Масштабування синтезу пептидів: ультразвукові стратегії для періодичного та безперервного процесів
Синтез пептидів із застосуванням ультразвуку поєднує відомі методи пептидної хімії з високочастотною механічною енергією для прискорення реакційних та транспортних процесів. Акустична кавітація – утворення і згортання мікроскопічних бульбашок – спричиняє інтенсивне локальне перемішування, утворення мікроструменів та зсувних сил. У процесі синтезу пептидів ці ефекти покращують транспортування реагентів, змочування смоли, розчинення та руйнування агрегатів. Отже, низькочастотний ультразвук діє насамперед як засіб інтенсифікації процесу: він не замінює хімію сполучення, але може зробити сполучення, зняття захисних груп, промивання, розщеплення та обробку результатів значно швидшими та ефективнішими.
Проблема збільшення масштабів виробництва пептидів
Масштабування виробництва пептидів з лабораторного рівня до промислового є складним завданням, оскільки незначні втрати ефективності накопичуються протягом численних циклів кон’югації та депротекції, що знижує вихід і збільшує кількість домішок, які важко видалити. Більші реактори також створюють обмеження щодо перемішування, теплообміну, набрякання смоли та транспортування реагентів, тоді як споживання розчинника, вимоги до очищення та виробничі витрати різко зростають. Тому для успішного масштабування необхідно зберегти однорідність реакції та якість продукту, забезпечуючи при цьому відтворювану продуктивність, ефективне використання ресурсів та точний контроль усіх критичних параметрів процесу.
Фармацевтична партія з використанням ультразвукового апарату UIP2000hdT для покращення синтезу пептидів
Стратегії синтезу пептидів із застосуванням ультразвуку
Ультразвуковий синтез пептидів у твердій фазі
Ультразвуковий синтез пептидів у твердій фазі (SPPS) з використанням Fmoc є найбільш детально вивченою ультразвуковою стратегією. Ультразвукова обробка сприяє проникненню реагентів для зняття захисних груп та з'єднання в набряклі полімерні кульки, одночасно зменшуючи застійні прикордонні шари навколо смоли. Вона також може запобігати агрегації на смолі, що є важливою причиною неповного перетворення в гідрофобних та інших “складний” послідовності.
Експериментальні дослідження продемонстрували можливість ультразвукового синтезу біологічно активних пептидів, що містять аж 44 залишки, з меншим витратою сировини та скороченням тривалості реакції без помітного посилення основних побічних реакцій за описаних умов. (див. Мерліно та ін., 2019)
В іншому дослідженні повідомлялося про скорочення часу синтезу окремих пептидів у 4–14 разів; 25-мер, багатий на гідрофобні залишки, було синтезовано за 347 хвилин. (див. Silva та ін., 2021)
Ультразвукове дослідження можна проводити під час:
- Набухання смоли та обмін реагентами
- Депротекція Fmoc або Boc
- Активація та сполучення амінокислот
- Проміжне промивання
- Циклізація на основі смоли
- Відділення готового пептиду від носія
Рідкофазний синтез та синтез із використанням міток
Ультразвук також може підвищити ефективність традиційного рідкофазного синтезу пептидів, прискорюючи розчинення, диспергування реагентів та масообмін у гетерогенних або в’язких сумішах. Його перевага, як правило, є найвизначнішою, коли процес обмежується змішуванням або транспортом; у випадку повністю однорідної реакції, що визначається виключно внутрішньою хімічною кінетикою, ефект може бути менш помітним.
Під час синтезу пептидів із використанням міток утворюваний пептид приєднується до розчинного або осаджуваного органічного анкора. Реакції протікають у розчині, після чого проміжний продукт із міткою виділяють шляхом осадження або фільтрації. Ультразвукова обробка може прискорити процеси сполучення, зняття захисних груп, циклізації та відщеплення мітки, одночасно утримуючи погано розчинні проміжні продукти у дисперсному стані.
| Техніка | Як ультразвукова обробка сприяє цьому | Значення та обмеження |
|---|---|---|
| Твердофазний синтез пептидів методом Fmoc | Ультразвукова обробка прискорює проникнення піперидину та видалення продуктів Fmoc; покращує транспортування активованих амінокислот у набряклу смолу; перешкоджає агрегації на смолі | Найпереконливіші докази та, як правило, найбільша користь |
| Твердофазний синтез за методом Бока | Ультразвукова обробка покращує проникнення кислоти, обмін реагентами, утворення зв’язків та промивання аналогічно до хімії Fmoc | Зберігання кислоти та її нагрівання вимагають обережності |
| Синтез у розчині/у рідкій фазі | Ультразвукова обробка покращує розчинення захищених амінокислот, диспергує осади та збільшує контакт у двофазних реакціях або реакціях у суспензії | Користь менша, коли реакція вже є однорідною та хімічно обмеженою за швидкістю |
| Синтез із використанням розчинних міток або методом осадження | Ультразвукова обробка забезпечує диспергування мічених проміжних сполук під час кон’югації та може покращити розчинення перед фільтрацією або осадженням | Корисно для погано розчинних або об’ємних препаратів; ультразвук, головним чином, полегшує обробку та сприяє масообміну |
| Потоковий або безперервний синтез | Ультразвукова обробка сприяє підтримці контакту між смолою та рідиною та запобігає утворенню локальних зон застою або агрегації | Масштабування за допомогою конструкції проточної комірки для рівномірного впливу ультразвуку |
| Лігація та циклізація фрагментів | Ультразвукова обробка дозволяє розчиняти гідрофобні фрагменти, руйнувати агрегати та покращувати міжмолекулярні взаємодії | Це саме по собі не прискорює кожен природний процес хімічного з'єднання або макроциклізації; домінуючими можуть залишатися надмірне розведення або міжмолекулярна агрегація |
| Ферментативний синтез пептидів | При відповідній інтенсивності ультразвукова обробка може змінювати динаміку ферментів та покращувати перенесення субстрату, особливо у випадку іммобілізованих ферментів або двофазних середовищ | Значною мірою залежить від ферментів; надмірна енергія призводить до розгортання або інактивації |
| Рибосомний/рекомбінантний синтез | Не має прямого впливу на переклад | Ультразвукову обробку застосовують переважно для руйнування клітин після експресії |
Масштабування ультразвукової технології: періодична, рециркуляційна та безперервна обробка
Ультразвукові апарати Hielscher можна безпроблемно інтегрувати у вашу конкретну технологічну лінію з синтезу пептидів.
Для збільшення масштабів виробництва актуальні три конфігурації реакторів:
- Партова обробка ультразвуком є простою та гнучкою, проте із збільшенням об’єму ємності стає складніше забезпечити оптимальну однорідність обробки.
- Процес рециркуляції передбачає багаторазове прокачування вмісту реактора через ультразвукову проточну комірку, що забезпечує більш рівномірну обробку, зберігаючи при цьому гнучкість періодичного режиму роботи.
- У системі безперервного потоку реакційний потік проходить через одну або кілька зон контрольованого ультразвукового оброблення. Час перебування, швидкість потоку та кількість введеної енергії можна точно задати, що робить цю архітектуру оптимальним вибором для високопродуктивного та відтворюваного виробництва.
У технологічних процесах із використанням смоли тракт потоку, насос і клапани повинні відповідати розміру гранул, щоб уникнути їхнього зносу або засмічення. Альтернативним варіантом є утримання смоли в реакторі з перемішуванням і циркуляція лише рідкої фази через ультразвукову камеру.
2 промислові ультразвукові апарати моделі UIP4000hdT підключений до реактора з проточною коміркою з нержавіючої сталі для виробництва пептидів.
Поширені запитання щодо масштабування ультразвукового синтезу пептидів
Що таке ультразвуковий синтез пептидів?
Ультразвуковий синтез пептидів передбачає використання звукових хвиль високої інтенсивності для поліпшення перемішування, масообміну та кінетики реакції під час синтезу пептидів. Акустична кавітація сприяє проникненню реагентів у набряклу смолу, розбиває агрегати та прискорює етапи з’єднання, зняття захисних груп, промивання та розщеплення.
Як ультразвук покращує твердофазний синтез пептидів?
У процесі ультразвукового твердофазного синтезу пептидів (US-SPPS) ультразвукова обробка покращує контакт між пептидом, зв’язаним із смолою, та розчиненими реагентами. Це дозволяє скоротити тривалість реакційних циклів, сприяти більш повному з’єднанню та зменшити кількість пропусків у послідовності, особливо під час синтезу гідрофобних, схильних до агрегації або інших складних пептидів.
Чи може ультразвукова обробка підвищити вихід і чистоту пептидів?
Ультразвукова обробка може підвищити ступінь перетворення, вихід сировини та чистоту завдяки рівномірному розподілу реагентів та зменшенню кількості неповних зв’язків. Результат залежить від послідовності пептиду, смоли, розчинника, хімічних властивостей зв’язування та параметрів ультразвукової обробки, тому кожен процес слід оптимізувати та підтвердити аналітично.
Які етапи синтезу пептидів можна обробляти ультразвуком?
Ультразвук може сприяти набряканню смоли, зняттю захисних груп Fmoc або Boc, сполученню амінокислот, промиванню, конденсації фрагментів, циклізації та відщепленню від твердої основи. Він також може покращувати розчинення та масообмін у синтезі пептидів у рідкій фазі та з використанням міток.
Дізнайтеся про ультразвуковий синтез пептидів – для твердофазного синтезу пептидів і – синтез методом маркування в рідкій фазі!
Чи підходить ультразвуковий синтез пептидів для складних послідовностей?
Так. Ультразвук є особливо корисним для гідрофобних послідовностей та послідовностей, схильних до агрегації, оскільки кавітація та мікропотоки сприяють руйнуванню агрегатів на смолі та покращують доступ реагентів до реакційних центрів. У складних випадках кон’югації все ж можуть знадобитися оптимізовані реагенти, повторне кон’югування або коригування умов реакції.
Чи можна збільшити масштаби ультразвукового синтезу пептидів?
Ультразвуковий синтез пептидів можна перенести з лабораторних досліджень на серійне, рециркуляційне або безперервне виробництво. Масштабування досягається шляхом збереження критичних параметрів, таких як амплітуда, питома енергія, температура та час перебування, при одночасному збільшенні ультразвукової потужності, площі сонотрода або кількості технологічних модулів.
Що означає лінійна масштабованість у сфері ультразвукової обробки?
Лінійна масштабованість означає, що пропускна здатність може зростати приблизно пропорційно до встановленої ультразвукової потужності, коли необхідна енергія на одиницю об’єму та інші технологічні умови залишаються незмінними. Наприклад, подвоєння ефективної ультразвукової потужності може приблизно подвоїти швидкість потоку за умови дотримання геометрії реактора, температури та цільових показників якості продукції.
Чому ультразвукові апарати Hielscher підходять для масштабування виробництва пептидів?
Ультразвукові апарати компанії Hielscher охоплюють лабораторний, пілотний та промисловий діапазони потужності, забезпечуючи стабільні та регульовані робочі параметри. Регульована амплітуда, автоматичний запис даних, контроль температури та тиску, сумісність із проточними комірками та модульні конфігурації сприяють відтворюваному перенесенню технологічних процесів та надійному виробництву.
Чи можуть ультразвукові апарати Hielscher використовуватися у безперервному виробництві пептидів?
Так. Промислові ультразвукові апарати компанії Hielscher можна інтегрувати в рециркуляційні контури та реактори з безперервним потоком у лінійній конфігурації. Такі конфігурації забезпечують контрольований час перебування та подачу енергії, одночасно зменшуючи відхилення між партіями продукції. Промислові системи розраховані на безперервну роботу 24 години на добу, 7 днів на тиждень у складних виробничих умовах.
Що краще підходить для синтезу пептидів: ультразвукові ванни чи ультразвукові апарати із зондом?
Ультразвукові ванни можуть бути зручними для попереднього відбору та одночасного оброблення невеликих закритих посудин. Ультразвукові прилади з датчиками подають ультразвук безпосередньо в середовище, забезпечуючи вищу інтенсивність, кращий контроль параметрів та більшу масштабованість. Відповідно, для пілотного та промислового виробництва зазвичай віддають перевагу датчикам та проточним коміркам.
Як регулюється температура під час ультразвукового синтезу пептидів?
Оскільки ультразвукова обробка вносить енергію в реакційну суміш, ефективне охолодження має вирішальне значення. Ультразвукові апарати Hielscher оснащені ємностями з водяною сорочкою, зовнішніми теплообмінниками, системою рециркуляції з регулюванням температури та імпульсною ультразвуковою обробкою, що дозволяє ефективно запобігати перегріванню. Знімні датчики температури та програмовані межі температури забезпечують надійний контроль і реєстрацію температури на всіх етапах розробки та виробництва.
Як вибрати ультразвуковий апарат Hielscher для синтезу пептидів?
Вибір залежить від обсягу партії, бажаної швидкості потоку, розчинника, в’язкості, концентрації твердих речовин або смоли, необхідної питомої енергії та графіка виробництва. Лабораторні випробування дозволяють визначити ефективні параметри технологічного процесу, після чого можна підібрати розміри ультразвукового апарату Hielscher, сонотрода та конфігурації проточної комірки відповідно до запланованої пропускної здатності.
Література / Список літератури
- Merlino, F., Tomassi, S., Yousif, A. M., Messere, A., Marinelli, L., Grieco, P., Novellino, E., Cosconati, S., Di Maro, S. (2019): Boosting Fmoc Solid-Phase Peptide Synthesis by Ultrasonication. Organic Letters, 21(16), 2019. 6378–6382.
- M. Ramya, Veeranjaneyulu Avula, S. Nandeesh, B. Kirankumar, G. Nagendra (2025): TAG assisted and ultrasonication mediated total synthesis of lipobactin. Results in Chemistry, Volume 18, 2025, 102842.
- Silva, R., Franco Machado, J., Gonçalves, K., Lucas, F. M., Batista, S., Melo, R., Morais, T. S., & Correia, J. (2021): Ultrasonication Improves Solid Phase Synthesis of Peptides Specific for Fibroblast Growth Factor Receptor and for the Protein-Protein Interface RANK-TRAF6. Molecules (Basel, Switzerland), 26(23), 7349.
- Raheem, Shvan J; Schmidt, Benjamin W; Solomon, Viswas Raja; Salih, Akam K; Price, Eric W (2020): Ultrasonic-Assisted Solid-Phase Peptide Synthesis of DOTA-TATE and DOTA-linker-TATE Derivatives as a Simple and Low-Cost Method for the Facile Synthesis of Chelator-Peptide Conjugates. ACS Bioconjugate Chemistry, 2020.
- Salvatore Mottola, Alessandra Del Bene, Vincenzo Mazzarella, Roberto Cutolo, Ida Boccino, Francesco Merlino, Sandro Cosconati, Salvatore Di Maro, Anna Messere (2015): Sustainable Ultrasound-Assisted Solid-Phase peptide synthesis (SUS-SPPS): Less Waste, more efficiency. Ultrasonics Sonochemistry, Volume 114, 2025.
Hielscher Ultrasonics виробляє високоефективні ультразвукові гомогенізатори з Лабораторії до промислові розміри.