i mogućim sigurnosnim rizicima, kao i nedostatkom efikasnosti [Oberbauer et al. 2015], preferiraju se neenzimske metode izolacije kao što je ultrazvučna kavitacija. Korak ultrazvučne izolacije zamjenjuje enzimsku probavu odvajajući ćelije i stanične agregate mehanički od masnog tkiva.
GDmini2 kod UP200St-TD sonde (200 vati)
- rapid
- efikasan
- reproducibilan
- sigurno
- Bez enzima
- Isplativo
- Sterilne opcije
Matične ćelije dobijene iz masnog tkiva
Prinos matičnih ćelija
Objavljena metoda SVF izolacije korištenjem ultrazvučne kavitacije u 1,67–2,24 × 107 ćelije sa vijabilnošću od 97,1–98,9% [Victor, S., 2014]. Prinos ćelija od oko 2-4 miliona ćelija/gram masnog tkiva dobijen je ultrazvučnom lizom zrelih adipocita u disociranom masnom tkivu [Bright et al., 2014].
Ultrazvučno pripremljene ćelije poseduju podjednako visok potencijal adipogene i osteogene diferencijacije, u poređenju sa standardnom metodom enzimske izolacije [Oberbauer et al. 2015].
Ultrazvučni sistemi za izolaciju matičnih ćelija
Kako bi se osigurala najveća sigurnost i najbolji kvalitet, pouzdana ultrazvučna oprema, koja omogućava preciznu kontrolu nad tretmanom matičnim ćelijama, ključni je faktor za uspješno liječenje pacijenata. Hielscher Ultrasonics nudi različite opcije za autologni proces ultrazvučnog odvajanja kavitacije za izolaciju i žetvu matičnih i endotelnih prekursora stanica.
direktna sonikacija
Za proces izolacije matičnih ćelija putem direktne sonikacije, ultrazvučni rog (sonotroda, ultrazvučni vrh/sonda) je uronjen u masno tkivo. Preko sonotrode, ultrazvučni talasi se spajaju direktno u autolognu masnoću tako da ultrazvučna kavitacija oslobađa matične ćelije i stromalne ćelije iz zaostalog tkiva. Hielscher ultrazvučni procesori UP200Ht i UP200St sa sonotrodom S26d14 se obično koriste sistemi za tretman autolognim matičnim ćelijama. SVF izolacija direktnim ultrazvukom je uglavnom pogodna za upotrebu u čistim prostorijama.
indirektna sonikacija
Budući da se matične ćelije koriste za autologne aplikacije, sterilnost procesa je veoma važna. Stoga je Hielscher razvio nekoliko opcija indirektne sonikacije kao što su GDmini2, VialTweeter i drugi prilagođeni sistemi. Indirektnom sonikacijom, ultrazvučni talasi se spajaju kroz zidni kontejner u masno tkivo. Stromalna vaskularna frakcija (SVF) se odvaja od masnog tkiva ultrazvučnom kavitacijom kao i prilikom direktne sonikacije.
Indirektni proces sonikacije nudi prednost obrade ćelija u zatvorenoj posudi ispod uslovi bez kontaminacije budući da je eliminisan rizik od unakrsne kontaminacije umetanjem ultrazvučne sire (sonotrode). Izolacija ćelija se vrši u zatvorenom sistemu koji obezbeđuje sterilne uslove procesa.
Hielscher-ovi digitalni ultrazvučni uređaji mogu se precizno kontrolirati putem zaslona na dodir ili kontrole preglednika. Procedure sonikacije mogu se unaprijed postaviti putem intuitivnog izbornika. Ultrazvučni uređaji su opremljeni automatskim snimanjem podataka (svi podaci procesa sonikacije pohranjeni su na integriranoj SD kartici). Ultrazvučna ulazna snaga može se precizno prilagoditi protokolu za izolaciju ćelija.
Literatura/Reference
- Oberbauer, Eleni; Steffenhagen, Carolin; Wurzer, Christoph; Gabriel, Christian; Redl, Heinz; Wolbank, Susanne (2015): Enzimski i neenzimski sistemi izolacije za ćelije izvedene iz masnog tkiva: trenutno stanje tehnike. Cell Regeneration (2015) 4:7.
Činjenice koje vrijedi znati
matične ćelije
Matične ćelije su nediferencirane ćelije višećelijskog organizma koje imaju sposobnost da proizvode neograničeno više ćelija istog tipa. Karakteriše ih izuzetan potencijal da se razviju u mnogo različitih tipova ćelija u telu tokom ranog stanja života i rasta. Najistaknutija karakteristika matičnih ćelija je njihova sposobnost da se obnavljaju deobom ćelija i njihova sposobnost da se pretvore u ćelije specifične za tkivo ili organ sa posebnim funkcijama. Pluripotentne matične ćelije imaju potencijal da se diferenciraju u bilo koju od tri zametne ćelije: endoderm (unutrašnja sluznica želuca, gastrointestinalnog trakta, pluća), mezoderm (mišići, kosti, krv, urogenitalni) ili ektoderm (epidermalno tkivo i nervni sistem).
U nekim organima, kao što su crijeva i koštana srž, matične ćelije se redovno dijele kako bi popravile i zamijenile istrošena ili oštećena tkiva. U drugim organima, kao što su pankreas i srce, matične ćelije se dijele samo pod posebnim uvjetima.
Mezenhimalne stromalne/matične ćelije (MSC), koje nude veliki potencijal za višestruku terapijsku primjenu u regenerativnoj i estetskoj medicini, uglavnom se nalaze u koštanoj srži, ali se mogu izolirati iz drugih tkiva (npr. hrskavice, masti, mišićnih stanica), također. Mezenhimalne matične ćelije smatraju se prototipskim odraslim matičnim stanicama koje karakterizira njihova sposobnost samoobnavljanja.
Istraživanje i tretmani matičnih ćelija koriste se za kultivaciju tkiva i organa za potrebe transplantacije (tkivni inženjering). Ostala medicinska polja za primjenu matičnih stanica mogu se naći u liječenju bolesti mozga (npr. Parkinsonova i Alchajmerova bolest), terapiji nedostatka stanica, bolesti krvi (npr. leukemija), degeneraciji zglobova i hrskavice (npr. osteoartritis) kao i kozmetičkim tretmanima (npr. tretmani protiv starenja). Općenito, matične ćelije imaju veličinu od cca. 15-25 mikrona u prečniku.
mezenhimske matične ćelije (MSC) su multipotentne stromalne ćelije, koje imaju sposobnost da se diferenciraju u različite tipove ćelija, uključujući osteoblaste (koštane ćelije), hondrocite (ćelije hrskavice), miocite (mišićne ćelije) i adipocite (masne ćelije).
Stromalna vaskularna frakcija (SVF)
Stromalna vaskularna frakcija (SVF) je komponenta lipoaspirata koja se može ekstrahirati liposukcijom iz masnog tkiva u ljudskom tijelu. Lipoaspirat se sastoji od heterogene mješavine stanica i ima visok sadržaj matičnih stanica, poznatih kao matične ćelije izvedene iz masnoće (ASC ili ADSC), koje pokazuju sličnosti sa matičnim stanicama koštane srži, kao što je njihova sposobnost da se diferenciraju u višelinijske stanice.
Heterogena populacija SVF-a uključuje endotelne ćelije, eritrocite, fibroblaste, limfocite, monocite/makrofage i pericite između ostalog, kao i važnu frakciju matičnih ćelija dobijenih iz masnoće.
Stromalne/matične ćelije izvedene iz masnoće (ASC)
Stromalne/matične ćelije (ASC/ADSC) koje potiču iz masnoće oslobađaju visoke nivoe bioaktivnih faktora rasta kao što su epidermalni faktor rasta (EGF), vaskularni endotelni faktor rasta (VEGF), osnovni faktor rasta fibroblasta (bFGF), faktor rasta keratinocita (KGF) , faktor rasta izveden iz trombocita (PDGF), faktor rasta hepatocita (HGF), transformirajući faktor rasta-beta (TGF-β), faktor rasta inzulina (IGF) i neurotrofni faktor iz mozga (BDNF). ACS ne samo da oslobađa faktore rasta, oni također luče citokine uključujući fms-srodni ligand tirozin kinaze 3 (Flt-3), faktor koji stimulira kolonije granulocita (G-CSF), faktor stimulacije kolonija granulocita makrofaga (GM-CSF), makrofag - faktor stimulacije kolonija (M-CSF), interleukin (IL) kao što je IL-6, IL-7, IL-8, IL-11 i IL-12, faktor inhibitora leukemije (LIF) i faktor nekroze tumora-alfa (TNF-α).
Ekstrakcija tipova matičnih ćelija
Autologne matične ćelije odraslih ljudi mogu se izdvojiti iz sljedećih izvora:
- Koštana srž, koja zahtijeva ekstrakciju vađenjem, odnosno bušenjem kosti.
- Masno tkivo (lipidne ćelije), koje zahteva ekstrakciju liposukcijom.
- Krv, koja zahtijeva ekstrakciju putem afereze, pri čemu krv davaoca prolazi kroz a “dijaliza” mašina u kojoj se izvlače matične ćelije dok se ostale komponente krvi vraćaju davaocu.