Yüksek Saflaştırılmış Şizofilan Beta-Glukanların Ultrasonik Üretimi

Schizophyallan, immünomodülatör özelliklere sahip bir mantar β-glukandır. Yüksek derecede aktif tıbbi etkiler için, şizofilanın gelişmiş biyoyararlanım gösterebilmesi için düşük bir moleküler ağırlığa sahip olması gerekir. Ultrasonikasyonun şizofilanın moleküler ağırlığını azalttığı kanıtlanmıştır. Güvenilir ve etkili bir yöntem olarak, sonikasyon düşük moleküler ağırlıklı şizofilan üretimi için kolayca uygulanabilir.

Schizophyllum Mantarları ve Ultrasonik Beta-Glukan Ekstraksiyonu

Schizophyllum mantarının türleri, yağışlı mevsimlerden sonra çürüyen ağaçlarda doğada yetişir. Meyve gövdeleri bir sonraki kurak mevsimde toplanır. Schizophyllum türleri, glukanlar gibi biyokimyasal bileşikler açısından zengindir ve bu nedenle özellikle tropikal ülkelerde gıda ve ilaç olarak tüketilmektedir. İmmünomodülatör, antifungal, antineoplastik ve antiviral özellikleri nedeniyle, Splitgill mantarı olarak da bilinen Schizophyllum komünü, biyoteknoloji ve ilaç şirketlerini cezbetmiştir.
Sizofiran, sonifilan veya sizofilan olarak da bilinen polisakkarit şizofil, Schizophyllum mantarlarında bulunan ve oldukça etkili biyoaktif β-glukan şizofilan sunan başlıca β-glukandır.
Schizophyllum komün mantarları doğada ağaçlarda yetişir, miselyum ayrıca fermantasyon suyunda da kültürlenebilir. Farmasötik ve kozmetik uygulamalar için, düşük moleküler ağırlıklı şizofilan, yüksek moleküler ağırlıklı şizofilandan çok daha etkilidir. Bunun nedeni, düşük moleküler ağırlıklı şizofilenin önemli ölçüde daha iyi biyoyararlanım ve emilim oranları göstermesidir. Ek olarak, yüksek moleküler ağırlıklı şizofil, sulu çözeltilerinin yüksek viskozitesine neden olduğu için uygulamalarda genellikle sorunludur.
Ultrasonik boyut küçültme, şizofilanın moleküler ağırlığını düşürmek için oldukça etkili ve güvenilir bir tekniktir, böylece β-glukan molekülünün kalitesini arttırır.

Düşük Molekül Ağırlıklı Şizofil Üretimi için Protokol

Moleküler ağırlıklı şizofilan büyük ölçüde daha iyi biyoyararlanım ve uygulama özellikleri gösterdiğinden, Smirnou araştırma ekibi, β-glukan molekülü şizofilanın bölünmesi ve boyutunun küçültülmesi için ultrasonikasyonu araştırdı.

Schizophyllan'ın ultrasonikasyonu

β-1.3 (1.6) -Glukan şizofil (SPG), substrat olarak sükroz kullanılarak biyoreaktörde S. komün mantarının daldırılmış yetiştiriciliği ile üretildi.
Yetiştiriciliğin sona ermesinden sonra, kültür suyu demineralize su ile şizofilan konsantrasyonu 2 g / L'ye seyreltildi ve ultrasonik işlemci UIP2000hdT (Hielscher Ultrasonics GmbH, Almanya) aşağıdaki parametrelerde ve koşullarda geri dönüşüm modunda: orta akış 50 mL / s, frekans 20 kHz, çıkış 2000 W, sonotrot tipi BS2d22, güçlendirici tip B2-1.4 ve genlik% 100. Sonikasyonun başlangıcında kültür suyu sıcaklığı 25 ° C idi. Ultrasonik kültür suyu (özgül enerji girişi 100 Ws / mL), 40 ° C'de 1.5 bar basınç altında Seitz HS800 derinlik filtresinden süzüldü. Kimyasal karakterizasyon için ultrasonik şizofilan (uSPG), laboratuvar sıcaklığında üç kat izopropil alkol ile süzüntüden çökeltildi ve immünolojik çalışmalar için 12 saat uSPG çözeltileri için 60 ° C'de kurutuldu aşağıdaki gibi hazırlandı: (1) ultrasoniklenmiş kültür suyu süzüntüsü, 0.8 bar'da 0.1m2 Pall Centramate T-serisi PES kaseti (100 kDa kesme) yoluyla diyafiltrasyon edildi ve diyafiltrasyon, retentat iletkenliği 20 μS / cm olana kadar devam etti; (2) çözelti, diyafiltrasyon yoluyla uSPG konsantrasyonu 1 g / L'ye konsantre edildi ve 120 ° C / 20 dakikada otoklavlama ile sterilize edildi. Denatüre uSPG, NaOH'nin kültür suyu süzüntüsüne 0.2 M konsantrasyonda eklenmesi ve alkalize çözeltinin diyafiltrasyondan önce laboratuvar sıcaklığında 30 dakika inkübe edilmesi dışında benzer şekilde hazırlandı.

Analitik yöntemler

Miselyum verimi gravimetrik olarak tahmin edildi: kültür suyu 1:4 su ile seyreltildi, 25°C'de 20 dakika boyunca 10000 × g santrifüjlendi, çökelti üç kat su ile yıkandı, 60°C'de kurutuldu ve ağırlıklandırıldı. Şizofilan, süpernatanttan üç kat miktarda izopropil alkol ile çökeltildi, 60 ° C'de 24 saat kurutuldu ve verimi gravimetrik olarak belirlendi. Kültür suyundaki pO2, optik prob Hamilton-Visiferm DO 120 (Hamilton, İsviçre) ile ölçüldü.
Kültür suyu dinamik viskozitesi, HAAKE Visco Test Cihazı 6L'de 1L ve 2L iğlerle 4°C'de ve 30 rpm dönüş hızında ölçülmüştür. Filtrasyon hızı, 500 mL kültür suyunun 200 × 200 mm Seitz HS800 (Pall, ABD) derinlik filtresinden 1.5 bar basınç ve 40°C'de filtrasyon süresinden hesaplanmıştır.
uSPG moleküler ağırlığı, seri bağlı PL aquagel OH60 ve PL aquagel OH40 kolonları ile HPLC sistemi Alliance (Waters) üzerinde SEC-MALLS ile ölçüldü ve dedektör miniDAWN TREOS (Wyatt), diyafiltrasyon ile uSPG konsantrasyonu 1 g/L'ye konsantre edildi ve 120 ° C / 20 dakikada otoklavlama ile sterilize edildi. Denatüre uSPG, NaOH'nin kültür suyu süzüntüsüne 0.2 M konsantrasyonda eklenmesi ve alkalize çözeltinin diyafiltrasyondan önce laboratuvar sıcaklığında 30 dakika inkübe edilmesi dışında benzer şekilde hazırlandı.

AFM görüntüleme (üstte) ve doğal ultrasoniklenmiş şizofilanın topografik profili (altta). 512 × 512 pxs2 çözünürlüğü ile yarı temas modunda ölçüm. Koşullar: altın kaplama, yay sabiti 15,3 N/m, uç koni açısı <22°.r/>(picture and study: ©Smirnou et al., 2017)

 
Azaltılmış Viskozite: Ultrasonikasyon, kültür suyu viskozitesinde önemli bir azalmaya neden oldu. Ultrasonication sırasında, kültür suyu viskozitesi doğrusal olmayan bir şekilde değişti: viskozite düşüşü ultrasonikasyonun başlangıcında hızlıydı, ancak daha sonra yavaşladı. Spesifik enerji girişi 100 Ws/mL, kültür suyu viskozitesini neredeyse 7 kat azaltmak için yeterliydi.

144 saat boyunca biyoreaktörde mantar yetiştiriciliği ile elde edilen S.commune kültür suyunun ultrasonikasyonu. Ultrasonication periyodunun (Ws / mL cinsinden spesifik enerji girişi olarak ifade edilir) kültür suyu derinlik filtrasyonunun hızı (siyah sütun) ve filtrattaki şizofil (SPG) konsantrasyonunun (gri sütun) etkisi. Ultrasonication koşulları: Ultrasonik işlemci UIP2000hd (20 kHz, 2000W), sonotrot BS2d22, güçlendirici B2-1.4, genlik 0, akış hızı 50 mL/s.
(resim ve çalışma: ©Smirnou ve ark., 2017)

Geliştirilmiş Filtreleme: Ultrason ile muamele edilmiş kültür suyu, yüksek moleküler SPG'li muamele edilmemiş kültür suyundan (özgül enerji girişi 0 Ws/mL) daha hızlı filtreden aktı. Ayrıca, ultrasonikasyon filtrasyon sırasında ürün kaybını önemli ölçüde azalttı. Yüksek moleküler SPG (özgül enerji girdisi 0 Ws/mL) ile işlenmemiş kültür suyunun süzüntüsü 0,3 ± 0,07 g/L SPG içerirken, derinlik filtrasyonundan önceki SPG konsantrasyonu 2 g/L idi. Buna karşılık, 100 Ws / mL ultrasonik kültürün süzüntüsünün her ikisi de 2.2 ± 0.2 g / L konsantrasyonda SPG içeriyordu, bu da neredeyse sıfır ürün kaybına karşılık geliyor.

144 saat boyunca biyoreaktörde mantar yetiştiriciliği ile elde edilen S.commune kültür suyunun ultrasonikasyonu. Ultrasonication periyodunun (Ws / mL cinsinden spesifik enerji girişi olarak ifade edilir) kültür suyu derinlik filtrasyonunun hızı (siyah sütun) ve filtrattaki şizofil (SPG) konsantrasyonunun (gri sütun) etkisi. Ultrasonication koşulları: Ultrasonik işlemci UIP2000hd (20 kHz, 2000W), sonotrot BS2d22, güçlendirici B2-1.4, genlik 0, akış hızı 50 mL/s.
(resim ve çalışma: ©Smirnou ve ark., 2017)

 
Mantar ekstraksiyonunun basit ölçek büyütmesi hakkında daha fazla bilgi edinin!
 

Mantar Glukan İşleme için Yüksek Performanslı Ultrasonik Ekipman

Glukanlar gibi polisakkaritlerin yanı sıra kitin ve kitosan gibi diğer biyoaktif bileşiklerin parçalanması, Hielscher yüksek performanslı ultrasonik ekipmanla güvenilir bir şekilde işlenebilir. Ultrasonicator'larımız yüksek genlikler sağlayabilir, proses parametreleri üzerinde hassas kontrol edilebilirlik sunar ve ağır yük altında ve zorlu ortamlarda 7/24 çalıştırılabilir. Hielscher Ultrasonik ekipman yelpazesi bu gereksinimleri güvenilir bir şekilde yerine getirir. Olağanüstü ultrason performansının yanı sıra, Hielscher ultrasonicators önemli bir ekonomik avantaj olan yüksek enerji verimliliğine sahiptir – özellikle ticari büyük ölçekli üretimde kullanıldığında.
Hielscher Ultrasonicators, proses ihtiyaçlarınızı en iyi şekilde karşılamak için sonotrodlar, güçlendiriciler, reaktörler veya akış hücreleri gibi aksesuarlarla donatılabilen yüksek performanslı sistemlerdir. Dijital renkli ekran ile, sonikasyon çalışmalarını önceden ayarlama seçeneği, entegre bir SD karta otomatik veri kaydı, uzaktan tarayıcı kontrolü ve daha birçok özellik, en yüksek işlem kontrolü ve kullanım kolaylığı sağlanır. Sağlamlık ve ağır yük taşıma kapasitesi ile eşleştirildiğinde, Hielscher ultrasonik sistemler üretimde güvenilir iş gücünüzdür. Şizofilan gibi β-glukanların moleküler ağırlığının azaltılması, hedeflenen bölünmeyi elde etmek için güçlü ultrason ve farmasötik uygulamalar için kullanılabilecek yüksek kaliteli nihai bir şizofil ürünü gerektirir.
 
Adım adım talimatlar da dahil olmak üzere mantarlardan ultrasonik beta-glukan ekstraksiyonu hakkında daha fazla bilgiyi burada bulabilirsiniz!
 
Aşağıdaki tablo size ultrasonicators'ımızın yaklaşık işleme kapasitesinin bir göstergesini verir: