Соникация за клетъчен лизис: клетъчно разрушаване и екстракция
Ултразвуковият клетъчен лизис е процедура за подготовка на проби в биотехнологични лаборатории. Целта е да се разрушат клетъчните стени или цели клетки, за да се освободят биологични молекули. Соникацията обикновено се използва за клетъчен лизис, клетъчно разрушаване и екстракция. Основното предимство на ултразвуковите апарати за клетъчен лизис се крие в прецизния контрол на параметрите на процеса, като интензивност и температура, което позволява нежно, но ефективно разрушаване и извличане на клетките.
Клетъчен лизис с помощта на ултразвук
Ултразвуковият клетъчен лизис използва високочестотни звукови вълни, за да отвори клетките и да извлече съдържанието им. Сонацията е установена и надеждна за клетъчно разрушаване и екстракция на вътреклетъчен материал, като плазмиди, рецепторни анализи, протеини, ДНК и РНК. Чрез регулиране на параметрите на процеса, ултразвуковият интензитет може да бъде фино настроен, за да отговори на специфичните изисквания на приложението, вариращи от нежно до интензивно ултразвуково озвучаване. Стъпките след лизиса включват фракциониране, изолиране на органели и извличане и пречистване на протеини. Полученият лизат трябва да бъде отделен за по-нататъшни изследвания или приложения, като например протеомни изследвания.
Ако искате да научите повече за ултразвука за лизис, клетъчно разрушаване и екстракция, моля, свържете се с нас. Нашият технически екип ще се радва да работи с вас по вашия проект за клетъчен лизис.
Предимства на използването на соникация за клетъчен лизис
В сравнение с други методи за клетъчен лизис и екстракция, ултразвуковият клетъчен лизис има няколко предимства:
- Скорост: Ултразвуковият клетъчен лизис и екстракция е бърз метод, който може да разбие клетките за секунди. Това е много по-бързо от други методи като хомогенизация, замразяване-размразяване или смилане на мъниста.
- Ефективност: Ултразвуковият клетъчен лизис и екстракция могат да се използват за третиране на малки, големи или няколко проби наведнъж, което го прави по-ефективен от други методи, които изискват индивидуална обработка на малки проби.
- Без химикали: Ултразвуковият клетъчен лизис и екстракция е неинвазивен метод, който не изисква използването на агресивни химикали или ензими. Това го прави идеален за приложения, при които трябва да се поддържа целостта на клетъчното съдържание. Нежеланото замърсяване на пробите може да бъде избегнато.
- Висок добив: Ултразвуковият клетъчен лизис и екстракция могат да извлекат висок добив на клетъчно съдържание, включително ДНК, РНК и протеини. Това е така, защото високочестотните звукови вълни разбиват клетъчните стени и освобождават съдържанието в околния разтвор.
- Контрол на температурата: Усъвършенстваните ултразвукови апарати позволяват прецизен контрол на температурата на пробата. Цифровите ултразвукови уреди Hielscher са оборудвани с щепселен температурен сензор и софтуер за наблюдение на температурата.
- Възпроизводими: Протоколите за ултразвуков клетъчен лизис могат лесно да бъдат възпроизведени и дори съпоставени с различни по-големи или по-малки обеми проби чрез просто линейно мащабиране.
- Многостранен: Ултразвуковият клетъчен лизис и екстракция могат да се използват за извличане на широк спектър от клетъчни типове, включително бактерии, дрожди, гъбички, растителни клетки и клетки на бозайници. Може да се използва и за извличане на различни видове молекули, включително протеини, ДНК, РНК и липиди.
- Едновременно приготвяне на множество проби: Hielscher Ultrasonics предлага няколко решения за удобна обработка на множество проби при абсолютно еднакви технологични условия. Това прави етапа на подготовка на пробата за лизис и екстракция много ефективна и спестяваща време.
- Лесен за използване: Ултразвуковото оборудване за лизис и екстракция на клетки е лесно за използване и изисква минимално обучение. Оборудването е икономично и като еднократна инвестиция без изискване за повторно изкупуване на отпадъци. Това го прави привлекателен за широк кръг изследователи и лаборатории.
Като цяло ултразвуковият клетъчен лизис и екстракция е бърз, ефективен, прецизно контролиран и универсален метод за извличане на клетъчно съдържание. Неговите предимства пред алтернативните методи го правят привлекателен избор за широк спектър от изследователски и промишлени приложения.
Принцип на работа на ултразвуковия клетъчен лизис
Ултразвуковият клетъчен лизис и екстракция използва високочестотни звукови вълни, за да разруши клетките и да извлече съдържанието им. Звуковите вълни създават промени в налягането в околната течност, причинявайки образуване на малки мехурчета и свиване в процес, известен като кавитация. Тези мехурчета генерират локализирани силно интензивни механични сили, които могат да разбият клетките и да освободят съдържанието им в околния разтвор.
Клетъчният лизис с помощта на ултразвук обикновено включва следните стъпки:
- Пробата се поставя в епруветка или контейнер с течен буфер.
- В пробата се вкарва ултразвукова сонда и се прилагат високочестотни звукови вълни с приблизително 20-30 kHz.
- Ултразвуковите вълни причиняват трептене и кавитация в околната течност, генерирайки локализирани сили, които разбиват клетките и освобождават съдържанието им.
- Пробата се центрофугира или филтрира, за да се отстранят всички клетъчни отломки, а извлеченото съдържание се събира за анализ надолу по веригата.
Недостатъци на обикновените методи за лизис
По време на работата си в лаборатории може вече да сте изпитали неприятностите с клетъчния лизис, използвайки традиционни протоколи за механичен или химичен лизис.
- Механичен лизис: Методите за механичен лизис, като смилане с хаванче или хомогенизиране с помощта на френска преса, мелница за мъниста или ротор-статорна система, често нямат опции за прецизен контрол и настройка. Това означава, че използването на смилане и смилане може бързо да генерира топлина и сили на срязване, които могат да повредят пробата и да денатурират протеините. Те също могат да отнемат много време и да изискват големи количества изходен материал.
- Химичен лизис: Методите за химически лизис, като лизис на базата на детергент, могат да увредят пробата чрез нарушаване на липидния двуслой и денатуриращи протеини. Те също могат да изискват множество стъпки и могат да оставят остатъчни замърсители, които пречат на приложенията надолу по веригата. Намирането на оптималната доза препарат е допълнително предизвикателство.
- Цикли на замразяване-размразяване: Циклите на замразяване-размразяване могат да причинят разкъсване на клетъчните мембрани, но повтарящите се цикли също могат да причинят денатурация и разграждане на протеини. Този метод може също да изисква множество цикли, което може да отнеме много време и често води до по-ниски добиви.
- Ензимен лизис: Методите за ензимен лизис могат да бъдат специфични за определени типове клетки и изискват множество стъпки, което ги прави отнемат много време. Те също така генерират отпадъци и изискват внимателна оптимизация, за да се избегне разграждането на пробата. Ензимните комплекти за лизис често са скъпи. Ако текущата ви процедура за ензимен лизис не дава достатъчно резултати, може да се приложи ултразвук като синергичен метод за засилване на клетъчното разрушаване.
За разлика от конвенционалните механични и химически методи за клетъчен лизис, ултразвукът е много ефективен и надежден инструмент за разпадане на клетките, който позволява пълен контрол върху параметрите на ултразвука. Това гарантира висока селективност по отношение на освобождаването на материалите и чистотата на продукта. [срв. Balasundaram et al., 2009]
Подходящ е за всички видове клетки и лесно приложим в малък и голям мащаб – винаги при контролирани условия. Ултразвуковите апарати се почистват лесно. Ултразвуковият хомогенизатор винаги разполага с функция за почистване на място (CIP) и стерилизиране на място (SIP). Сонотродът се състои от масивен титанов рог, който може да се избърсва или промива във вода или разтворител (в зависимост от работната среда). Поддръжката на ултразвуковите апарати се дължи на тяхната здравина, почти пренебрегваща.
Ултразвуков лизис и клетъчно разрушаване
Обикновено лизисът на проби в лабораторията ще отнеме между 15 секунди и 2 минути. Тъй като интензивността на ултразвука е много лесна за регулиране чрез амплитудна настройка на времето за ултразвук, както и чрез избор на подходящо оборудване, е възможно клетъчните мембрани да се разрушат много нежно или много рязко, в зависимост от клетъчната структура и от целта на лизиса (напр. екстракцията на ДНК изисква по-мека ултразвук, пълната екстракция на протеини от бактерии изисква по-интензивно ултразвуково лечение). Температурата по време на процеса може да се следи от вграден температурен сензор и може лесно да се контролира чрез охлаждане (ледена баня или проточни клетки с охлаждащи ризи) или чрез ултразвук в импулсен режим. По време на ултразвук в импулсен режим, кратките цикли на ултразвук с продължителност 1-15 секунди позволяват разсейване на топлината и охлаждане през по-дългите периоди на прекъсване.
Всички процеси, задвижвани от ултразвук, са напълно възпроизводими и линейно мащабируеми.

Флаконът за високоговорители е ултразвуков хомогенизатор за едновременно, равномерно и бързо стерилно приготвяне на множество проби.
Ултразвукови хомогенизатори за клетъчен лизис и екстракция
Различните видове ултразвукови устройства позволяват да се постигне целта за подготовка на пробата и да се гарантира удобство за потребителя и комфорт при работа. Ултразвуковите апарати тип сонда са най-често срещаните устройства в лабораторията. Те са най-подходящи за приготвяне на малки и средни проби с обеми от 0,1 мл до 1000 мл. Различните размери на мощността и сонотродите позволяват да се адаптира ултразвукът към обема на пробата и съда за най-ефективни и ефикасни резултати от ултразвука. Ултразвуковият сонден е най-добрият избор, когато трябва да се подготвят единични проби.
Ако трябва да се подготвят повече проби, например 8-10 флакона клетъчен разтвор, интензивната индиректна ултразвукова обработка с ултразвукови системи като високоговорителя или ултразвуков куперн са най-подходящият метод за хомогенизиране за ефективен лизис. Няколко флакона се ултразвукват едновременно, с една и съща интензивност. Това спестява не само време, но и гарантира еднаква обработка на всички проби, което прави резултатите сред пробите надеждни и сравними. Освен това, по време на индиректна ултразвукова реакция се избягва кръстосано замърсяване чрез потапяне на ултразвуковия сонотрод (известен също като ултразвукова сонда, клаксон, връх или пръст). Тъй като се използват флакони с индивидуален размер на пробата, отнемащото време почистване и загуба на проба поради декантиране на съдове се пропускат. За равномерна ултразвук на многоямкови или микротитровидни плочи Hielscher предлага UIP400MTP.
За по-големи обеми, например за търговско производство на клетъчни екстракти, най-подходящи са непрекъснати ултразвукови системи с реактор с поточна клетка. Непрекъснатият и равномерен поток на обработения материал осигурява равномерно ултразвук. Всички параметри на процеса на ултразвуково разпадане могат да бъдат оптимизирани и адаптирани към изискванията на приложението и специфичния клетъчен материал.
Примерна процедура за ултразвуково лизиране на бактериални клетки:
- Приготвяне на клетъчната суспензия: Клетъчните пелети трябва да бъдат напълно суспендирани в буферен разтвор чрез хомогенизиране (изберете Вашия буферен разтвор, съвместим с последващ анализ, например специфичен метод на хроматография). Добавете лизозими и/или други добавки, ако е необходимо (те също трябва да са съвместими със средствата за разделяне/пречистване). Разбъркайте/хомогенизирайте разтвора внимателно при лека ултразвук, докато се постигне пълно суспендиране.
- Ултразвуков лизис: Поставете пробата в ледена баня. За разрушаване на клетката, ултразвук на суспензията при 60-90 секунди (като използвате импулсен режим на вашия ултразвукорез.
- Разделяне: Центрофугирайте лизата (напр. 10 минути при 10 000 x g; при 4°C). Отделете внимателно супернатанта от клетъчната пелета. Супернатантът е общият клетъчен лизат. След филтриране на супернатанта се получава избистрена течност от разтворимия клетъчен протеин.
Най-често срещаните приложения на ултразвуковите апарати в биологията и биотехнологиите са:
- Приготвяне на клетъчен екстракт
- Разрушаване на дрожди, бактерии, растителни клетки, мека или твърда клетъчна тъкан, нуклеинов материал
- Извличане на протеини
- Приготвяне и изолиране на ензими
- Производство на антигени
- Извличане на ДНК и/или целенасочена фрагментация
- Приготвяне на липозоми
Таблицата по-долу ви дава общ преглед на нашите ултразвукови апарати за разрушаване и екстракция на клетките. Щракнете върху типа устройство, за да получите повече информация за всеки ултразвуков хомогенизатор. Нашият добре обучен и дългогодишен технически персонал ще се радва да ви помогне да изберете най-подходящия ултразвуков апарат за вашите проби!
Обем на партидата | Дебит | Препоръчителни устройства |
---|---|---|
до 10 флакона или епруветки | Н.А. | ФлаконВисокоговорител за високи честоти |
многоямкови / микротитърни плочи | Н.А. | UIP400MTP |
множество тръби / съдове | Н.А. | Cuphorn |
1 до 500 мл | 10 до 200 мл/мин | UP100H |
10 до 1000 мл | 20 до 200 мл/мин | UP200Ht, UP200St |
10 до 2000 мл | 20 до 400 мл/мин | UP400St |
Многобройните приложения на ултразвука се разклоняват в секторите на биотехнологиите, биоинженерството, микробиологията, молекулярната биология, биохимията, имунологията, бактериологията, вирусологията, протеомиката, генетиката, физиологията, клетъчната биология, хематологията и ботаниката.
Лизис: Разрушаване на клетъчните структури
Клетките са защитени от полупропусклива плазмена мембрана, която се състои от фосфо-липиден двуслой (също протеин-липиден бислой; образуван от хидрофобни липиди и хидрофилни фосфорни молекули с вградени протеинови молекули) и създава бариера между клетъчната вътрешност (цитоплазма) и извънклетъчната среда. Растителните клетки и прокариотните клетки са заобиколени от клетъчна стена. Поради многослойната дебела клетъчна стена на целулозата, растителните клетки са по-трудни за лизиране от животинските клетки. Вътрешността на клетката, като органели, ядро, митохондрия, се стабилизира от цитоскелета.
Чрез лизиране на клетките той е насочен към извличане и отделяне на органели, протеини, ДНК, иРНК или други биомолекули.
Конвенционални методи за клетъчен лизис и техните недостатъци
Има няколко метода за лизиране на клетки, които могат да бъдат разделени на механични и химични методи, които включват използването на почистващи препарати или разтворители, прилагане на високо налягане или използването на мелница за мъниста или френска преса. Най-проблемният недостатък на тези методи е трудният контрол и настройка на параметрите на процеса и по този начин въздействието.
Таблицата по-долу показва основните недостатъци на често срещаните методи за лизис:
Процедура на лизис
Лизисът е чувствителен процес. По време на лизиса защитата на клетъчната мембрана се разрушава, но трябва да се предотврати инактивирането, денатурацията и разграждането на извлечените протеини от нефизиологична среда (отклонение от pH-стойността). Следователно, като цяло лизисът се извършва в буферен разтвор. Повечето трудности възникват от неконтролирано разрушаване на клетките, което води до нецеленасочено освобождаване на целия вътреклетъчен материал и/или денатурация на целевия продукт.
Често задавани въпроси за соникацията и клетъчната лизиса
- Можете ли да лизирате клетки с ултразвук? Да, ултразвукът ефективно лизира клетките с помощта на високочестотни ултразвукови вълни, които индуцират кавитация, явление, при което се образуват малки мехурчета пара и се свиват силно в клетъчната суспензия. Получените механични сили нарушават клетъчните мембрани и улесняват освобождаването на вътреклетъчни компоненти в течността.
- Как да използвате соникатор за клетъчен лизис? Използването на ултразвуков звук за клетъчен лизис включва потапяне на сондата в клетъчна суспензия и регулиране на параметри като амплитуда и продължителност на импулса. Процесът трябва да се следи отблизо, за да се оптимизира клетъчното разрушаване, като същевременно се минимизира денатурацията на протеините и инактивирането на ензимите.
- Какъв е принципът на ултразвука за клетъчен лизис? Соникацията работи на принципа на акустичната кавитация. Ултразвуковата енергия се предава в течната среда, причинявайки бързи колебания на налягането, които водят до образуване и имплозия на микромехурчета. Тези имплозии генерират интензивни сили на срязване и локализирани високи температури, нарушавайки клетъчните структури и повишавайки хомогенността на лизата.
- Колко време отнема ултразвукът на клетъчния лизис? Продължителността на ултразвука за клетъчен лизис може да варира значително в зависимост от фактори като тип клетка, клетъчна плътност, мощност на ултразвука и конкретния използван протокол. Типичните процедури могат да варират от няколко секунди до няколко минути, често извършвани на цикли, за да се управлява генерирането на топлина и да се осигури равномерно разрушаване на клетките.
- Каква е целта на ултразвука при извличане на протеини? При извличането на протеини ултразвукът служи за ефективно разкъсване на клетъчните мембрани и разтваряне на протеини. Този метод е особено полезен за освобождаване на протеини от клетъчните отделения, което го прави от съществено значение за приготвянето на лизати, от които протеините трябва да бъдат пречистени или анализирани.
- Защо се използва ултразвук за екстракция? Соникацията е предпочитана за екстракция поради бързото си действие и способността да прилага целенасочена енергия, разграждайки клетъчните структури за освобождаване на биоактивни молекули без използване на сурови химически обработки, като по този начин запазва функционалната цялост на извлечените съединения.
- Ултразвукът нарушава ли протеин-протеиновите взаимодействия? Докато ултразвукът може ефективно да наруши клетъчните мембрани, той може също така да наруши протеин-протеиновите взаимодействия. Нивото на прекъсване зависи от интензивността на ултразвука и продължителността на експозицията, което потенциално води до денатурация или дисоциация на протеиновите комплекси, което може да повлияе на последващи аналитични или функционални изследвания.
- Може ли ултразвукът да се използва за лизиране на E. coli? Ултразвуковите апарати на Hielscher са особено ефективни за лизиране на бактериални клетки като E. coli, които имат здрави клетъчни стени. Техниката осигурява физически метод за срязване на клетъчната стена и мембраната, което я прави предпочитан метод за приготвяне на бактериални лизати в лабораториите по молекулярна биология и биохимия.
Литература/Препратки
- Balasundaram, B.; Harrison, S.; Bracewell, D. G. (2009): Advances in product release strategies and impact on bioprocess design. Trends in Biotechnology 27/8, 2009. pp. 477-485.
- Vilkhu, K.; Manasseh, R.; Mawson, R.; Ashokkumar, M. (2011): Ultrasonic Recovery and Modification of Food ingredients. In: Feng/ Barbosa-Cánovas/ Weiss (2011): Ultrasound Technologies for Food and Bioprocessing. New York: Springer, 2011. pp. 345-368.
- Nico Böhmer, Andreas Dautel, Thomas Eisele, Lutz Fischer (2012): Recombinant expression, purification and characterisation of the native glutamate racemase from Lactobacillus plantarum NC8. Protein Expr Purif. 2013 Mar;88(1):54-60.
- Brandy Verhalen, Stefan Ernst, Michael Börsch, Stephan Wilkens (2012): Dynamic Ligand-induced Conformational Rearrangements in P-glycoprotein as Probed by Fluorescence Resonance Energy Transfer Spectroscopy. J Biol Chem. 2012 Jan 6;287(2): 1112-27.
- Claudia Lindemann, Nataliya Lupilova, Alexandra Müller, Bettina Warscheid, Helmut E. Meyer, Katja Kuhlmann, Martin Eisenacher, Lars I. Leichert (2013): Redox Proteomics Uncovers Peroxynitrite-Sensitive Proteins that Help Escherichia coli to Overcome Nitrosative Stress. J Biol Chem. 2013 Jul 5; 288(27): 19698–19714.
- Elahe Motevaseli, Mahdieh Shirzad, Seyed Mohammad Akrami, Azam-Sadat Mousavi, Akbar Mirsalehian, Mohammad Hossein Modarressi (2013): Normal and tumour cervical cells respond differently to vaginal lactobacilli, independent of pH and lactate. ed Microbiol. 2013 Jul; 62(Pt 7):1065-1072.