Синтез пептидів у твердій фазі – більш ефективний за допомогою ультразвукової обробки
Синтез пептидів у твердій фазі (SPPS) є загальновживаним методом синтезу пептидів. Ультразвукова обробка є надійним інструментом для інтенсифікації синтезу пептидів у твердій фазі, що призводить до вищих виходів, покращеної чистоти, відсутності рацемізації та значного прискорення швидкості реакції. Hielscher Ultrasonics пропонує різні ультразвукові рішення для синтезу пептидів, розщеплення та розчинення.
Ультразвуковий синтез пептидів у твердій фазі
Ультразвукова обробка вже широко застосовується як метод інтенсифікації в органічному синтезі та відома своїми перевагами, такими як різке скорочення часу реакції, вищі виходи, менше побічних продуктів, ініціювання шляхів, які неможливо досягти іншими способами, та/або краща селективність. Великі переваги також можна отримати, коли ультразвукову обробку поєднують із реакціями синтезу пептидів. Результати досліджень показали, що синтез пептидів за ультразвукової допомоги досягає оптимізованого виходу пептидів з високою чистотою без рацемізації за короткий час реакції.
- Високі виходи пептидів
- Значно швидший синтез
- Вища чистота пептидів
- Відсутність рацемізації
- Паралельний синтез різних пептидів
- Масштабування до будь-якого об’єму
Ультразвуковий купхорн для однорідної ультразвукової обробки кількох реакторних посудин для покращеного синтезу пептидів.
Графіка, що демонструє синтез пептидів у твердій фазі за Мерріфілдом. Ультразвукова обробка використовується для сприяння та посилення реакції синтезу, а також для розщеплення синтезованих пептидів від смоли.
Графіка: ©Conejos-Sanchez et al., 2014)
| Дослідження | Досліджувані пептиди | Час реакції (класичний проти US-SPPS) | Чистота сирого продукту (класичний проти US-SPPS) | Рацемізація та побічні реакції | Ключові висновки |
|---|---|---|---|---|---|
| Wołczański et al. (2019) | Мет-енкефалін, UB33-43-OCam, TAT48-60-NH2, B2m58-69-NH2, ACP65-74-NH2, β-ендорфін | 600–1920 хв → 48–284 хв | 24,2–71,3% → 60,6–89,9% | Не спостерігалося для Cys/His, навіть при 70°C | ~7–12x швидший синтез; значні покращення чистоти, особливо для послідовностей, схильних до агрегації, таких як TAT. |
| Silva et al. (2021) | Pep1 (12-мер), Pep2 (9-мер), Pep3 (25-мер) | >3515/365 хв → ~250/85 хв (Pep1/Pep2); Pep3: 347 хв (лише US) | 73–84% → 72–82% (Pep1/Pep2) | Не тестувалося; зазначено незначне зниження чистоти в Pep2 | 14x скорочення часу для Pep1; виходи сирого продукту значно зросли. |
| Merlino et al. (2019) | Модельні пентапептиди, пептиди до 44-мерів, “складні послідовності” (Aβ 1-42, ACP 65-74) | 60 хв → 30 хв (модель) | 84% → 93% (модель); значно вище, ніж при термічному нагріванні (~45°C) | Немає значного збільшення для енантіомерів Cys/His | Дуже ефективний для складних/схильних до агрегації послідовностей; дозволяє зменшити надлишок реагентів, зберігаючи високу чистоту. |
Синтез пептидів у твердій фазі, покращений за допомогою ультразвуку
Синтез пептидів у твердій фазі (SPPS) – це хімічна реакція, яка дозволяє здійснювати збірку пептидного ланцюга шляхом послідовних реакцій похідних амінокислот на нерозчинному пористому носії. Однак традиційний синтез пептидів у твердій фазі є відносно неефективним і повільним процесом. Тому ультразвукове інтенсифікування синтезу пептидів є високоцінованим інструментом для більш ефективної та швидкої синтезу пептидів.
Silva et al. (2021) порівняли «класичний» синтез пептидів у твердій фазі з використанням флуоренілметоксикарбонілу (Fmoc) (SPPS) із SPPS, що використовує ультразвукову (US) допомогу, на основі приготування трьох пептидів, а саме специфічного для рецептора фактора росту фібробластів 3 (FGFR3) пептиду Pep1 (VSPPLTLGQLLS-NH2) та нових пептидів Pep2 (RQMATADEA-NH2) і Pep3 (AAVALLPAVLLALLAPRQMATADEA-NH2).
SPPS за участі US призвів до 14-кратного (Pep1) та 4-кратного (Pep2) скорочення часу збірки пептидів порівняно з «класичним» методом. Цікаво, що SPPS за участі ультразвуку дав Pep1 у вищій чистоті (82%), ніж «класичний» SPPS (73%). Значне скорочення часу в поєднанні з високою чистотою сирого пептиду спонукало дослідницьку групу застосувати SPPS за участі US до великого пептиду Pep3, який демонструє високу кількість гідрофобних амінокислот та гомоолігопослідовностей. Примітно, що синтез цього 25-мерного пептиду був досягнутий менш ніж за 6 годин (347 хв) із помірною чистотою (прибл. 49%).
Швидший синтез пептидів через синтез пептидів у твердій фазі з використанням ультразвукового перемішування.
(Дослідження та аналіз: Wołczański et al., 2019)
Merlino et al. (2019) також провели комплексне дослідження впливу ультразвуку на синтез пептидів у твердій фазі на основі Fmoc, що дозволило синтезувати різні біологічно активні пептиди (до 44-мерів) із помітною економією матеріалів та часу реакції. Вони продемонстрували, що ультразвукова обробка не посилювала основні побічні реакції та покращувала синтез пептидів, наділених «складними послідовностями», ставлячи синтез пептидів у твердій фазі, стимульований ультразвуком (US-SPPS), серед поточних високоефективних стратегій синтезу пептидів.
Наявність високопродуктивних систем для ультразвукового (сонічного) синтезу пептидів дозволяє значно покращити швидкість синтезу та підвищити чистоту сировинних продуктів. (пор. Wołczański et al., 2019)
Дослідження рацемізації. Порівняння значущих 1H ЯМР спектрів модельних пептидів, синтезованих вручну за допомогою класичного підходу при кімнатній температурі, проти ультразвукового методу при підвищеній температурі. Хімічні зсуви α-протонів His та Cys і метиленової групи Acm (ліві панелі), ɣ-метильних протонів Val (праві панелі) показують, що ультразвукова обробка при 70°C не спричиняє рацемізації.
(Дослідження та аналіз: Wołczański et al., 2019)
Ультразвукове відщеплення пептидів
Після синтезу пептидів у твердій фазі (SPPS) синтезовані пептиди повинні бути відщеплені від полімерних смол. Цей етап також відомий як депротекція. При порівнянні звичайного струшування та ультразвукової обробки для відщеплення пептидів від смоли, метод струшування вимагає приблизно 1 годину, тоді як ультразвукове відщеплення можна виконати за 15–20 хв. Ультразвукове відщеплення пептидів можна застосовувати для відщеплення захищених амінокислот та пептидів, пов’язаних з полістирольними смолами через бензилові естерні зв’язки.
Ультразвукове відщеплення пептидів від полістирольної смоли дає високі виходи пептидів у високій чистоті, без рацемізації, протягом швидкої процедури.
(дослідження та графіка: ©Anuradha and Ravindranath, 1995)
Реактор з ультразвуковим перемішуванням для покращеного та прискореного синтезу пептидів. На фото зображено ультразвуковий гомогенізатор UP200St у скляному реакторі з перемішуванням.
Високопродуктивні ультразвукові гомогенізатори для синтезу пептидів
Hielscher Ultrasonics пропонує різноманітні ультразвукові рішення для прямої та непрямої ультразвукової обробки. Потужні та точно керовані ультразвукові процесори подають саме потрібну кількість ультразвукової енергії в реакційну посудину. Незалежно від того, чи використовуєте ви шприци, пробірки, мікропланшети або скляні реактори як посудини для синтезу, Hielscher Ultrasonics пропонує найбільш підходящий ультразвуковий обробник для вашого пептидного застосування.
- індивідуальних пептидів
- виробництва пептидів у великих масштабах
- бібліотек пептидів
Багато синтезів пептидів проводять у шприцах (наприклад, у шприцевих реакторах з фільтром). Ультразвуковий агітатор для шприців Hielscher здійснює ультразвукову обробку пептидного розчину, передаючи ультразвукові хвилі через стінку шприця в рідину. Ультразвуковий агітатор для шприців є одним із найпопулярніших ультразвукових рішень для синтезу пептидів за допомогою ультразвуку.
Ультразвуковий купхорн є відповідним інструментом для ультразвукової обробки до 5 реакційних посудин, тоді як VialTweeter може утримувати до десяти реакційних пробірок, а також додатково п’ять більших посудин за допомогою аксесуара для кріплення.
Для інших типів реакторів, таких як твердофазні реактори Merrifield або Kamysz, а також інші поліпропіленові або боросилікатні посудини та реактори, Hielscher пропонує ультразвукові обробники для непрямої та прямої ультразвукової обробки з індивідуальним кріпленням або фланцем.
Звісно, більші скляні реактори з перемішуванням, наприклад, для синтезу в розчині, можна легко обладнати ультразвуковими зондами (також відомими як сонотроди або ультразвукові рупори) будь-якого розміру.
- різноманітні типи ультразвукових обробників
- пряма та непряма ультразвукова обробка
- точне керування інтенсивністю
- точне керування температурою
- безперервний або імпульсний ультразвук
- розумні функції, програмовані пристрої
- доступні для будь-якого об’єму
- лінійна масштабованість
Для твердофазного синтезу пептидів у мікропланшетах/планшетах для мікротитрування UIP400MTP є ідеальним пристроєм. Ультразвукова кавітація опосередковано та однорідно передається в численні комірки для зразків для покращеного масопереносу та реакції синтезу. Перегляньте відео нижче, щоб побачити ультразвуковий обробник для мікропланшетів UIP400MTP у дії!
Зв’яжіться з нами! / Запитайте нас!
Hielscher Ultrasonics виробляє високоефективні ультразвукові гомогенізатори для застосувань у змішуванні, диспергуванні, емульгуванні та екстракції в лабораторному, пілотному та промисловому масштабах.
Факти, які варто знати про ультразвуковий синтез пептидів
Що таке пептиди?
Пептиди – це сполуки, в яких кілька амінокислот з’єднані через амідні зв’язки, так звані пептидні зв’язки. Коли вони зв’язані в складні структури – зазвичай що складаються з 50 або більше амінокислот –, ці великі пептидні структури називаються білками. Пептиди є важливим будівельним блоком життя та виконують численні функції в організмі.
Як працює синтез пептидів?
В органічній хімії, молекулярній біології та науках про життя синтез пептидів – це процес виробництва пептидів. Пептиди синтезуються хімічно через реакцію конденсації карбоксильної групи однієї амінокислоти з аміногрупою іншої амінокислоти. Стратегії захисних груп (також протективних груп) зазвичай використовуються для уникнення небажаних побічних реакцій з різними бічними ланцюгами амінокислот.
Хімічний (in-vitro) синтез пептидів найчастіше починається з приєднання карбоксильної групи вхідної амінокислоти (C-кінець) до N-кінця зростаючого пептидного ланцюга. На відміну від цього синтезу C-to-N, природний біосинтез білків довгих пептидів у живих організмах відбувається у протилежному напрямку. Це означає, що в біосинтезі N-кінець вхідної амінокислоти з’єднується з C-кінцем білкового ланцюга (N-to-C).
Більшість протоколів досліджень і розробок для синтезу пептидів базуються на твердофазних методах, тоді як методи синтезу в розчині можна знайти у великомасштабному промисловому виробництві пептидів.
Який сучасний стан мистецтва в синтезі пептидів?
SUS-SPPS (сталий синтез пептидів на твердій фазі за допомогою ультразвуку) доведено, що це скорочує процес до лише двох етапів за цикл (комбіноване сполучання/капування/дезахист + одне промивання), значно зменшуючи споживання розчинника та час. (пор. Mottola et al., 2025)
Ультразвукове TAPS є перспективним поєднанням, яке продемонструвало успіх у повних синтезах (наприклад, ліпобактин) і досліджується CDMO для виробництва АФІ.
Дізнайтеся про переваги ультразвуково-асистованого синтезу пептидів TAGGING!
Безперервна обробка досліджується як подальше вдосконалення – описано платформи безперервного одногорлового синтезу з силілізованим тегом.
Галузь рухається до принципів зеленої хімії, причому ультразвук і TAPS сприяють зменшенню використання розчинників, зниженню завантаження реагентів та підвищенню екологічної сталості.
Література / Посилання
- Merlino, F., Tomassi, S., Yousif, A. M., Messere, A., Marinelli, L., Grieco, P., Novellino, E., Cosconati, S., Di Maro, S. (2019): Boosting Fmoc Solid-Phase Peptide Synthesis by Ultrasonication. Organic Letters, 21(16), 2019. 6378–6382.
- Andrew M. Bray; Liana M. Lagniton; Robert M. Valerio; N.Joe Maeji (1994): Sonication-assisted cleavage of hydrophobic peptides. Application in multipin peptide synthesis. Tetrahedron Letters 35(48), 1994. 9079–9082.
- Silva, R., Franco Machado, J., Gonçalves, K., Lucas, F. M., Batista, S., Melo, R., Morais, T. S., & Correia, J. (2021): Ultrasonication Improves Solid Phase Synthesis of Peptides Specific for Fibroblast Growth Factor Receptor and for the Protein-Protein Interface RANK-TRAF6. Molecules (Basel, Switzerland), 26(23), 7349.
- Conejos-Sanchez, Inmaculada; Duro Castaño, Aroa; Vicent, María (2014): Peptide-Based Polymer Therapeutics. Polymers. 6. 515-551.
- Raheem, Shvan J; Schmidt, Benjamin W; Solomon, Viswas Raja; Salih, Akam K; Price, Eric W (2020): Ultrasonic-Assisted Solid-Phase Peptide Synthesis of DOTA-TATE and DOTA-linker-TATE Derivatives as a Simple and Low-Cost Method for the Facile Synthesis of Chelator-Peptide Conjugates. ACS Bioconjugate Chemistry, 2020.
- Salvatore Mottola, Alessandra Del Bene, Vincenzo Mazzarella, Roberto Cutolo, Ida Boccino, Francesco Merlino, Sandro Cosconati, Salvatore Di Maro, Anna Messere (2015): Sustainable Ultrasound-Assisted Solid-Phase peptide synthesis (SUS-SPPS): Less Waste, more efficiency. Ultrasonics Sonochemistry, Volume 114, 2025.
- M.V. Anuradha, B. Ravindranath (1995): Ultrasound in peptide synthesis. 4: Rapid cleavage of polymer-bound protected peptides by alkali and alkanolamines. Tetrahedron Volume 51, Issue 19, 1995. 5675-5680.
- Wołczański, G., Płóciennik, H., Lisowski, M., Stefanowicz, P. (2019): The faster peptide synthesis on the solid phase using ultrasonic agitation. Tetrahedron Letters, 2019.
Hielscher Ultrasonics виробляє високопродуктивні ультразвукові гомогенізатори від лабораторного до промислового розміру.