Lizis uchun sonikatsiya: hujayraning buzilishi va ekstraktsiyasi
Hujayra parchalanishi yoki lizis biotexnologik laboratoriyalarda kundalik namuna tayyorlashning umumiy qismidir. Lizisning maqsadi biologik molekulalarni chiqarish uchun hujayra devorining qismlarini yoki to'liq hujayrani buzishdir. Ultrasonik gomogenizatorlar muvaffaqiyatli hujayra lizisi uchun keng qo'llaniladi. Murakkab ultrasonikatorlarning asosiy afzalligi - bu intensivlik va harorat kabi jarayon parametrlarini aniq nazorat qilish, bu yumshoq, ammo yuqori samarali hujayra buzilishi va ekstraktsiyasiga imkon beradi.
Ultratovush yordamida hujayra lizisi
Ultrasonik hujayra lizisi va ekstraktsiyasi yuqori chastotali tovush to'lqinlari, ya'ni ultratovush yordamida ochiq hujayralarni sindirish va tarkibini olish uchun ishlatiladigan usuldir. Sonikatsiya - bu hujayralarni buzish va hujayra ichidagi materialni olishning o'rnatilgan va ishonchli usullari sifatida keng qo'llaniladigan liziz usuli. Ultrasonik lizis - plazmid, retseptor tahlillari, oqsillar, DNK, RNK va boshqalarni o'z ichiga olgan lizatlarni tayyorlashning ishonchli usulidir. Ultrasonik intensivlikni jarayon parametrlarini sozlash orqali tekislash mumkin bo'lganligi sababli, ultratovush intensivligi juda yumshoqdan intensivgacha bo'lgan optimal sonikatsiya intensivligi alohida o'rnatilishi mumkin. maxsus dastur talablariga javob beradigan har bir modda va vosita. Lizisning keyingi bosqichlari fraksiyalash, organellalarni ajratish yoki/yoki oqsillarni ajratib olish va tozalashdan iborat. Olingan material (= lizat) ajratilishi kerak va qo'shimcha tekshiruvlar yoki qo'llanilishi kerak, masalan, proteomik tadqiqotlar uchun.
Ultrasonik gomogenizatorlar UP100H (100 vatt) va UP400St (400 vatt) lizis va ekstraktsiya kabi namunalarni tayyorlash uchun.
Boshqa hujayra lizizi va ekstraktsiya usullari bilan solishtirganda, ultratovushli hujayra lizisi bir qator afzalliklarga ega:
- Tezlik: Ultrasonik hujayra lizis va ekstraktsiyasi bir necha soniya ichida ochiq hujayralarni buzishi mumkin bo'lgan tezkor usuldir. Bu gomogenizatsiya, muzdan eritish yoki boncuklarni maydalash kabi boshqa usullarga qaraganda ancha tezroq.
- Samaradorlik: Ultrasonik hujayra lizisi va ekstraktsiyasi bir vaqtning o'zida kichik, katta yoki bir nechta namunalarni davolash uchun ishlatilishi mumkin, bu kichik namunalarni individual qayta ishlashni talab qiladigan boshqa usullarga qaraganda samaraliroq bo'ladi.
- Kimyoviy moddalarsiz: Ultrasonik hujayra lizisi va ekstraktsiyasi invaziv bo'lmagan usul bo'lib, qattiq kimyoviy moddalar yoki fermentlardan foydalanishni talab qilmaydi. Bu uni hujayra tarkibining yaxlitligi saqlanishi kerak bo'lgan ilovalar uchun ideal qiladi. Namunalarning kiruvchi ifloslanishining oldini olish mumkin.
- Yuqori hosil: Ultrasonik hujayra lizisi va ekstraktsiyasi DNK, RNK va oqsillarni o'z ichiga olgan hujayra tarkibining yuqori hosilini olishi mumkin. Buning sababi shundaki, yuqori chastotali tovush to'lqinlari hujayra devorlarini buzadi va tarkibini atrofdagi eritma ichiga chiqaradi.
- Harorat nazorat qilish: Murakkab ultratovush apparatlari namunaning haroratini aniq nazorat qilish imkonini beradi. Hielscher raqamli sonikatorlari ulanadigan harorat sensori va haroratni kuzatish dasturi bilan jihozlangan.
- Qayta tiklanadigan: Ultrasonik hujayra lizisining protokollari osongina ko'paytirilishi va hatto oddiy chiziqli o'lchov orqali turli kattaroq yoki kichikroq namuna hajmlariga mos kelishi mumkin.
- Ko'p tomonli: Ultrasonik hujayra lizis va ekstraktsiyasi bakteriyalar, xamirturush, zamburug'lar, o'simlik va sutemizuvchilar hujayralarini o'z ichiga olgan keng turdagi hujayra turlarini olish uchun ishlatilishi mumkin. Bundan tashqari, oqsillar, DNK, RNK va lipidlarni o'z ichiga olgan har xil turdagi molekulalarni olish uchun ham foydalanish mumkin.
- Bir vaqtning o'zida bir nechta namunalarni tayyorlash: Hielscher Ultrasonics bir xil jarayon sharoitida ko'plab namunalarni qulay tarzda qayta ishlash uchun bir nechta echimlarni taklif qiladi. Bu lizis va ekstraktsiyaning namunani tayyorlash bosqichini yuqori samarali va vaqtni tejaydi.
- Foydalanish oson: Ultrasonik hujayra lizis va ekstraktsiya uskunasidan foydalanish oson va minimal tayyorgarlikni talab qiladi. Uskuna ham tejamkor, chunki u bitta investitsiya bo'lib, utilizatsiyani qayta sotib olishni talab qilmaydi. Bu uni keng doiradagi tadqiqotchilar va laboratoriyalar uchun jozibador qiladi.
Umuman olganda, ultratovushli hujayra lizisi va ekstraktsiyasi uyali tarkibni olishning tez, samarali, aniq boshqariladigan va ko'p qirrali usuli hisoblanadi. Uning muqobil usullarga nisbatan afzalliklari uni keng ko'lamli tadqiqot va sanoat ilovalari uchun jozibador tanlovga aylantiradi.
Ultrasonik hujayra lizisining ishlash printsipi
Ultrasonik hujayra lizisi va ekstraktsiyasi hujayralarni buzish va ularning tarkibini olish uchun yuqori chastotali tovush to'lqinlaridan foydalanadi. Ovoz to'lqinlari atrofdagi suyuqlikda bosim o'zgarishini keltirib chiqaradi, bu esa kavitatsiya deb nomlanuvchi jarayonda kichik pufakchalar paydo bo'lishiga va qulashiga olib keladi. Ushbu pufakchalar ochiq hujayralarni sindirishi va ularning tarkibini atrofdagi eritma ichiga chiqarishi mumkin bo'lgan lokalizatsiya qilingan yuqori intensiv mexanik kuchlarni hosil qiladi.
Ultrasonikator yordamida hujayra lizisi odatda quyidagi bosqichlarni o'z ichiga oladi:
- Namuna suyuqlik buferi bo'lgan naycha yoki idishga joylashtiriladi.
- Namunaga ultratovushli zond va taxminan 200 ga yaqin yuqori chastotali tovush to'lqinlari kiritiladi. 20-30 kHz qo'llaniladi.
- Ultratovush to'lqinlari atrofdagi suyuqlikda tebranish va kavitatsiyani keltirib chiqaradi, bu esa ochiq hujayralarni buzadigan va ularning tarkibini chiqaradigan mahalliy kuchlarni hosil qiladi.
- Namuna har qanday uyali qoldiqlarni olib tashlash uchun santrifüj qilinadi yoki filtrlanadi va olingan tarkib quyi oqim tahlili uchun yig'iladi.
Kuchli ultratovush to'lqinlari biologik tuzilmalarning hujayra matritsasini buzadi va bioaktiv birikmalarni chiqaradi. O'simlik materiali va erituvchi (masalan, bufer) o'rtasida massa almashinuvi kuchayadi. (grafik: ©Vilkhu va boshqalar, 2006)
Umumiy lizis usullarining kamchiliklari
Laboratoriyalarda ishlaganingizda, an'anaviy mexanik yoki kimyoviy liziz protokollaridan foydalangan holda hujayra lizisini allaqachon boshdan kechirgan bo'lishingiz mumkin.
- Mexanik lizis: Mexanik lizis usullari, masalan, ohak va pestle bilan silliqlash yoki frantsuz pressi, boncuk tegirmoni yoki rotor-stator tizimi yordamida homogenlash ko'pincha aniq nazorat qilish va sozlash imkoniyatlariga ega emas. Bu shuni anglatadiki, frezalash va maydalashdan foydalanish tezda namunaga zarar etkazishi va oqsillarni denatüratsiya qilishi mumkin bo'lgan issiqlik va kesish kuchlarini keltirib chiqarishi mumkin. Ular, shuningdek, ko'p vaqt talab qilishi mumkin va katta miqdorda boshlang'ich materialni talab qiladi.
- Kimyoviy lizis: Kimyoviy lizis usullari, masalan, yuvish vositalariga asoslangan lizis, lipid ikki qatlamini buzish va oqsillarni denaturatsiya qilish orqali namunaga zarar etkazishi mumkin. Ular, shuningdek, bir nechta qadamlarni talab qilishi mumkin va quyi oqim ilovalariga xalaqit beradigan qoldiq ifloslantiruvchi moddalarni qoldirishi mumkin. Detarjanning optimal dozasini topish qo'shimcha muammodir.
- Muzlatish-eritish davrlari: Muzlatish-eritish davrlari hujayra membranalarining yorilishiga olib kelishi mumkin, ammo takroriy tsikllar oqsilning denaturatsiyasi va degradatsiyasiga ham olib kelishi mumkin. Bu usul, shuningdek, ko'p davrlarni talab qilishi mumkin, bu ko'p vaqt talab qilishi va ko'pincha past rentabellikka olib kelishi mumkin.
- Enzimatik liziz: Enzimatik lizis usullari ma'lum hujayra turlariga xos bo'lishi mumkin va bir necha bosqichlarni talab qiladi, bu ularni ko'p vaqt talab qiladi. Ular, shuningdek, chiqindilarni hosil qiladi va namunaning degradatsiyasini oldini olish uchun ehtiyotkorlik bilan optimallashtirishni talab qiladi. Enzimatik lizis to'plamlari ko'pincha qimmat. Agar joriy enzimatik lizis protsedurangiz etarli natija bermasa, hujayra buzilishini kuchaytirish uchun sinergik usul sifatida sonikatsiya qo'llanilishi mumkin.
An'anaviy mexanik va kimyoviy hujayra lizis usullaridan farqli o'laroq, sonikatsiya sonikatsiya parametrlarini to'liq nazorat qilish imkonini beruvchi hujayra parchalanishi uchun juda samarali va ishonchli vositadir. Bu materiallarning chiqarilishi va mahsulot tozaligi bo'yicha yuqori selektivlikni ta'minlaydi. [qarang. Balasundaram va boshqalar, 2009]
U barcha hujayra turlariga mos keladi va kichik va katta hajmda osongina qo'llaniladi – har doim boshqariladigan sharoitlarda. Ultrasonikatorlarni tozalash oson. Ultrasonik gomogenizator har doim joyida tozalash (CIP) va joyida sterilizatsiya qilish (SIP) funksiyalariga ega. Sonotrod katta titan shoxidan iborat bo'lib, uni artib yoki suvda yoki erituvchida (ishchi muhitga qarab) yuvish mumkin. Ultrasonikatorlarga texnik xizmat ko'rsatish ularning mustahkamligi tufayli deyarli e'tiborga olinmaydi.
Ultrasonik lizis va hujayraning buzilishi
Odatda, laboratoriyada namunalarni lizislash 15 soniyadan 2 daqiqagacha davom etadi. Sonicationning intensivligi amplitudani sozlash bilan sonikatsiya vaqtini sozlash va o'ng uskunani tanlash bilan juda oson bo'lgani uchun hujayra tuzilishiga va lizizlash maqsadiga qarab hujayra membranalarini juda yumshoq yoki o'ta keskin tarzda buzish mumkin ( Masalan, DNKni ekstraktsiyalash yumshoq ultrasonga talab qiladi, bakteriyalarning to'liq oqsillarni ekstraktsiyalashishi yanada qizg'in ultratovushli davolashni talab qiladi). Jarayon davomida haroratni integratsiya qilingan harorat sensori bilan kuzatish mumkin va sovutish (muzli hammom yoki sovutish ko'ylagi bilan oqim kameralari) yoki pulsli rejimda sonikatsiya orqali osongina nazorat qilinishi mumkin. Pulse-rejimidagi sonikatsiya vaqtida 1-15 sekundlik qisqa sonikatsiya burilishining davrlari issiqlik tarqalishiga va uzoqroq intervalgacha davrlarda sovutishga imkon beradi.
Barcha ultratovush yuritmali jarayonlar butunlay qayta qo'lga olingan va Liniya ölçeklenebilir.
VialTweeter ko'plab namunalarni bir vaqtning o'zida, bir xil va tez steril tayyorlash uchun ultratovushli gomogenizator.
Hujayra lizisi va ekstraktsiyasi uchun ultratovushli homogenizatorlar
Har xil turdagi ultratovush qurilmalari namunani tayyorlash maqsadiga mos kelish va foydalanuvchilarga qulaylik va ishlash qulayligini ta'minlash imkonini beradi. Prob tipidagi ultrasonikatorlar laboratoriyada eng keng tarqalgan qurilmalardir. Ular hajmi 0,1 ml dan 1000 ml gacha bo'lgan kichik va o'rta o'lchamdagi namunalarni tayyorlash uchun eng mos keladi. Turli quvvat o'lchamlari va sonotrodlar ultrasonikatorni eng samarali va samarali sonikatsiya natijalari uchun namuna hajmiga va idishga moslashtirishga imkon beradi. Ultrasonik prob qurilmasi bitta namunani tayyorlash kerak bo'lganda eng yaxshi tanlovdir.
Agar ko'proq namunalar tayyorlash kerak bo'lsa, masalan, 8-10 flakon hujayra eritmasi, VialTweeter yoki ultratovushli kupa kabi ultratovush tizimlari bilan intensiv bilvosita sonikatsiya samarali lizis uchun eng mos homogenlash usuli hisoblanadi. Bir vaqtning o'zida bir xil intensivlikda bir nechta flakonlar soniklanadi. Bu nafaqat vaqtni tejaydi, balki barcha namunalarga bir xil ishlov berishni ta'minlaydi, bu esa namunalar orasidagi natijalarni ishonchli va taqqoslanadigan qiladi. Bundan tashqari, bilvosita sonikatsiya paytida ultratovushli sonotrodni (shuningdek, ultratovushli zond, shox, uchi yoki barmoq deb ham ataladi) botirish orqali o'zaro ifloslanishdan qoching. Namuna o'lchamiga mos keladigan flakonlar alohida-alohida qo'llanilganligi sababli, ko'p vaqt talab qiladigan tozalash va idishlarni dekanatsiya qilish natijasida namunani yo'qotish hisobga olinmaydi. Ko'p teshikli yoki mikrotitrli plitalarning yagona sonikatsiyasi uchun Hielscher UIP400MTP ni taklif qiladi.
yuqori hajmi uchun, masalan, Uyali aloqa ekstraktlar tijorat ishlab chiqarish uchun, oqim hujayra reaktori bilan uzluksiz ultratovush tizimlari eng MUMKIN. qayta materiallar uzluksiz va hatto oqimi ham sonication ishontiradi. ultratovush bo'linish jarayonining barcha parametrlarini optimallashtirish va qo'llash va maxsus hujayra materiallar talablariga moslash mumkin.
bakterial hujayralar ultratovush lysing uchun namunaviy tartibi:
- Uyali aloqa to'xtatib tayyorlash: Uyali aloqa granulalar butunlay (quyidagi tahlil qilish, masalan, muayyan xromatografiya usuli bilan mos sizning bufer eritma tanlash) homojenleştirici tomonidan bufer eritma holida kerak. kerak bo'lsa lysozymes va / yoki boshqa qo'shimchalarni qo'shish, (ular ajratish / tozalash vositalari bilan ham mos bo'lishi kerak). / Aralashtiring to'liq to'xtatib turish erishiladi qadar yumshoq sonikasyon ostida sekin hal homojenize.
- Ultratovush parchalanishiga: bir muz hammom ichida namunasi qo'ying. Uyali aloqa uzilishi uchun, (sizning ultrasonicator ning puls rejimi yordamida) 60-90 ikkinchi portlashlari da to'xtatib tovush to'lqinlarining ta'sir.
- (. Masalan, 10 min 10000 da x g; 4degC da): ajratish lizat santrifüj. diqqat hujayra pelletini süpernatant ajrating. Süpernatan jami hujayra lizatı hisoblanadi. süpernatan filtrlash so'ng, eruvchan hujayra oqsili bir aniqlanishi suyuqlik olish.
biologiya va biotexnologiya ultrasonicators uchun eng keng tarqalgan dasturlar:
- Uyali aloqa ko'chirma tayyorlash
- Xamirturush, bakteriyalar, o'simlik hujayralari, yumshoq yoki qattiq hujayra to'qimalari, nuklein moddasining buzilishi
- Protein qazib olish
- Tayyorlash va fermentlar izolyatsiya
- antijenlerin ishlab chiqarish
- va / yoki maqsadli bo'linishi DNK qazib olish
- lipozom tayyorlash
Prob tipidagi ultrasonikator yordamida hujayra buzilishi namunani tayyorlashning samarali usuli hisoblanadi.
Quyidagi jadval sizga hujayra buzilishi va ekstraktsiyasi uchun ultrasonikatorlarimiz haqida umumiy ma'lumot beradi. Har bir ultratovushli gomogenizator haqida ko'proq ma'lumot olish uchun qurilma turini bosing. Bizning yaxshi o'qitilgan va ko'p yillik tajribaga ega texnik xodimlarimiz sizga namunalaringiz uchun eng mos ultratovushni tanlashda yordam berishdan xursand bo'lishadi!
| Buyurtma miqdori | Oqim darajasi | Tavsiya Qurilmalar |
|---|---|---|
| 10 flakon yoki naychagacha | ga | VialTweeter |
| ko'p teshikli / mikrotitrli plitalar | ga | UIP400MTP |
| bir nechta naychalar / tomirlar | ga | Cuphorn |
| 1 500ml uchun | 10 200ml / min uchun | UP100H |
| 10 dan 1000 ml gacha | 20-200 ml/min | Uf200 ः t, UP200St |
| 10 2000mL uchun | 20 400ml / min uchun | UP400St |
biotexnologiya, biyomühendislik, mikrobiologiya, molekulyar biologiya, biokimyo, immunologiya, bakteriologiya, virusologiya, proteomik, genetika, fiziologiya, uyali biologiya, Gematologiya va botanika tarmoqlari amalga ultratovush filiallari manifold ilovalar.
Lizis: hujayra tuzilmalarini buzish
Hujayralar bir phospho-lipid ikki tomonlama qatlamlarida (ham oqsil-lipid qatlamlik; hidrofob lipidlar va ichki oqsil molekulalarining bilan hidrofil fosfor molekulalar tomonidan tashkil) iborat bir yarim-geçirgen plazma membrana bilan himoya qilinadi va hujayra ichki o'rtasida to'siq (sitoplazma) yaratadi va g'ayrihujayraviy atrof-muhit. O'simlik hujayralari va prokaryotik hujayralar hujayra devori bilan o'ralgan bo'ladi. Tufayli bir necha qatlamlari tsellyuloza qalin hujayra devori uchun, o'simlik hujayralari hayvon hujayralarining nisbatan Liz qiyin bo'ladi. Bunday organellerin, yadro, mitoxondriyalarga sifatida hujayra ichki, hujayra çatısının tomonidan barqarorlashadi.
hujayralarni lysing qasamki, qazib olish va organel proteinlar, DNK, mRNA yoki boshqa biyomoleküllerin ajratib qaratilgan.
Hujayra lizisining an'anaviy usullari va ularning kamchiliklari
Mexanik va kimyoviy usullarga bo'linadigan, ya'ni detarjen yoki erituvchilarni ishlatish, yuqori bosimni qo'llash yoki boncuk tegirmonini yoki frantsuz matbuotidan foydalanishga imkon beradigan hujayralarni lizatlashning bir necha usullari mavjud. Ushbu usullarning eng muammoli kamchiliklari protsess parametrlarining murakkab nazorat va sozlashlari va shuning uchun ta'sir ko'rsatadi.
Quyidagi jadvalda umumiy liziz usullarining asosiy kamchiliklari ko'rsatilgan:
Jadval: hujayra lizisine oqsaydi usullari asosiy kamchiliklari bor
Lizis jarayoni
Parchalanishiga nozik jarayon. parchalash davomida hujayra membranasi himoya ega unphysiological muhitda (pH-qiymati og'ish) tomonidan qazib oqsillarning Biroq inaktivasyonu, denatürasyon va buzilishi oldini olish kerak, yo'q qilinadi. Shuning uchun, umuman parchalash bir bufer eritma amalga oshiriladi. Eng qiyinchiliklar barcha hujayra ichidagi moddiy yoki / va maqsadli mahsulot denatürasyon bir hedefsiz ozod natijada nazoratsiz hujayra uzilishi kelib chiqadi.
Adabiyotlar / manbalar
- Balasundaram, B.; Harrison, S.; Bracewell, D. G. (2009): Advances in product release strategies and impact on bioprocess design. Trends in Biotechnology 27/8, 2009. pp. 477-485.
- Vilkhu, K.; Manasseh, R.; Mawson, R.; Ashokkumar, M. (2011): Ultrasonic Recovery and Modification of Food ingredients. In: Feng/ Barbosa-Cánovas/ Weiss (2011): Ultrasound Technologies for Food and Bioprocessing. New York: Springer, 2011. pp. 345-368.
- Nico Böhmer, Andreas Dautel, Thomas Eisele, Lutz Fischer (2012): Recombinant expression, purification and characterisation of the native glutamate racemase from Lactobacillus plantarum NC8. Protein Expr Purif. 2013 Mar;88(1):54-60.
- Brandy Verhalen, Stefan Ernst, Michael Börsch, Stephan Wilkens (2012): Dynamic Ligand-induced Conformational Rearrangements in P-glycoprotein as Probed by Fluorescence Resonance Energy Transfer Spectroscopy. J Biol Chem. 2012 Jan 6;287(2): 1112-27.
- Claudia Lindemann, Nataliya Lupilova, Alexandra Müller, Bettina Warscheid, Helmut E. Meyer, Katja Kuhlmann, Martin Eisenacher, Lars I. Leichert (2013): Redox Proteomics Uncovers Peroxynitrite-Sensitive Proteins that Help Escherichia coli to Overcome Nitrosative Stress. J Biol Chem. 2013 Jul 5; 288(27): 19698–19714.
- Elahe Motevaseli, Mahdieh Shirzad, Seyed Mohammad Akrami, Azam-Sadat Mousavi, Akbar Mirsalehian, Mohammad Hossein Modarressi (2013): Normal and tumour cervical cells respond differently to vaginal lactobacilli, independent of pH and lactate. ed Microbiol. 2013 Jul; 62(Pt 7):1065-1072.