Hielscher ултразвукова технология

Соникация Лизис: разрушаване на клетките & екстракция

Клетъчната дезинтеграция или лизиране е често срещана част от ежедневната подготовка на проби в биотехнологични лаборатории. Целта на лизирането е да разрушат части от клетъчната стена или пълната клетка, за да се освободят биологични молекули. Така нареченият лизат може да се състои например в плазмидни, рецепторни тестове, протеини, ДНК, РНК и др. Следващите етапи на лизирането са фракциониране, изолиране на органели и / или протеинова екстракция и пречистване. Екстрахираният материал (= лизат) трябва да бъде отделен и подлежи на допълнителни изследвания или приложения, напр. За протеомични изследвания. Ултразвуковите хомогенизатори са често срещано средство за успешен клетъчен лизис. Тъй като ултразвуковият интензитет може да бъде изравнен чрез регулиране на параметрите на процеса, оптималният интензитет на ултразвука от много мек до много твърд може да бъде зададен поотделно за всяко вещество и среда, за да отговори на специфичните изисквания за приложение.

клетъчна структура

Клетките са защитени от полупропусклива плазмената мембрана, която се състои от фосфо-липиди двуслойна (също протеин-липид двуслойна, образуван от хидрофобните липиди и хидрофилни фосфорни молекули с вградени протеинови молекули) и създава бариера между клетъчните интериора (цитоплазма) и извънклетъчната среда. Растителните клетки и прокариотни клетки са заобиколени от клетъчна стена. Поради множество слоеве с дебелина от клетъчната стена на целулоза, растителни клетки са по-трудни за лизиране от животински клетки. вътрешността на клетката, като органели, ядро, митохондриалната, се стабилизира чрез цитоскелета.
Чрез лизиране на клетките, тя е насочена към извличане и отделяне на органели, протеини, ДНК, РНК или други биомолекули.

Звукообработка обикновено се използва за приготвянето на проби от клетъчни материя.

Фигура 1:. Ултразвукова екстракция от клетки: микроскопско напречна секция (TS) на апикалната стебло на мента (Mentha Piperita) показва механизма на действия през ултразвукова екстракция от клетки (увеличение 2000x) [ресурс Vilkhu и сътр. 2011]

методи

Съществуват няколко метода за лизат клетки, които могат да бъдат разделени на механични и химични методи, които включват използването на детергенти или разтворители, прилагането на високо налягане, или използването на топкова мелница или на френска преса. Най-проблематично Недостатък на тези методи е трудно за контрол и регулиране на параметрите на процеса и по този начин въздействието.
Основните недостатъци на общи методи за лизиране:

Различни техники за лизиране

Таблица: Конвенционалните методи за лизиране на клетката имат съществени недостатъци

Напротив, на ултразвук е много ефективен и надежден инструмент за клетъчно разпадане, че дава възможност за пълен контрол върху параметрите на ултразвук. Това осигурява по-висока селективност за освобождаване материали и чистота на продукта. [Balasundaram и сътр. 2009] Той е подходящ за всички видове клетки и лесно приложим в малък и голям мащаб. Ultrasonicators са лесни за почистване. Ултразвуков хомогенизатор винаги разполага почистване на място (CIP) и се стерилизира на място (SIP) функция. На издатината се състои от масивна титанов рог, които могат да бъдат заличени или промие с вода или разтворител (в зависимост от работната среда). Поддържането на ultrasonicators се дължи на тяхната здравина почти neglectable.

лизис

Лизис е чувствителен процес. По време на лизиса се разрушава защитата на клетъчната мембрана, обаче инактивиране, денатуриране и разграждането на протеини, извлечени от прилагане на нефизиологичен среда (отклонение от рН-стойност) трябва да бъде предотвратено. Следователно, като цяло лизис се провежда в буферен разтвор. Повечето трудности при неконтролирано клетъчно разрушаване води до нецелеви освобождаване на всички вътреклетъчния материал и / или на денатуриране от целевия продукт.

Ултразвуково клетъчен лизис може да бъде използван за подготовка на пробите в лабораторията и за производството на големи обеми. Кликнете, за да уголемите!

Фиг 1:. 200 вата мощен ултразвуков хомогенизатор Uf200 ः т с цифрово управление и автоматично записване на данни за надеждна и възпроизводима лизиране на клетката.

Ултразвуков Lysis

Обикновено, лизирането на пробите в лабораторията ще отнеме между 15 секунди и 2 минути. Тъй като интензивността на ултразвуковото обработване е много лесно да се настрои чрез амплитуда, настройвайки времето за ултразвук, както и чрез избора на подходящо оборудване, възможно е да се разрушат клетъчните мембрани много внимателно или много рязко, в зависимост от клетъчната структура и от целта на лизис напр. ДНК екстракцията изисква по-мека ултразвукова обработка, пълната протеинова екстракция на бактериите изисква по-интензивно ултразвуково третиране). Температурата по време на процеса може да се контролира чрез вграден температурен датчик и може лесно да се контролира чрез охлаждане (ледена баня или поточни клетки с охлаждащи якета) или чрез ултразвук в импулсен режим. При ултразвуково импулсно озвучаване кратки цикли на разрушаване с ултразвук с продължителност 1-15 секунди позволяват разсейване на топлината и охлаждане по време на по-дълги периоди на прекъсване.
Всички процеси ехографски задвижване са напълно възпроизводими и линейно мащабируеми.

Ултразвуков хомогенизатор VialTweeter за получаване едновременно проба до 10 епруветки. (Кликнете за увеличение!)

Ултразвуковото устройство VialTweeter дава възможност за получаване едновременно проба до 10 флакони под същите условия на процеса.

Ултразвукови Хомогенизатори

Различни видове Ултразвукови устройства даде възможност за съвпадение цел подготовка на пробата и да се уверя, лекота на употреба и експлоатация комфорт. Сонда тип ultrasonicators са най-често използваните устройства в лабораторията. Те са най-подходящи за приготвяне на малки и средни проби с обеми от 0.1 ml до 1000 ml. Различни размери на енергия и sonotrodes позволяват да се адаптира ултрасоннкаторът на обема на пробата и съдът за най-ефективни и ефикасни резултати ултразвук. ултразвукова сонда устройство е най-добрият избор, когато единични проби трябва да бъдат подготвени.

Ако трябва да се приготвят повече проби, например 8 флакона клетъчен разтвор, като най-подходящ хомогенизатор за лизиране са устройства като VialTweeter или ултразвуков куфорен. Няколко флакона се обработват с ултразвук едновременно, със същата интензивност. Това спестява не само времето, но и същото третиране на всички проби, което прави резултатите сред пробите надеждни и сравними. Освен това се избягва кръстосано замърсяване чрез потапяне на ултразвуковия sonotrode (също така известен като ултразвукова сонда, рог, връх или пръст). Тъй като се използват флакони, отнемането на време и почистването на пробите поради декантиране на съдове се пропускат.
За по-големи обеми, например за търговско производство на клетъчни екстракти, постоянно ултразвукови системи с реактор поток клетки са най-подходящи. Непрекъснатото и дори потока на обработвания материал осигурява още по ултразвук. Всички параметри на процеса на ултразвукова дезинтеграция могат да бъдат оптимизирани и адаптирани към изискванията на приложението и специфичен клетъчен материал.

Примерната процедура за ултразвукова лизиране на бактериални клетки:

  • Получаване на клетъчната суспензия: Клетъчни пелети трябва да бъде напълно суспендират в буферен разтвор от хомогенизиране (изберете буферен разтвор, съвместим със следните анализи, например специфичен метод хроматография). Добави лизозими и / или други добавки, ако е необходимо (те трябва да бъде съвместим с отделяне / пречистване средства). Разбърква / хомогенизира разтворът внимателно при леко ултразвук докато се постигне пълна суспензия.
  • Ултразвуков лиза: Поставя се пробата в ледена баня. За разрушаване на клетката, се озвучава спирането на 60-90 секунди тласъци (с помощта на импулсен режим ви ултрасоникатор му).
  • (. Например 10 минути при 10 000 х г, при 4degC): Разделяне Центрофугира лизат. Отделете повърхностния слой от клетъчна пелета внимателно. Супернатантът е общия клетъчен лизат. След филтруване на супернатантата, можете получи изяснени течност на разтворим клетъчен протеин.

Най-често срещаните заявленията за ultrasonicators в биологията и биотехнологиите, са:

  • подготовка клетъчен екстракт
  • разрушение дрожди, бактерии, растителни клетки, мека & твърд клетъчна тъкан, нуклеинова материал
  • екстракция на протеин
  • Получаване и изолиране на ензими
  • Производство на антигени
  • ДНК екстракция и / или насочени фрагментация
  • подготовка на липозоми
Висока мощност ултразвукови хомогенизатори като UIP1000hd се използват за разрушаване на клетката и извличане в режим на непрекъснат поток, макар че партидата или. (Кликнете за увеличение!)

Ултразвукови настолни системи, като например UIP1000hd (1 kW) може да обработва по-големи обеми от биологичен материал.

Многообразната приложенията на ултразвуковите разклонява в секторите на биотехнологиите, биоинженерство, микробиология, молекулярна биология, биохимия, имунология, микробиология, вирусология, протеомиката, генетика, физиология, клетъчна биология, хематология, и ботаника.

За оценка и оптимизиране на заявки на клиентите, Hielscher Ultrasonics предлага напълно оборудвана Лабораторни Ултразвуково Метод, Моля, свържете се с нас за допълнителна информация!

Позоваването литература /

  • Balasundaram, В .; Harrison, S .; Брейсуел, Д. Г. (2009): Напредъкът в стратегиите за освобождаване продукт и въздействие върху биологичен метод дизайн. Тенденции в Биотехнологии 27/8, 2009 г. стр. 477-485.
  • Vilkhu, К .; Манасия, R .; Mawson, R .; Ashokkumar, М. (2011): Ултразвуков възстановяване и модификация на хранителни съставки. В: Фън / Барбоса-Cánovas / Вайс (2011): Ултразвукови за прехрана и Bioprocessing. Ню Йорк: Springer, 2011. стр 345-368..

Свържете се с нас / Попитай за повече информация

Свържете се с нас за вашите изисквания за обработка. Ние ще ви препоръча най-подходящите настройки и обработка на параметрите за вашия проект.





Моля, обърнете внимание, че нашите Правила за поверителност,