Ultrasonik Yöntemlerle Bitki Hücrelerinde Genetik Transformasyon

Sonikasyon Destekli Agrobacterium Aracılı Transformasyon (SAAT), taşıyıcı olarak Agrobacterium kullanarak bitki hücrelerini yabancı genlerle enfekte etmek için etkili bir yöntemdir. Ultrasonik kavitasyon, bitki dokusunda hedefli mikro yaralar oluşturulması olarak tanımlanabilecek sonoporasyona neden olur. Ultrasonik olarak oluşturulan bu mikro yaralar aracılığıyla DNA ve DNA vektörleri hücre matrisine etkili bir şekilde taşınabilir.

Sonoporasyon – Ultrasonik Olarak Geliştirilmiş Hücre Transformasyonu

Hücre süspansiyonlarına düşük frekanslı ultrason (yaklaşık 20kHz) uygulandığında, akustik kavitasyonun etkileri hücre dokularındaki zarların geçici olarak geçirgenleşmesine neden olur. Bu ultrasonik etki sonoporasyon olarak bilinir ve hücrelere veya dokulara gen aktarımı için kullanılır.
Ultrasonik işlemin avantajları, sonikasyonu çoğu zaman daha çok yönlü ve hücre tiplerine daha az bağımlı kılan, termal olmayan mekanik çalışma prensibine dayanır. Sonoporasyonun çok yönlü uygulamaları, karmaşık insan terapötik proteinlerinin biyolojik üretiminde önemli bir potansiyele sahip olan transgenik bitkilerin kullanımına olanak tanır. Bu tür bitki temelli biyoreaktörler genetik olarak kolayca değiştirilebilir, insan patojenleriyle olası kontaminasyonu önler, transformasyona aracılık eden bakterilere (ör. Agrobacterium) zarar vermez ve ucuz, etkili bir biyosentez yöntemidir.

Ultrason Destekli Hücre Transformasyonu

Sonikasyon, çözeltideki parçacıkları hareketlendirmek ve çözeltileri karıştırmak için düşük frekanslı ultrason dalgaları uygulayan, böylece kütle aktarımı ve çözünme hızını artıran bir tekniktir. Aynı zamanda sonikasyon, sıvılardaki çözünmüş gazları uzaklaştırabilir. Bitki transformasyonunda sonikasyon, bitki dokusunda mikro yaraların oluşmasına neden olur ve çıplak DNA’nın bitki protoplastına aktarımını artırır.

Genetik transformasyon için Sonikasyon Destekli Agrobacterium Aracılı Transformasyon (SAAT) tercih edilen yöntemdir ve çıplak DNA ile DNA vektörlerini doğrudan protoplasta aktarmak için kullanılan sonikasyondan önemli ölçüde daha yüksek verimliliğe sahiptir. Çok sayıda çalışma, sonikasyon destekli Agrobacterium aracılı transformasyonun (SAAT), ultrason dalgaları ve bunların sonucunda oluşan akustik kavitasyon yoluyla bitki hücrelerinde mekanik parçalanma ve yara oluşumunu tetiklemek için kullanılabileceğini göstermiştir. Kısa bir ultrasonik işlem, eksplantların yüzeyinde mikro yaralar oluşturur. Yaralanmış hücreler, Agrobacterium’un bitki dokularının daha derin kısımlarına nüfuz etmesine olanak tanıyarak bitki hücrelerinin enfekte olma olasılığını artırır. Ayrıca salgılanan fenolik bileşikler transformasyonu artırır. Ultrasonik olarak oluşturulan mikro yaralar, bakterilerin eksplantlara nüfuz etmesini de daha mümkün kılar. SAAT, özellikle Agrobacterium’a dirençli olduğu düşünülen bitki türlerinde genetik transformasyon için başarıyla kullanılmıştır.
Çok basit ve ucuz bir yöntem olması ve Agrobacterium aracılı gen aktarımını önemli ölçüde artırması, SAAT yönteminin başlıca avantajlarıdır. SAAT yönteminin Chenopodium rubrum L. ve Beta vulgaris L. transformasyonunda başarıyla uygulanmasının yanı sıra, bu yaklaşım Nicotiana tabacum’da rekombinant Escherichia coli yabani tip ısıya duyarlı holotoksin ve Escherichia coli mutant LT aşı adjuvanlarının üretiminde de uygulanmış; bu çalışmalarda kuşlarda en yüksek sistemik LT-B’ye özgü IgG titreleri saptanmıştır.
(bkz. Laere et al., 2016; M. Klimek-Chodacka ve R. Baranski, 2014)

Bitki Hücrelerinde Sonoporasyon Yoluyla Gen Aktarımı İçin Genel Prosedür

1. Genetik Materyalin Hazırlanması: Bitki hücrelerine aktarmak istediğiniz genetik materyali hazırlayarak başlayın. Bu materyal plazmit DNA, RNA veya diğer nükleik asitler olabilir.
2. Bitki Hücrelerinin İzolasyonu: Hedeflemek istediğiniz bitki hücrelerini izole edin. Deneyinize bağlı olarak bu hücreler bitki dokularından veya kültürlerinden izole edilebilir.
3. Hücre Süspansiyonu: Bitki hücrelerini uygun bir besiyerinde veya tamponda süspanse edin. Bu, hücrelerin sağlıklı ve gen alımına elverişli bir durumda olmasını sağlamak için gereklidir.
4. Sonikatörünüzün Kurulumu: Genlik, süre, enerji ve sıcaklık gibi sonikasyon parametrelerini önceden ayarlayarak prob tipi sonikatörünüzü hazırlayın. Ultrasonik probu hücre süspansiyonuna daldırın.
5. Sonikasyon: Sonikasyon prosedürünü başlatın. Prob ucunun hızlı salınımı sıvıda kavitasyon kabarcıkları oluşturur. Bu kabarcıklar ultrason dalgalarının etkisiyle genişler ve çöker; süspansiyonda mekanik kuvvetler ve mikro akımlar oluşturur.
6. Sonoporasyon: Kavitasyonun oluşturduğu mekanik kuvvetler ve mikro akımlar, bitki hücrelerinin zarlarında geçici gözenekler ve delikler oluşturur. Süspansiyonda bulunan genetik materyal, bu gözeneklerden bitki hücrelerine girebilir.
7. İnkübasyon: Sonoporasyon işleminden sonra bitki hücrelerinin toparlanmasına ve zarlarını stabilize etmesine olanak tanımak için hücreleri inkübe edin. Bu, hücrelerin hayatta kalmasını ve başarılı gen aktarımını sağlamak için kritik bir adımdır.

Agrobacterium veya Lipozomlar Yoluyla Gen Aktarımı

Bitki hücrelerini transfekte etmek için yaygın olarak kullanılan iki yöntem vardır. Bu yöntemlerde genetik materyalin taşıyıcısı olarak ya Gram-negatif bir bakteri cinsi olan Agrobacterium ya da lipozomlar kullanılır.

• Agrobacterium Aracılı Sonoporasyon: Agrobacterium tumefaciens, bitki genetik mühendisliğinde yaygın olarak kullanılan bir bakteridir. Bu yöntemde, istenen geni içeren plazmit DNA Agrobacterium’a aktarılır ve ardından Agrobacterium bitki hücreleriyle karıştırılır. Hücre süspansiyonu, prob tipi bir sonikatör kullanılarak sonoporasyona tabi tutulur. Ultrasonik enerji, genetik materyalin Agrobacterium’dan bitki hücrelerine aktarımını artırır. Bu yöntem, bitkilerin genetik modifikasyonu için yaygın olarak kullanılır.
• Lipozom Aracılı Sonoporasyon: Lipozomlar, genetik materyal taşıyabilen lipit temelli veziküllerdir. Bu yöntemde, plazmit DNA veya diğer nükleik asitlerle yüklenmiş lipozomlar bitki hücreleriyle karıştırılır. Lipozomların bitki hücreleri tarafından alınmasını kolaylaştırmak için prob tipi bir sonikatörle sonoporasyon uygulanır. Ultrason, lipozomların lipit çift tabakalarını parçalayarak genetik materyali bitki hücrelerinin içine serbest bırakır. Bu yaklaşım, bitki hücrelerinde geçici gen ekspresyonu çalışmaları için yararlıdır.

Sonikasyon Destekli Agrobacterium Aracılı Transformasyonun (SAAT) Bilimsel Olarak Kanıtlanmış Faydaları

Sonikasyon Destekli Agrobacterium Aracılı Transformasyon (SAAT), çok sayıda bitki türüne uygulanmıştır. Bitki hücre kültürlerine uygulanan kısa ve nispeten hafif bir ultrasonik işlem sonoporasyona neden olur; bu da gen taşıyıcısı olarak Agrobacterium’un derinlere nüfuz etmesine olanak tanır. Aşağıda SAAT yönteminin faydalı etkilerini gösteren örnek çalışmaları okuyabilirsiniz.

Ashwagandha Bitkisinin Ultrason Destekli Transformasyonu

Dehdashti ve çalışma arkadaşları (2016), W. somnifera (ashwagandha veya kış kirazı olarak bilinir) bitkisinde transformasyon verimliliğini artırmak amacıyla asetosiringon (AS) ve sonikasyon kullanımını araştırmıştır.
Asetosiringon (AS) üç aşamada eklenmiştir: Agrobacterium sıvı kültürü, Agrobacterium enfeksiyonu ve eksplantların Agrobacterium ile birlikte kültürü. Agrobacterium sıvı kültürüne 75 μM AS eklenmesinin vir genlerinin indüksiyonu için optimum olduğu bulunmuştur.
Sonikasyonun (SAAT) ek olarak uygulanması, en yüksek gen ekspresyonuyla sonuçlanmıştır. Yapraklar ve sürgün uçları sırasıyla 10 ve 20s boyunca sonikasyona tabi tutulduğunda, saçak köklerdeki gusA gen ekspresyonunun en iyi düzeyde olduğu bulunmuştur. Geliştirilmiş protokolün transformasyon verimliliği, yaprak ve sürgün ucu eksplantları için sırasıyla 66,5 ve %59,5 olarak kaydedilmiştir. Diğer protokollerle karşılaştırıldığında, geliştirilmiş bu protokolün transformasyon verimliliğinin yapraklar için 2,5 kat, sürgün uçları için ise 3,7 kat daha yüksek olduğu bulunmuştur. Southern blot analizleri W1–W4 hatlarında gusA transgeninin 1–2 kopyasını doğrularken, geliştirilmiş protokolle oluşturulan W5 hattında 1–4 transgen kopyası saptanmıştır.

Sonikasyon destekli Agrobacterium aracılı transformasyon (SAAT) süresinin W. somnifera yaprak (a) ve sürgün ucu (b) eksplantlarının transformasyon sıklığı üzerindeki etkisi
(çalışma ve grafik: © Dehdashti et al., 2016)

Pamuğun Ultrason Destekli Transformasyonu

Hussain et al. (2007), sonikasyon destekli pamuk transformasyonunun faydalı etkilerini göstermektedir. Düşük frekanslı ultrasonun neden olduğu akustik kavitasyon, bitki dokusunun yüzeyinde ve yüzeyin altında mikro yaralar oluşturur (sonoporasyon) ve Agrobacterium’un daha derinlere ve bitki dokusunun tamamına ilerlemesine olanak tanır. Bu yaralama biçimi, dokunun daha derinlerinde bulunan bitki hücrelerini enfekte etme olasılığını artırır. SAAT yönteminin transformasyon verimliliğini değerlendirmek için GUS gen ekspresyonu ölçülmüştür. GUS raportör sistemi, özellikle bitki moleküler biyolojisi ve mikrobiyolojisinde yararlı olan bir raportör gen sistemidir. Çeşitli SAAT parametrelerinin ayarlanmasıyla, eksplant olarak olgun embriyoların kullanıldığı pamukta geçici GUS ekspresyonu önemli ölçüde artırılmıştır. GUS ilk olarak eksplantların inkübasyonundan 24h sonra saptanmış ve 48h sonunda GUS ekspresyonu çok yoğun hale gelmiştir; bu, sonikasyon destekli Agrobacterium aracılı transformasyon (SAAT) sonrasında pamuk eksplantının başarılı transformasyonunun yararlı bir göstergesi olmuştur. Çeşitli transformasyon tekniklerinin (biyolistik, Agro, BAAT, SAAT) karşılaştırılmasında, sonikasyon destekli Agrobacterium aracılı transformasyon (SAAT) açık ara en iyi transformasyon sonuçlarını göstermiştir.

Geçici GUS ekspresyonuna dayalı transformasyon prosedürü seçimi. Sonikasyon destekli Agrobacterium aracılı transformasyon (SAAT), önemli ölçüde daha yüksek geçici ekspresyon gösterir.
(çalışma ve grafik: © Hussain et al., 2007)

Sonoporasyon ve SAAT İçin Yüksek Performanslı Ultrasonik Çözümler

Hielscher Ultrasonics, laboratuvarlar, araştırma tesisleri ve çok yüksek işleme kapasitelerine sahip endüstriyel üretim için yüksek performanslı ultrasonik sonikatörlerin geliştirilmesi ve üretiminde uzun yıllara dayanan deneyime sahiptir. Hielscher, mikrobiyoloji ve yaşam bilimleri için belirli dokulara ve bunların işlemlerine yönelik farklı gereksinimleri karşılayan çeşitli çözümler sunar. Çok sayıda numunenin eş zamanlı ultrasonik işlemi için Hielscher, çok kuyucuklu plakalar için UIP400MTP, 10 adede kadar viyalin (ör. Eppendorf tüpleri) sonikasyonu için VialTweeter veya ultrasonik CupHorn sunar. Prob tipi ultrasonik sonikatörler, laboratuvar homojenizatörleri olarak 50–400 watt güç aralığında mevcuttur; endüstriyel sistemler ise 500 watt ile 16kW arasındaki güç aralığını kapsar.
Lütfen bizimle iletişime geçin ve uygulamanız ile proses gereksinimleriniz hakkında bilgi verin. Deneyimli personelimiz, biyolojik prosesiniz için en uygun ultrasonik sonikatörü önermekten memnuniyet duyacaktır.
Aşağıdaki tablo, ultrasonik sonikatörlerimizin yaklaşık işleme kapasitesi hakkında bilgi verir: