Клетъчното разпадане или лизис е често срещана част от ежедневната подготовка на пробите в биотехнологичните лаборатории. Целта на лизиса е да се разрушат части от клетъчната стена или цялата клетка, за да се освободят биологични молекули. Ултразвуковите хомогенизатори се използват широко за успешен клетъчен лизис. Основното предимство на сложните ultrasonicators е прецизният контрол върху параметрите на процеса като интензивност и температура, което позволява нежно, но високоефективно разрушаване и извличане на клетките.

Клетъчен лизис с помощта на ултразвук

Ултразвукова клетка лизис и екстракция е метод, използван за прекъсване на отворени клетки и извличане на съдържанието с помощта на високочестотни звукови вълни, т.е. ултразвук. Соникацията е техника на лизис, която се използва широко като утвърдени и надеждни методи за разрушаване на клетките и извличане на вътреклетъчен материал. Ултразвуков лизис е надеждна техника за приготвяне на лизат, съдържащ например плазмид, рецепторни анализи, протеини, ДНК, РНК и др. Тъй като ултразвуковата интензивност може да бъде изравнена чрез регулиране на параметрите на процеса, оптималната интензивност на ултразвук от много мека до интензивна може да бъде зададена индивидуално за всяко вещество и среда, за да отговаря на специфичните изисквания за приложение. Следващите стъпки на лизиса са фракциониране, изолиране на органели и/или екстракция и пречистване на протеини. Извлеченият материал (= лизат) трябва да бъде отделен и подлежи на допълнителни изследвания или приложения, например за протеомни изследвания.

В сравнение с други методи за клетъчен лизис и екстракция, ултразвуковият клетъчен лизис има няколко предимства:

1. Скорост: Ултразвукова клетка лизис и екстракция е бърз метод, който може да се прекъсне отворени клетки в рамките на няколко секунди. Това е много по-бързо от други методи като хомогенизиране, замразяване-размразяване или смилане на топчета.
2. Ефективност: Ултразвукова клетка лизис и екстракция може да се използва за лечение на малки, големи или няколко проби наведнъж, което го прави по-ефективен от други методи, които изискват индивидуална обработка на малки проби.
3. Без химикали: Ултразвуков клетъчен лизис и екстракция е неинвазивен метод, който не изисква използването на разяждащи химикали или ензими. Това го прави идеален за приложения, където целостта на съдържанието на клетката трябва да се поддържа. Нежеланото замърсяване на пробите може да бъде избегнато.
4. Висок добив: Ултразвуковият клетъчен лизис и екстракция може да извлече висок добив на клетъчно съдържание, включително ДНК, РНК и протеини. Това е така, защото високочестотните звукови вълни отварят клетъчните стени и освобождават съдържанието в околния разтвор.
5. Контрол на температурата: Сложните ултрасонциатори позволяват прецизен контрол на температурата на пробата. Hielscher цифрови соникатори са оборудвани с pluggable температурен сензор и софтуер за мониторинг на температурата.
6. Възпроизводими: Протоколите за ултразвуков клетъчен лизис могат лесно да бъдат възпроизведени и дори съчетани с различни по-големи или по-малки обеми на пробата чрез просто линейно мащабиране.
7. Многостранен: Ултразвукова клетка лизис и екстракция може да се използва за извличане на широк спектър от клетъчни типове, включително бактерии, дрожди, гъбички, растителни и бозайници клетки. Може да се използва и за извличане на различни видове молекули, включително протеини, ДНК, РНК и липиди.
8. Едновременна подготовка на множество проби: Hielscher Ultrasonics предлага няколко решения за удобна обработка на множество проби при точно същите условия на процеса. Това прави стъпката за подготовка на пробата на лизис и екстракция високоефективна и спестяваща време.
9. Лесен за използване: Ултразвукова клетка лизис и екстракция оборудване е лесен за използване и изисква минимално обучение. Оборудването също е икономично, тъй като е единична инвестиция без изискване за повторно закупуване на изхвърляния. Това го прави привлекателен за широк кръг изследователи и лаборатории.

Като цяло, ултразвуков клетъчен лизис и екстракция е бърз, ефективен, прецизно контролируем и гъвкав метод за извличане на клетъчно съдържание. Неговите предимства пред алтернативните методи го правят привлекателен избор за широк спектър от изследователски и индустриални приложения.

Принцип на работа на ултразвукова клетка лизис

Ултразвуковият клетъчен лизис и екстракция използва високочестотни звукови вълни, за да разруши клетките и да извлече съдържанието им. Звуковите вълни създават промени в налягането в заобикалящата течност, което води до образуване и свиване на малки мехурчета в процес, известен като кавитация. Тези мехурчета генерират локализирани силно интензивни механични сили, които могат да разрушат отворените клетки и да освободят съдържанието им в околния разтвор.

Клетъчен лизис с помощта на ultrasonicator обикновено включва следните стъпки:

• Пробата се поставя в епруветка или контейнер с течен буфер.
• В пробата се вкарва ултразвукова сонда и се прилагат високочестотни звукови вълни с прибл. 20-30 kHz.
• Ултразвуковите вълни причиняват трептене и кавитация в заобикалящата течност, генерирайки локализирани сили, които разрушават отворените клетки и освобождават съдържанието им.
• Пробата се центрофугира или филтрира, за да се отстранят клетъчните остатъци, а извлеченото съдържание се събира за анализ надолу по веригата.

Мощните ултразвукови вълни нарушават клетъчната матрица на биологичните структури и освобождават биоактивните съединения. Масовият трансфер между растителния материал и разтворителя (напр. буфер) се засилва. (графика: ©Vilkhu et al., 2006)

Недостатъци на общите методи за лизис

По време на работата си в лаборатории може би вече сте изпитали неудобството на клетъчния лизис, използвайки традиционни протоколи за механичен или химичен лизис.

• Механичен лизис: Механичните методи за лизис, като смилане с хоросан и чукало или хомогенизиране с помощта на френска преса, мелница за мъниста или роторно-статорна система, често нямат опции за контрол и настройка. Това означава, че използването на фрезоване и смилане може бързо да генерира топлина и сили на срязване, които могат да повредят пробата и денатурираните протеини. Те също могат да отнемат време и да изискват големи количества изходен материал.
• Химичен лизис: Химичните методи за лизис, като лизис на базата на детергенти, могат да увредят пробата чрез разрушаване на липидния двуслоен и денатуриращи протеини. Те също така могат да изискват множество стъпки и могат да оставят остатъчни замърсители, които пречат на приложенията надолу по веригата. Намирането на оптималната доза препарат е допълнително предизвикателство.
• Цикли на замразяване и размразяване: Циклите на замразяване и размразяване могат да причинят разкъсване на клетъчните мембрани, но повтарящите се цикли също могат да причинят денатуриране и разграждане на протеините. Този метод може да изисква и множество цикли, което може да отнеме много време и често води до по-ниски добиви.
• Ензимен лизис: Ензимните методи за лизис могат да бъдат специфични за определени типове клетки и изискват множество стъпки, което ги прави отнемащи време. Те също така генерират отпадъци и изискват внимателна оптимизация, за да се избегне разграждането на пробата. Комплектите за ензимен лизис често са скъпи. Ако текущата ви ензимна лизис процедура дава недостатъчни резултати, ултразвук като синергичен метод може да се прилага за засилване на клетъчното разрушаване.

За разлика от конвенционалните механични и химични методи за клетъчен лизис, ултразвук е много ефективен и надежден инструмент за разпадане на клетките, който позволява пълен контрол върху параметрите на ултразвук. Това гарантира висока селективност по отношение на освобождаването на материалите и чистотата на продукта. [срв. Balasundaram et al., 2009]
Подходящ е за всички типове клетки и е лесно приложим в малък и голям мащаб. – Винаги при контролирани условия. Ultrasonicators са лесни за почистване. Ултразвуковият хомогенизатор винаги разполага с функция за почистване на място (CIP) и стерилизиране на място (SIP). Издатината се състои от масивен титанов рог, който може да се избърсва или промива във вода или разтворител (в зависимост от работната среда). Поддържането на ultrasonicators се дължи на тяхната здравина почти пренебрегвани.

Ултразвуков лизис и разрушаване на клетките

Обикновено, лизирането на пробите в лабораторията ще отнеме между 15 секунди и 2 минути. Тъй като интензивността на ултразвуковото обработване е много лесно да се настрои чрез амплитуда, настройвайки времето за ултразвук, както и чрез избора на подходящо оборудване, възможно е да се разрушат клетъчните мембрани много внимателно или много рязко, в зависимост от клетъчната структура и от целта на лизис напр. ДНК екстракцията изисква по-мека ултразвукова обработка, пълната протеинова екстракция на бактериите изисква по-интензивно ултразвуково третиране). Температурата по време на процеса може да се контролира чрез вграден температурен датчик и може лесно да се контролира чрез охлаждане (ледена баня или поточни клетки с охлаждащи якета) или чрез ултразвук в импулсен режим. При ултразвуково импулсно озвучаване кратки цикли на разрушаване с ултразвук с продължителност 1-15 секунди позволяват разсейване на топлината и охлаждане по време на по-дълги периоди на прекъсване.
Всички процеси ехографски задвижване са напълно възпроизводими и линейно мащабируеми.

Ултразвукови хомогенизатори за клетъчен лизис и екстракция

Различни видове ултразвукови устройства позволяват съвпадение на целта за подготовка на пробата и да се осигури удобство за потребителя и комфорт на работа. Сонда тип ultrasonicators са най-често срещаните устройства в лабораторията. Те са най-подходящи за приготвяне на малки и средни проби с обеми от 0,1 мл до 1000 мл. Различни размери на мощността и синсинсинди позволяват да се адаптира ultrasonicator към обема на пробата и съда за най-ефективни и ефикасни резултати ултразвук. Устройството за ултразвукова сонда е най-добрият избор, когато трябва да се подготвят единични проби.

Ако трябва да се приготвят повече проби, например 8-10 флакона клетъчен разтвор, интензивна индиректна обработка с ултразвук с ултразвукови системи като VialTweeter или ултразвуков cuphorn са най-подходящият метод за хомогенизиране за ефективен лизис. Няколко флакона се обработват с ултразвук по едно и също време, с еднаква интензивност. Това спестява не само време, но и осигурява еднакво третиране на всички проби, което прави резултатите сред пробите надеждни и сравними. Освен това, по време на непряка ултразвук кръстосано замърсяване чрез потапяне на ултразвукова издатина (известен също като ултразвукова сонда, рог, връх, или пръст) се избягва. Тъй като се използват индивидуално според размера на пробата флакони, отнема много време почистването и загубата на проби поради преливане на съдовете се пропускат. За равномерно ултразвук на multiwell или микротитър плочи, Hielscher предлага UIP400MTP.
За по-големи обеми, например за търговско производство на клетъчни екстракти, постоянно ултразвукови системи с реактор поток клетки са най-подходящи. Непрекъснатото и дори потока на обработвания материал осигурява още по ултразвук. Всички параметри на процеса на ултразвукова дезинтеграция могат да бъдат оптимизирани и адаптирани към изискванията на приложението и специфичен клетъчен материал.
 
 
Примерната процедура за ултразвукова лизиране на бактериални клетки:

• Получаване на клетъчната суспензия: Клетъчни пелети трябва да бъде напълно суспендират в буферен разтвор от хомогенизиране (изберете буферен разтвор, съвместим със следните анализи, например специфичен метод хроматография). Добави лизозими и / или други добавки, ако е необходимо (те трябва да бъде съвместим с отделяне / пречистване средства). Разбърква / хомогенизира разтворът внимателно при леко ултразвук докато се постигне пълна суспензия.
• Ултразвуков лиза: Поставя се пробата в ледена баня. За разрушаване на клетката, се озвучава спирането на 60-90 секунди тласъци (с помощта на импулсен режим ви ултрасоникатор му).
• (. Например 10 минути при 10 000 х г, при 4degC): Разделяне Центрофугира лизат. Отделете повърхностния слой от клетъчна пелета внимателно. Супернатантът е общия клетъчен лизат. След филтруване на супернатантата, можете получи изяснени течност на разтворим клетъчен протеин.

 
Най-често срещаните заявленията за ultrasonicators в биологията и биотехнологиите, са:

• подготовка клетъчен екстракт
• Нарушаване на дрожди, бактерии, растителни клетки, мека или твърда клетъчна тъкан, нуклеинов материал
• екстракция на протеин
• Получаване и изолиране на ензими
• Производство на антигени
• ДНК екстракция и / или насочени фрагментация
• подготовка на липозоми