Yüksek Derecede Saflaştırılmış Schizophyllan Beta-Glukanların Ultrasonik Üretimi

Schizophyllan, immünomodülatör özelliklere sahip bir fungal β-glukandır. Yüksek düzeyde etkin tıbbi etkiler için schizophyllanın, daha iyi biyoyararlanım göstermesi amacıyla düşük moleküler ağırlığa sahip olması gerekir. Ultrasonikasyonun schizophyllanın moleküler ağırlığını azalttığı kanıtlanmıştır. Güvenilir ve etkili bir yöntem olan sonikasyon, düşük moleküler ağırlıklı schizophyllan üretimine kolaylıkla uygulanabilir.

Schizophyllum Mantarları ve Ultrasonik Beta-Glukan Ekstraksiyonu

Schizophyllum mantarı türleri, doğada yağışlı mevsimlerden sonra çürüyen ağaçlar üzerinde yetişir. Meyve gövdeleri, bunu izleyen kurak mevsimde toplanır. Schizophyllum türleri, glukanlar gibi biyokimyasal bileşikler bakımından zengindir ve bu nedenle özellikle tropikal ülkelerde gıda ve ilaç olarak tüketilir. İmmünomodülatör, antifungal, antineoplastik ve antiviral özellikleri nedeniyle, yarık solungaç mantarı olarak da bilinen Schizophyllum commune, biyoteknoloji ve ilaç şirketlerinin ilgisini çekmiştir.
Sizofiran, sonifilan veya sizofilan olarak da bilinen schizophyllan polisakkaridi, son derece etkili biyoaktif β-glukan schizophyllanı sunan Schizophyllum mantarlarında bulunan başlıca β-glukandır.
Schizophyllum commune mantarları doğada ağaçlar üzerinde yetişir; miselyum, fermantasyon besiyerinde de kültüre alınabilir. Farmasötik ve kozmetik uygulamalar için düşük moleküler ağırlıklı schizophyllan, yüksek moleküler ağırlıklı schizophyllandan çok daha etkilidir. Bunun nedeni, düşük moleküler ağırlıklı schizophyllanın belirgin ölçüde daha iyi biyoyararlanım ve emilim oranları göstermesidir. Ayrıca yüksek moleküler ağırlıklı schizophyllan, sulu çözeltilerinin yüksek viskozitesine yol açtığından uygulamalarda sıklıkla sorun yaratır.
Ultrasonik boyut küçültme, schizophyllanın moleküler ağırlığını düşürmek ve böylece β-glukan molekülünün kalitesini artırmak için son derece etkili ve güvenilir bir tekniktir.

Düşük Moleküler Ağırlıklı Schizophyllan Üretimi İçin Protokol

Moleküler ağırlıklı schizophyllan çok daha iyi biyoyararlanım ve uygulama özellikleri gösterdiğinden, Smirnou’nun araştırma ekibi, β-glukan molekülü schizophyllanın parçalanması ve boyutunun küçültülmesi için ultrasonikasyonu araştırmıştır.

Schizophyllanın Ultrasonikasyonu

β-1.3(1.6)-Glukan schizophyllan (SPG), substrat olarak sakkaroz kullanılarak S. commune mantarının biyoreaktörde sıvı ortamda yetiştirilmesiyle üretilmiştir.
Yetiştirme işlemi sona erdikten sonra kültür sıvısı, schizophyllan konsantrasyonu 2 g/L olacak şekilde demineralize suyla seyreltilmiş ve UIP2000hdT ultrasonik işlemcisi (Hielscher Ultrasonics GmbH, Almanya) ile geri devir modunda, şu parametreler ve koşullar altında ultrasonikasyona tabi tutulmuştur: ortam debisi 50 mL/s, frekans 20 kHz, çıkış gücü 2000 W, sonotrot tipi BS2d22, güçlendirici tipi B2-1.4 ve genlik %100. Sonikasyonun başlangıcında kültür sıvısının sıcaklığı 25°C idi. Ultrasonikasyona tabi tutulmuş kültür sıvısı (özgül enerji girdisi 100 Ws/mL), 40°C sıcaklıkta ve 1,5 bar basınç altında Seitz HS800 derinlik filtresinden geçirilmiştir. Kimyasal karakterizasyon için ultrasonikasyona tabi tutulmuş schizophyllan (uSPG), laboratuvar sıcaklığında üç kat miktarda izopropil alkol kullanılarak filtrattan çöktürülmüş ve 60°C sıcaklıkta 12h boyunca kurutulmuştur. İmmünolojik çalışmalar için uSPG çözeltileri şu şekilde hazırlanmıştır: (1) ultrasonikasyona tabi tutulmuş kültür sıvısının filtratı, 0,8 bar basınçta 0,1m2 Pall Centramate T-series PES kasetinden (100 kDa kesim sınırı) diafiltrasyonla geçirilmiş ve retentat iletkenliği 20 μS/cm olana kadar diafiltrasyona devam edilmiştir; (2) çözelti, uSPG konsantrasyonu 1 g/L olacak şekilde diafiltrasyonla yoğunlaştırılmış ve 120°C/20 min koşullarında otoklavlanarak sterilize edilmiştir. Denatüre uSPG de benzer şekilde hazırlanmış, ancak kültür sıvısının filtratına 0,2 M konsantrasyonda NaOH eklenmiş ve alkalileştirilmiş çözelti, diafiltrasyondan önce laboratuvar sıcaklığında 30 min boyunca inkübe edilmiştir.

Analitik yöntemler

Miselyum verimi gravimetrik olarak tahmin edilmiştir: kültür sıvısı suyla 1:4 oranında seyreltilmiş, 25°C sıcaklıkta 20 min boyunca 10.000 × g ile santrifüjlenmiş, çökelti üç kat miktarda suyla yıkanmış, 60°C sıcaklıkta kurutulmuş ve tartılmıştır. Schizophyllan, süpernatanttan üç kat miktarda izopropil alkol kullanılarak çöktürülmüş, 60°C sıcaklıkta 24h boyunca kurutulmuş ve verimi gravimetrik olarak belirlenmiştir. Kültür sıvısındaki pO2, Hamilton-Visiferm DO 120 optik probuyla (Hamilton, İsviçre) ölçülmüştür.
Kültür sıvısının dinamik viskozitesi, HAAKE Visco Tester 6L cihazında 1L ve 2L milleriyle, 4°C sıcaklıkta ve 30 rpm dönme hızında ölçülmüştür. Filtrasyon hızı, 500 mL kültür sıvısının 1,5 bar basınçta ve 40°C sıcaklıkta 200 × 200 mm Seitz HS800 (Pall, ABD) derinlik filtresinden geçiş süresinden hesaplanmıştır.
uSPG moleküler ağırlığı, seri bağlanmış PL aquagel OH60 ve PL aquagel OH40 kolonları bulunan Alliance (Waters) HPLC sisteminde SEC-MALLS ile ölçülmüş ve miniDAWN TREOS (Wyatt) dedektörü, uSPG konsantrasyonu 1 g/L olacak şekilde diafiltrasyonla yoğunlaştırılmış ve 120°C/20 min koşullarında otoklavlanarak sterilize edilmiştir. Denatüre uSPG de benzer şekilde hazırlanmış, ancak kültür sıvısının filtratına 0,2 M konsantrasyonda NaOH eklenmiş ve alkalileştirilmiş çözelti, diafiltrasyondan önce laboratuvar sıcaklığında 30 min boyunca inkübe edilmiştir.

Sonuçlar:
Ultrasonikasyon işlemi, SPG’nin sonraki işlemlerini kolaylaştırmak için miselyum içeren 144 saatlik S. commune kültür sıvısına doğrudan uygulanmıştır.
 
Sonikasyona Tabi Tutulmuş Schizophyllanın Özellikleri: Ultrasonikasyona tabi tutulmuş schizophyllan (uSPG), kültür sıvısının filtratından alkolle çöktürülmüş ve karakterize edilmiştir. SEC-MALLS, uSPG’nin Mw değerini yaklaşık 1 MDa olarak tahmin etmiştir. Sıvı fermantasyondan elde edilen schizophyllanın ortalama moleküler ağırlığı yaklaşık 5 MDa iken, katı ortamda yetiştirmede 10 MDa değerine kadar ulaşabilir. Ultrasonikasyona tabi tutulmuş schizophyllanın moleküler ağırlığı, işlem görmemiş doğal schizophyllanın moleküler ağırlıklarıyla karşılaştırıldığında, ultrasonikasyon nedeniyle moleküler ağırlıkta 5–10 katlık bir azalma gözlemlenebilir.
Sonikasyona tabi tutulmuş uSPG polisakkaridi, 0,7%w/w protein ve yakma sonrasında 1,0%w/w kalıntı içermiştir. uSPG hidrolizatının %99’dan fazlası glukozdan oluşmuştur. Analitik sonuçlar, sonikasyonun β-glukan omurgasını rastgele parçaladığını ve yan dalların sağlam kaldığını, böylece schizophyllanın boyutunun ve moleküler ağırlığının azaldığını göstermektedir. Esasen protein ve endotoksin içermeyen uSPG üzerinde yapılan immünolojik çalışmalar, ultrasonikasyona tabi tutulmuş düşük Mw değerli schizophyllanın belirgin immünomodülatör aktiviteye sahip olduğunu göstermiştir.

 
Azaltılmış Viskozite: Ultrasonikasyon, kültür sıvısının viskozitesinde önemli bir azalmaya yol açmıştır. Ultrasonikasyon sırasında kültür sıvısının viskozitesi doğrusal olmayan şekilde değişmiştir: viskozitedeki azalma ultrasonikasyonun başlangıcında hızlı olmuş, ancak daha sonra yavaşlamıştır. 100 Ws/mL özgül enerji girdisi, kültür sıvısının viskozitesini yaklaşık 7 kat azaltmak için yeterli olmuştur.

İyileştirilmiş Filtrasyon: Ultrasonla işlem görmüş kültür sıvısı, yüksek moleküler ağırlıklı SPG içeren işlem görmemiş kültür sıvısından (özgül enerji girdisi 0 Ws/mL) daha hızlı biçimde filtreden geçmiştir. Ayrıca ultrasonikasyon, filtrasyon sırasında ürün kaybını önemli ölçüde azaltmıştır. Yüksek moleküler ağırlıklı SPG içeren işlem görmemiş kültür sıvısının filtratı (özgül enerji girdisi 0 Ws/mL), 0,3 ± 0,07 g/L SPG içerirken, derinlik filtrasyonundan önce SPG konsantrasyonu 2 g/L idi. Buna karşılık, 100 Ws/mL enerji girdisiyle ultrasonikasyona tabi tutulmuş kültür sıvısının filtratı, 2,2 ± 0,2 g/L konsantrasyonda SPG içermiştir; bu, neredeyse sıfır ürün kaybına karşılık gelmektedir.

Sonuç: Araştırma ekibi, sonuç bölümünde ultrasonik işlemenin, daha sonra kozmetik ve tıpta kullanılabilecek düşük moleküler ağırlıklı schizophyllan üretimi için verimli bir teknoloji olduğunu özetlemektedir. Ultrasonikasyon, miselyum içeren kültür sıvısının tamamına uygulandığında schizophyllan üretimine belirli avantajlar getirir. Sonraki işlemler sırasında ürün kayıplarını azaltır ve ultrafiltrasyonun verimli kullanımı sayesinde yüksek derecede saflaştırılmış polisakkarit üretimini mümkün kılar.
Ayrıca araştırmacılar, schizophyllanın ultrasonik işlenmesinin kolaylıkla ölçeklendirilebildiğini bulmuştur. Pilot tesis tipi UIP2000hdT ultrasonik parçalayıcısının bir ünitesi, akış modunda 1 litre kültür sıvısını 110 s içinde işlemiştir. Sistemin üretkenliği, ek ultrason ünitelerinin seri bağlanmasıyla kolaylıkla artırılabilir.

 
Mantar ekstraksiyonunun kolay ölçek büyütmesi hakkında daha fazla bilgi edinin!
 

Fungal Glukan İşleme İçin Yüksek Performanslı Ultrasonik Ekipman

Glukanlar gibi polisakkaritlerin yanı sıra kitin ve kitosan gibi diğer biyoaktif bileşiklerin parçalanması, Hielscher yüksek performanslı ultrasonik ekipmanlarıyla güvenilir biçimde gerçekleştirilebilir. Sonikatörlerimiz yüksek genlikler sağlayabilir, proses parametreleri üzerinde hassas kontrol sunar ve ağır yük altında, zorlu ortamlarda 24/7 çalıştırılabilir. Hielscher Ultrasonics ekipman yelpazesi bu gereksinimleri güvenilir biçimde karşılar. Üstün ultrason performansının yanı sıra Hielscher sonikatörleri yüksek enerji verimliliklerine sahiptir; bu, özellikle ticari büyük ölçekli üretimde kullanıldıklarında önemli bir ekonomik avantajdır.
Hielscher sonikatörleri, proses ihtiyaçlarınızı en uygun şekilde karşılamak için sonotrotlar, güçlendiriciler, reaktörler veya akış hücreleri gibi aksesuarlarla donatılabilen yüksek performanslı sistemlerdir.
Dijital renkli ekran, sonikasyon işlemlerini önceden ayarlama seçeneği, entegre SD karta otomatik veri kaydı, tarayıcı üzerinden uzaktan kontrol ve daha birçok özellik sayesinde en yüksek proses kontrolü ve kullanıcı dostu kullanım sağlanır. Sağlamlık ve ağır yük taşıma kapasitesiyle birleşen Hielscher ultrasonik sistemleri, üretimde güvenilir iş gücünüzdür.
Schizophyllan gibi β-glukanların moleküler ağırlığının azaltılması, hedeflenen parçalanmayı ve farmasötik uygulamalarda kullanılabilecek yüksek kaliteli bir nihai schizophyllan ürününü elde etmek için güçlü ultrason gerektirir.
 
Adım adım talimatlar da dahil olmak üzere mantarlardan ultrasonik beta-glukan ekstraksiyonu hakkında daha fazla bilgiyi burada bulabilirsiniz!
 
Aşağıdaki tablo, sonikatörlerimizin yaklaşık işleme kapasitesi hakkında fikir verir: