Ултразвукова обработка за клетъчен лизис: разрушаване на клетките и екстракция
Ултразвуковият клетъчен лизис е широко прилаган метод за подготовка на проби в съвременните биотехнологични лаборатории. Основната му цел е да разруши клетъчните мембрани или целите клетки, за да освободи вътреклетъчни компоненти като протеини, нуклеинови киселини или органели. В ежедневната лабораторна работа това означава, че ултразвуковата обработка е стандартен метод за контролирано разрушаване на клетките и ефективна екстракция на биомолекули. Основното предимство на ултразвуковите апарати се състои в способността им да регулират прецизно критичните параметри на процеса, включително интензивността на ултразвука, пулсацията и контрола на температурата. Този контрол позволява на изследователите да постигнат надежден лизис, като същевременно сведат до минимум термичното или механичното увреждане на чувствителните биомолекули, което води до щадящ, но високоефективен процес на екстракция.
Клетъчен лизис с ултразвукови апарати
Ултразвуковият клетъчен лизис използва акустична кавитация за разрушаване на клетъчните мембрани и освобождаване на вътреклетъчни молекули. Hielscher Ultrasonics предлага както класическия ултразвуков апарат със сонда, така и ултразвукови апарати за множество проби за стерилна обработка: VialTweeter за множество епруветки и флакони и ултразвуковия апарат за плаки с 96 ямки UIP400MTP за стандартни микроплаки.
Hielscher Ultrasonics доставя мощни безконтактни ултразвукови апарати за подготовка на проби и клинични анализи. Ултразвуковият апарат за плаки с множество ямки UIP400MTP, VialTweeter, CupHorn и проточният ултразвуков апарат GDmini2 обработват пробите при стерилни условия.
Ултразвукови хомогенизатори UP100H (100 вата) и UP400St (400 вата): ултразвукова обработка за клетъчен лизис и екстракция.
Ултразвукови хомогенизатори за клетъчен лизис и екстракция
| Тип ултразвуково устройство | Основно приложение | Обем на пробата | Типична употреба | Предимства | Примерни модели |
|---|---|---|---|---|---|
| Ултразвукови апарати със сонда | Ултразвукова обработка на единични проби | От 0,1 mL до ~1000 mL | Клетъчен лизис, екстракция на протеини, фрагментация на ДНК/РНК | Прецизен контрол на енергията; различни сонотроди; оптимални за малки до средни проби | UP100H, UP200St, UP400St |
| VialTweeter / CupHorn | Паралелна обработка на множество запечатани флакони | 8–10 флакона (~1–20 mL всеки) | Стандартизиран лизис на множество клетъчни суспензии | Равномерна ултразвукова обработка; избягва кръстосаното замърсяване; възпроизводими резултати | VialTweeter, CupHorn |
| Ултразвуков апарат за плаки с 96 ямки | Ултразвукова обработка на плаки с множество ямки и микротитърни плаки | Формат на микроплака | Скрининг с висок капацитет за обработка на проби, протеомика, клетъчни анализи | Едновременна, равномерна ултразвукова обработка във всички ямки; идеален за работни процеси с множество проби | UIP400MTP |
| Реактори с проточни клетки | Непрекъсната ултразвукова обработка на по-големи обеми | >1 L, с възможност за мащабиране | Разрушаване на клетките в промишлен мащаб, производство на екстракти | Непрекъсната обработка; възможност за мащабиране; пълен контрол на процеса (амплитуда, налягане, температура) | UIP1000hdT, UIP2000hdT + проточна клетка |
| Системи за стерилна / индиректна ултразвукова обработка | Обработка на проби без замърсяване | Зависи от флакона/епруветката/микроплаката | Чувствителни проби, стерилни среди, условия с регулаторни изисквания | Без контакт със сондата; избягва пренасянето на остатъци между пробите; минимални усилия за почистване | VialTweeter, CupHorn, UIP400MTP |
Предимства на ултразвуковата обработка за клетъчен лизис
В сравнение с други методи за клетъчен лизис и екстракция, ултразвуковият клетъчен лизис има няколко предимства:
- Бързина: Ултразвуковият клетъчен лизис и екстракция са бърз метод, който може да разруши клетките за броени секунди. Това е много по-бързо от други методи като хомогенизация, замразяване и размразяване или смилане в мелница с микросфери.
- Ефективност: Ултразвуковият клетъчен лизис и екстракция могат да се използват за обработка на малки, големи или множество проби едновременно, което ги прави по-ефективни от други методи, изискващи индивидуална обработка на малки проби.
- Без химикали: Ултразвуковият клетъчен лизис и екстракция са неинвазивен метод, който не изисква използването на агресивни химикали или ензими. Това го прави идеален за приложения, при които трябва да се запази целостта на клетъчното съдържание. Нежеланото замърсяване на пробите може да се избегне.
- Висок добив: Ултразвуковият клетъчен лизис и екстракция могат да осигурят висок добив на клетъчно съдържание, включително ДНК, РНК и протеини. Това се дължи на факта, че високочестотните звукови вълни разрушават клетъчните стени и освобождават съдържанието в околния разтвор.
- Контрол на температурата: Усъвършенстваните ултразвукови апарати позволяват прецизен контрол на температурата на пробата. Цифровите ултразвукови апарати на Hielscher са оборудвани с включваем температурен сензор и софтуер за наблюдение на температурата.
- Възпроизводимост: Протоколите за ултразвуков клетъчен лизис могат лесно да бъдат възпроизведени и дори адаптирани към различни по-големи или по-малки обеми на пробите чрез просто линейно увеличаване на мащаба.
- Универсалност: Ултразвуковият клетъчен лизис и екстракция могат да се използват за екстракция на широк спектър от клетъчни типове, включително бактерии, дрожди, гъби, растителни клетки и клетки на бозайници. Методът може да се използва и за екстракция на различни видове молекули, включително протеини, ДНК, РНК и липиди.
- Едновременна подготовка на многобройни проби: Hielscher Ultrasonics предлага няколко решения за удобна обработка на многобройни проби при точно едни и същи условия на процеса. Това прави етапа на подготовка на пробите чрез лизис и екстракция високоефективен и спестяващ време.
- Лесна употреба: Оборудването за ултразвуков клетъчен лизис и екстракция е лесно за употреба и изисква минимално обучение. Оборудването е и икономично, тъй като представлява еднократна инвестиция без необходимост от повторно закупуване на консумативи за еднократна употреба. Това го прави привлекателно за широк кръг изследователи и лаборатории.
Като цяло ултразвуковият клетъчен лизис и екстракция са бърз, ефективен, прецизно контролируем и универсален метод за извличане на клетъчно съдържание. Предимствата му пред алтернативните методи го правят привлекателен избор за широк спектър от изследователски и промишлени приложения.
Принцип на действие на ултразвуковия клетъчен лизис
Ултразвуковият клетъчен лизис и екстракция използват високочестотни звукови вълни за разрушаване на клетките и извличане на съдържанието им. Звуковите вълни предизвикват промени в налягането в околната течност, което води до образуване и колапс на малки мехурчета в процес, известен като кавитация. Тези мехурчета генерират локализирани механични сили с много висока интензивност, които могат да разрушат клетките и да освободят съдържанието им в околния разтвор.
Клетъчният лизис с ултразвуков апарат обикновено включва следните стъпки:
- Пробата се поставя в епруветка или съд с течен буферен разтвор.
- В пробата се потапя ултразвукова сонда и се прилагат високочестотни звукови вълни с приблизително 20–30 kHz.
- Ултразвуковите вълни предизвикват осцилации и кавитация в околната течност, генерирайки локализирани сили, които разрушават клетките и освобождават съдържанието им.
- Пробата се центрофугира или филтрира, за да се отстранят всички клетъчни остатъци, а извлеченото съдържание се събира за последващ анализ.
Недостатъци на обичайните методи за лизис
По време на работата си в лаборатории може вече да сте се сблъсквали с трудностите при клетъчния лизис с традиционни протоколи за механичен или химичен лизис.
- Механичен лизис: Методите за механичен лизис, като стриване с хаван и пестик или хомогенизация с френска преса, мелница с микросфери или роторно-статорна система, често не предлагат възможности за прецизен контрол и регулиране. Това означава, че смилането и стриването могат бързо да генерират топлина и сили на срязване, които могат да увредят пробата и да денатурират протеините. Те могат също да отнемат много време и да изискват големи количества изходен материал.
- Химичен лизис: Методите за химичен лизис, като лизис с детергенти, могат да увредят пробата чрез разрушаване на липидния бислой и денатуриране на протеините. Те могат също да изискват множество стъпки и е възможно да оставят остатъчни замърсители, които пречат на последващите приложения. Определянето на оптималната доза детергент е допълнително предизвикателство.
- Цикли на замразяване и размразяване: Циклите на замразяване и размразяване могат да предизвикат разкъсване на клетъчните мембрани, но повтарящите се цикли могат също да причинят денатурация и разграждане на протеините. Този метод може да изисква и множество цикли, което може да отнеме много време и често води до по-ниски добиви.
- Ензимен лизис: Методите за ензимен лизис могат да бъдат специфични за определени клетъчни типове и да изискват множество стъпки, което ги прави времеемки. Те също така генерират отпадъци и изискват внимателна оптимизация, за да се избегне разграждане на пробата. Комплектите за ензимен лизис често са скъпи. Ако настоящата ви процедура за ензимен лизис дава недостатъчни резултати, ултразвуковата обработка може да се приложи като синергичен метод за усилване на разрушаването на клетките.
За разлика от конвенционалните механични и химични методи за клетъчен лизис, ултразвуковата обработка е много ефективен и надежден инструмент за разрушаване на клетките, който позволява пълен контрол върху параметрите на ултразвуковата обработка. Това осигурява висока селективност при освобождаването на материалите и висока чистота на продукта. [срв. Balasundaram et al., 2009]
Тя е подходяща за всички клетъчни типове и лесно приложима в малък и голям мащаб – винаги при контролирани условия. Ултразвуковите апарати се почистват лесно. Ултразвуковият хомогенизатор винаги разполага с функции за почистване на място (CIP) и стерилизация на място (SIP). Сонотродът представлява масивен титанов рог, който може да се избърсва или промива с вода или разтворител (в зависимост от работната среда). Благодарение на здравината им поддръжката на ултразвуковите апарати е почти незначителна.
Ултразвуков лизис и разрушаване на клетките
Обикновено лизисът на проби в лабораторията отнема между 15 секунди и 2 минути. Тъй като интензивността на ултразвуковата обработка се регулира много лесно чрез настройване на амплитудата и времето за ултразвукова обработка, както и чрез избор на подходящо оборудване, е възможно клетъчните мембрани да бъдат разрушени много щадящо или много рязко в зависимост от клетъчната структура и целта на лизиса (например екстракцията на ДНК изисква по-щадяща ултразвукова обработка, а пълната екстракция на протеини от бактерии изисква по-интензивна ултразвукова обработка). Температурата по време на процеса може да се следи чрез вграден температурен сензор и лесно да се контролира чрез охлаждане (ледена баня или проточни клетки с охлаждащи ризи) или чрез ултразвукова обработка в импулсен режим. При ултразвукова обработка в импулсен режим кратките цикли на ултразвукови импулси с продължителност 1–15 секунди позволяват отвеждане на топлината и охлаждане през по-дългите паузи между тях.
Всички процеси, задвижвани от ултразвук, са напълно възпроизводими и могат да се мащабират линейно.
VialTweeter е ултразвуков хомогенизатор за едновременна, равномерна и бърза стерилна подготовка на многобройни проби.
- Подготовка на клетъчната суспензия: Клетъчните пелети трябва да бъдат напълно суспендирани в буферен разтвор чрез хомогенизиране (изберете буферен разтвор, съвместим с последващия анализ, например с конкретен хроматографски метод). Добавете лизозими и/ или други добавки, ако е необходимо (те също трябва да бъдат съвместими със средствата за разделяне/ пречистване). Смесвайте/ хомогенизирайте разтвора внимателно при щадяща ултразвукова обработка до пълно суспендиране.
Прочетете повече за синергиите при комбиниране на лизозими с ултразвукова обработка! - Ултразвуков лизис: Поставете пробата в ледена баня. За разрушаване на клетките обработвайте суспензията с ултразвукови импулси с продължителност 60–90 секунди (използвайки импулсния режим на вашия ултразвуков апарат).
- Разделяне: Центрофугирайте лизата (например 10 мин. при 10 000 x g; при 4degC). Внимателно отделете супернатанта от клетъчния пелет. Супернатантът представлява общия клетъчен лизат. След филтриране на супернатанта получавате избистрена течност, съдържаща разтворимия клетъчен протеин.
Най-честите приложения на ултразвуковите апарати в биологията и биотехнологиите са:
- Приготвяне на клетъчни екстракти
- Разрушаване на дрожди, бактерии, растителни клетки, мека или твърда клетъчна тъкан, нуклеинов материал
- Екстракция на протеини
- Приготвяне и изолиране на ензими
- Производство на антигени
- Екстракция на ДНК и/ или целенасочена фрагментация
- Приготвяне на липозоми
Разрушаването на клетките с ултразвуков апарат със сонда е ефективен метод за подготовка на проби.
Многообразните приложения на ултразвука обхващат областите на биотехнологиите, биоинженерството, микробиологията, молекулярната биология, биохимията, имунологията, бактериологията, вирусологията, протеомиката, генетиката, физиологията, клетъчната биология, хематологията и ботаниката.
Лизис: разрушаване на клетъчните структури
Клетките са защитени от полупропусклива плазмена мембрана, която се състои от фосфолипиден бислой (също протеин-липиден бислой; образуван от хидрофобни липиди и хидрофилни фосфорни молекули с вградени протеинови молекули) и създава бариера между вътрешността на клетката (цитоплазмата) и извънклетъчната среда. Растителните и прокариотните клетки са заобиколени от клетъчна стена. Поради дебелата многослойна клетъчна стена от целулоза растителните клетки се лизират по-трудно от животинските. Вътрешните клетъчни структури, като органелите, ядрото и митохондрията, се стабилизират от цитоскелета.
Лизисът на клетките има за цел извличане и разделяне на органелите, протеините, ДНК, иРНК или други биомолекули.
Конвенционални методи за клетъчен лизис и техните недостатъци
Има няколко метода за лизиране на клетки, които могат да се разделят на механични и химични методи и включват използване на детергенти или разтворители, прилагане на високо налягане или използване на мелница с микросфери или френска преса. Най-проблемният недостатък на тези методи е трудният контрол и регулиране на параметрите на процеса и съответно на въздействието.
Таблицата по-долу показва основните недостатъци на обичайните методи за лизис:
Таблица: Конвенционалните методи за клетъчен лизис имат съществени недостатъци
Процедура за лизис
Лизисът е чувствителен процес. По време на лизиса защитата, осигурявана от клетъчната мембрана, се разрушава, но трябва да се предотвратят инактивирането, денатурацията и разграждането на извлечените протеини вследствие на нефизиологична среда (отклонение от стойността на pH). Поради това лизисът обикновено се извършва в буферен разтвор. Повечето трудности възникват от неконтролирано разрушаване на клетките, което води до нецеленасочено освобождаване на целия вътреклетъчен материал или/ и до денатурация на целевия продукт.
Често задавани въпроси за ултразвуковата обработка и клетъчния лизис
- Могат ли клетките да се лизират чрез ултразвукова обработка? Да, ултразвуковата обработка ефективно лизира клетките чрез високочестотни ултразвукови вълни, които предизвикват кавитация – явление, при което малки мехурчета от пари се образуват и колабират бурно в клетъчната суспензия. Получените механични сили разрушават клетъчните мембрани и улесняват освобождаването на вътреклетъчните компоненти в течността.
- Как се използва ултразвуков апарат за клетъчен лизис? Използването на ултразвуков апарат за клетъчен лизис включва потапяне на сондата на апарата в клетъчна суспензия и регулиране на параметри като амплитуда и продължителност на импулсите. Процесът трябва да се наблюдава внимателно, за да се оптимизира разрушаването на клетките, като същевременно се сведат до минимум денатурацията на протеините и инактивирането на ензимите.
- Какъв е принципът на ултразвуковата обработка за клетъчен лизис? Ултразвуковата обработка действа на принципа на акустичната кавитация. Ултразвуковата енергия се предава в течната среда, предизвиквайки бързи колебания на налягането, които водят до образуване и имплозия на микромехурчета. Тези имплозии генерират интензивни сили на срязване и локализирани високи температури, които разрушават клетъчните структури и подобряват хомогенността на лизата.
- Колко време отнема ултразвуковата обработка за клетъчен лизис? Продължителността на ултразвуковата обработка за клетъчен лизис може да варира значително в зависимост от фактори като клетъчен тип, клетъчна плътност, мощност на ултразвуковия апарат и използвания конкретен протокол. Типичните процедури могат да продължат от няколко секунди до няколко минути и често се изпълняват на цикли, за да се контролира генерирането на топлина и да се осигури равномерно разрушаване на клетките.
- Каква е целта на ултразвуковата обработка при екстракция на протеини? При екстракция на протеини ултразвуковата обработка служи за ефективно разкъсване на клетъчните мембрани и солюбилизиране на протеините. Този метод е особено полезен за освобождаване на протеини от вътрешността на клетъчните компартменти, което го прави съществен за приготвяне на лизати, от които протеините ще бъдат пречиствани или анализирани.
- Защо се използва ултразвукова обработка за екстракция? Ултразвуковата обработка е предпочитана за екстракция поради бързото си действие и способността си да прилага целенасочено енергия, като разрушава клетъчните структури, за да освободи биоактивни молекули без използване на агресивни химични обработки, и по този начин запазва функционалната цялост на извлечените съединения.
- Нарушава ли ултразвуковата обработка протеин-протеиновите взаимодействия? Въпреки че ултразвуковата обработка може ефективно да разрушава клетъчните мембрани, тя може също да нарушава протеин-протеиновите взаимодействия. Степента на нарушаване зависи от интензивността на ултразвуковата обработка и продължителността на експозицията, като потенциално води до денатурация или дисоциация на протеиновите комплекси, което би могло да повлияе на последващи аналитични или функционални изследвания.
- Може ли ултразвуковата обработка да се използва за лизис на E. coli? Ултразвуковите апарати на Hielscher са особено ефективни за лизиране на бактериални клетки като E. coli, които имат здрави клетъчни стени. Техниката осигурява физичен метод за срязване на клетъчната стена и мембраната, което я прави предпочитан метод за приготвяне на бактериални лизати в лабораториите по молекулярна биология и биохимия.
- Какви процеси следват след етапа на ултразвукова обработка?
Последващите стъпки след ултразвуков лизис обикновено включват фракциониране на лизата, целенасочено изолиране на органели и допълнителна екстракция или пречистване на протеини.
След това обработеният лизат се разделя и подготвя за аналитични или функционални приложения, като протеомика с висока разделителна способност, транскриптомика или изследвания на свързването с рецептори.
Литература/Източници
- Balasundaram, B.; Harrison, S.; Bracewell, D. G. (2009): Advances in product release strategies and impact on bioprocess design. Trends in Biotechnology 27/8, 2009. pp. 477-485.
- Vilkhu, K.; Manasseh, R.; Mawson, R.; Ashokkumar, M. (2011): Ultrasonic Recovery and Modification of Food ingredients. In: Feng/ Barbosa-Cánovas/ Weiss (2011): Ultrasound Technologies for Food and Bioprocessing. New York: Springer, 2011. pp. 345-368.
- Nico Böhmer, Andreas Dautel, Thomas Eisele, Lutz Fischer (2012): Recombinant expression, purification and characterisation of the native glutamate racemase from Lactobacillus plantarum NC8. Protein Expr Purif. 2013 Mar;88(1):54-60.
- Brandy Verhalen, Stefan Ernst, Michael Börsch, Stephan Wilkens (2012): Dynamic Ligand-induced Conformational Rearrangements in P-glycoprotein as Probed by Fluorescence Resonance Energy Transfer Spectroscopy. J Biol Chem. 2012 Jan 6;287(2): 1112-27.
- Claudia Lindemann, Nataliya Lupilova, Alexandra Müller, Bettina Warscheid, Helmut E. Meyer, Katja Kuhlmann, Martin Eisenacher, Lars I. Leichert (2013): Redox Proteomics Uncovers Peroxynitrite-Sensitive Proteins that Help Escherichia coli to Overcome Nitrosative Stress. J Biol Chem. 2013 Jul 5; 288(27): 19698–19714.
- Elahe Motevaseli, Mahdieh Shirzad, Seyed Mohammad Akrami, Azam-Sadat Mousavi, Akbar Mirsalehian, Mohammad Hossein Modarressi (2013): Normal and tumour cervical cells respond differently to vaginal lactobacilli, independent of pH and lactate. ed Microbiol. 2013 Jul; 62(Pt 7):1065-1072.