Sonikacija za lizu: poremećaj ćelija i ekstrakcija

Ćelijska dezintegracija ili liza je čest deo svakodnevne pripreme uzoraka u biotehnološkim laboratorijama. Cilj lize je poremetiti dijelove ćelijskog zida ili kompletne ćelije za oslobađanje bioloških molekula. Ultrazvučni homogenizatori se široko koriste za uspešnu lizu ćelija. Glavna prednost sofisticiranih ultrazvučnika je precizna kontrola parametara procesa kao što su intenzitet i temperatura, što omogućava blag, ali visoko efikasan poremećaj i ekstrakciju ćelija.

Liza ćelija pomoću ultrazvuka

Ultrazvučna liza i ekstrakcija ćelija je metoda koja se koristi za razbijanje otvorenih ćelija i izdvajanje sadržaja pomoću visokofrekventnih zvučnih talasa, odnosno ultrazvuka. Sonikacija je tehnika lize, koja se široko koristi kao uspostavljena i pouzdana metoda ćelijskog poremećaja i ekstrakcije unutarćelijskog materijala. Ultrazvučna liza je pouzdana tehnika za pripremu lizata koji sadrži npr. plazmid, testove receptora, proteine, DNK, RNK itd. Kako se ultrazvučni intenzitet može izjednačiti podešavanjem parametara procesa, optimalni intenzitet sonifikacije od vrlo mekog do intenzivnog može se postaviti pojedinačno za svaku supstancu i medij kako bi se zadovoljili specifični zahtjevi primjene. Sljedeći koraci lize su frakcionacija, izolacija organela ili/i ekstrakcija i prečišćavanje proteina. Ekstrahirani materijal (= lizat) mora biti odvojen i podložan je daljnjim istraživanjima ili primjenama, npr. za proteomska istraživanja.

U poređenju sa drugim metodama lize ćelija i ekstrakcije, ultrazvučna liza ćelija ima nekoliko prednosti:

1. Brzina: Ultrazvučna liza i ekstrakcija ćelija je brza metoda koja može razbiti otvorene ćelije za nekoliko sekundi. Ovo je mnogo brže od drugih metoda kao što su homogenizacija, zamrzavanje ili glodanje perli.
2. efikasnost: Ultrazvučna liza i ekstrakcija ćelija može se koristiti za tretiranje malih, velikih ili višestrukih uzoraka odjednom, što ga čini efikasnijim od drugih metoda koje zahtevaju individualnu obradu malih uzoraka.
3. Bez hemikalijaUltrazvučna liza i ekstrakcija ćelija je neinvazivna metoda koja ne zahteva upotrebu teških hemikalija ili enzima. To ga čini idealnim za aplikacije u kojima je potrebno održavati integritet sadržaja ćelije. Može se izbjeći neželjena kontaminacija uzoraka.
4. Visoki prinos: Ultrazvučna liza i ekstrakcija ćelija može izdvojiti visok prinos ćelijskog sadržaja, uključujući DNK, RNK i proteine. To je zato što visokofrekventni zvučni talasi razbijaju ćelijske zidove i oslobađaju sadržaj u okolno rešenje.
5. Kontrola temperature: Sofisticirani ultrazvučni sistemi omogućavaju preciznu kontrolu temperature uzorka. Hielscher digitalni ultrazvučni senzor opremljen je senzorom temperature i softverom za praćenje temperature.
6. Reproducibilno: Protokoli za ultrazvučnu lizu ćelija mogu se lako reprodukovati, pa čak i uskladiti sa različitim većim ili manjim volumenima uzorka jednostavnim linearnim skaliranjem.
7. Versatile: Ultrazvučna liza i ekstrakcija ćelija može se koristiti za izdvajanje širokog spektra tipova ćelija, uključujući bakterije, kvasac, gljivice, biljne i sisarske ćelije. Također se može koristiti za izdvajanje različitih vrsta molekula, uključujući proteine, DNK, RNK i lipide.
8. Istovremena priprema brojnih uzoraka: Hielscher Ultrasonics nudi nekoliko rješenja za udobnu obradu brojnih uzoraka pod potpuno istim uvjetima procesa. To čini korak pripreme uzorka lize i ekstrakcije visoko efikasnim i štedljivim vremenom.
9. Jednostavan za upotrebu: Oprema za lizu i ekstrakciju ultrazvučnih ćelija je jednostavna za upotrebu i zahteva minimalnu obuku. Oprema je takođe ekonomična jer je to jedinstvena investicija bez potrebe za ponovnom kupovinom otuđenja. To ga čini atraktivnim za širok spektar istraživača i laboratorija.

Sve u svemu, ultrazvučna liza i ekstrakcija ćelija je brza, efikasna, precizno kontrolisana i svestrana metoda za ekstrakciju ćelijskog sadržaja. Njegove prednosti u odnosu na alternativne metode čine ga atraktivnim izborom za širok spektar istraživačkih i industrijskih primjena.

Princip rada ultrazvučne lize ćelija

Ultrazvučna liza i ekstrakcija ćelija koristi visokofrekventne zvučne talase za ometanje ćelija i izdvajanje njihovog sadržaja. Zvučni talasi stvaraju promene pritiska u okolnoj tečnosti, uzrokujući formiranje i kolaps malih mehurića u procesu poznatom kao kavitacija. Ovi mehurići generišu lokalizovane visoko intenzivne mehaničke sile koje mogu razbiti otvorene ćelije i osloboditi njihov sadržaj u okolni rastvor.

Liza ćelija pomoću ultrazvučnika obično uključuje sljedeće korake:

• Uzorak se stavlja u cev ili kontejner sa tečnim baferom.
• U uzorak se ubacuje ultrazvučna sonda, a primjenjuju se visokofrekventni zvučni talasi sa cca 20-30 kHz.
• Ultrazvučni talasi uzrokuju oscilaciju i kavitaciju u okolnoj tečnosti, stvarajući lokalizovane sile koje razbijaju otvorene ćelije i oslobađaju njihov sadržaj.
• Uzorak se centrifugira ili filtrira kako bi se uklonili bilo koji ćelijski otpad, a izdvojeni sadržaj se prikuplja za nizvodnu analizu.

Snažni ultrazvučni talasi ometaju ćelijsku matricu bioloških struktura i oslobađaju bioaktivne spojeve. Pojačava se prenos mase između biljnog materijala i rastvarača (npr. pufer). (grafički: ©Vilkhu et al., 2006.)

Nedostaci uobičajenih metoda lize

Tokom rada u laboratorijama, možda ste već iskusili probleme sa lizom ćelija koristeći tradicionalne mehaničke ili hemijske protokole lize.

• Mehanička liza: Mehaničke metode lize, kao što je brušenje malterom i tučnjavom ili homogenizacija pomoću francuske prese, mlina za perle ili rotor-statorskog sistema često nemaju kontrolu i opcije podešavanja. To znači da upotreba glodanja i brušenja može brzo generisati toplotu i sile smicanja koje mogu oštetiti uzorak i denaturirati proteine. Takođe mogu biti dugotrajni i zahtevaju velike količine početnog materijala.
• Hemijska liza: Metode hemijske lize, kao što je liza zasnovana na deterdžentu, mogu oštetiti uzorak ometanjem lipidnog dvosloja i denaturacijom proteina. Oni takođe mogu zahtevati više koraka i mogu ostaviti rezidualne zagađivače koji ometaju nizvodne aplikacije. Pronalaženje optimalne doze deterdženta predstavlja dodatni izazov.
• Ciklusi zamrzavanja: Ciklusi zamrzavanja mogu uzrokovati pucanje ćelijskih membrana, ali ponovljeni ciklusi također mogu uzrokovati denaturaciju i degradaciju proteina. Ova metoda također može zahtijevati više ciklusa, što može biti dugotrajno i često rezultira nižim prinosima.
• Enzimska liza: Metode enzimske lize mogu biti specifične za određene tipove ćelija i zahtijevaju više koraka, što ih čini dugotrajnim. Oni takođe generišu otpad i zahtevaju pažljivu optimizaciju kako bi se izbegla degradacija uzorka. Enzimski kompleti za lizu su često skupi. Ako vaš trenutni postupak enzimske lize daje nedovoljne rezultate, sonikacija kao sinergistička metoda može se primijeniti za intenziviranje ćelijskog poremećaja.

Za razliku od konvencionalnih mehaničkih i hemijskih metoda lize ćelija, sonifikacija je veoma efikasan i pouzdan alat za dezintegraciju ćelija koji omogućava potpunu kontrolu nad parametrima sonifikacije. Ovo osigurava visoku selektivnost na oslobađanju materijala i čistoći proizvoda. [cf. Balasundaram et al., 2009]
Pogodan je za sve tipove ćelija i lako se primenjuje u malim i velikim razmerama. – Uvek u kontrolisanim uslovima. Ultrazvučni efekti se lako čiste. Ultrazvučni homogenizator uvijek ima funkciju čišćenja na mjestu (CIP) i sterilizacije na mjestu (SIP). Sonotroda se sastoji od masivnog titanijumskog roga koji se može obrisati ili isprati u vodi ili rastvaraču (u zavisnosti od radnog medija). Održavanje ultrazvučnika je zbog njihove robusnosti gotovo zanemarivo.

Ultrazvučna liza i poremećaj ćelije

Generalno, liza uzoraka u laboratoriji traje između 15 sekundi i 2 minuta. Kako je intenzitet ultrazvukanja vrlo lako prilagoditi amplitudom postavljanjem vremena snimanja, kao i odabirom prave opreme, moguće je poremećati ćelijske membrane veoma nežno ili vrlo naglo, u zavisnosti od strukture ćelije i svrhe lizi ( npr. ekstrakcija DNK zahteva mekšu sonikaciju, potpunu ekstrakciju proteina bakterija zahteva intenzivniji ultrazvučni tretman). Temperatura tokom procesa može se kontrolisati pomoću integrisanog temperaturnog senzora i može se lako kontrolisati hlađenjem (ledeno kupatilo ili ćelije protoka sa rashladnim plahtama) ili pomoću sonifikacije u pulznom režimu. Tokom ultrazvučnog pulsnog režima, kratki ciklusi pucanja u trajanju od 1-15 sekundi omogućavaju disipaciju toplote i hlađenje tokom dužih prekidnih perioda.
Svi procesi ultrazvuk vođena su potpuno ponovljive i linearno skalabilan.

Ultrazvučni homogenizatori za lizu i ekstrakciju ćelija

Različite vrste ultrazvučnih uređaja omogućavaju usklađivanje cilja pripreme uzorka i osiguravanje jednostavnosti upotrebe i udobnosti rada. Ultrazvučni uređaji tipa sonde su najčešći uređaji u laboratoriji. Najpogodniji su za pripremu malih i srednjih uzoraka zapremine 0,1mL do 1000mL. Različite veličine snage i sonotrode omogućavaju prilagođavanje ultrazvučnika zapremini uzorka i posude za najefikasnije i najefikasnije sonične rezultate. Ultrazvučni uređaj je najbolji izbor kada se moraju pripremiti pojedinačni uzorci.

Ako je potrebno pripremiti više uzoraka, npr. 8-10 bočica ćelijskog rastvora, intenzivna indirektna sonifikacija ultrazvučnim sistemima kao što su VialTweeter ili ultrazvučni čupavac su najpogodnija metoda homogenizacije za efikasnu lizu. Nekoliko bočica se sonicira u isto vrijeme, istog intenziteta. Ovo štedi ne samo vreme, već obezbeđuje i isti tretman svih uzoraka, što čini rezultate među uzorcima pouzdanim i uporedivim. Osim toga, tokom indirektne sonične unakrsne kontaminacije uranjanjem ultrazvučne sonotrode (poznate i kao ultrazvučna sonda, rog, vrh ili prst). Pošto se koriste pojedinačne bočice veličine uzorka, izostavljaju se dugotrajno čišćenje i gubitak uzorka zbog dekantiranja krvnih sudova. Za uniformnu sonikaciju multiwell ili mikrotiter ploča, Hielscher nudi UIP400MTP.
Za većeg obima, npr za komercijalnu proizvodnju ćelija ekstrakata, stalno ultrazvučne sisteme sa protokom ćelija reaktor su najpogodnije. Kontinuirano, pa čak i protok obrađenih materijala osigurava još sonication. Svi parametri ultrazvučnog procesa dezintegracije mogu optimizirati i prilagoditi zahtjevima aplikacije i konkretnog materijala ćeliju.
 
 
Uzorno postupak za ultrazvučno rasvjeta bakterijskih ćelija:

• Priprema suspenzije ćelije Cell peleta mora biti u potpunosti obustavljen u tampon rješenje homogenizira (odabrati svoj pufera kompatibilan sa sljedećim analize, npr specifičan način kromatografije). Dodaj Lizozom i / ili drugih aditiva, ako je to potrebno (oni moraju biti kompatibilan sa sredstvima odvajanje / pročišćavanje). Mix / homogenizuje rješenje lagano pod blagim sonication dok se ne postigne potpuno obustavljen.
• Ultrazvučni lize: Stavite uzorak u ledenu kupku. Za mobilne poremećaj, sonikacija suspenziju na 60-90 drugom rafala (koristeći režim puls vašeg ultrasonicator-a).
• (. Npr 10 min pri 10.000 x g; na 4degC): odvajanje Centrifugirajte lizat. Odvoji supernatant iz peleta ćelije pažljivo. Supernatant je ukupni ćelija lizat. Nakon filtracije supernatant, možete dobiti pojasnio fluid proteina topljivih ćelije.

 
 
Najčešći aplikacija za ultrasonicators u biologiji i biotehnologije su:

• priprema ekstrakt Cell
• Poremećaj hvasta, bakterija, biljnih ćelija, mekog ili tvrdoćelijskog tkiva, nukleičnog materijala
• ekstrakcije proteina
• Priprema i izolacija enzima
• Proizvodnju antigena
• ekstrakciju DNK i / ili ciljanim fragmentacija
• priprema liposome