Sonication-Assisted Agrobacterium-Mediated Transformation (SAAT), taşıyıcı olarak Agrobacterium'u kullanarak bitki hücrelerini yabancı genlerle enfekte etmek için etkili bir yöntemdir. Ultrasonik kavitasyon, bitki dokusunun hedeflenen mikro yaralanması olarak tanımlanabilecek sonoporasyona neden olur. Bu ultrasonik aracılığıyla mikro yaralar oluşturur, DNA ve DNA vektörleri verimli bir şekilde hücre matrisine taşınabilir.

sonoporasyon – Ultrasonik Geliştirilmiş Hücre Dönüşümü

Hücre süspansiyonlarına düşük frekanslı ultrason (yaklaşık 20kHz) uygulandığında, akustik kavitasyonun etkileri hücre dokuları üzerinde geçici bir membran geçirgenliğine neden olur. Bu ultrasonik etki sonoporasyon olarak bilinir ve hücrelere veya dokulara gen transferi için kullanılır.
Ultrasonikasyonun avantajları, sonikasyonu genellikle daha çok yönlü ve hücre tiplerine daha az bağımlı hale getiren termal olmayan mekanik çalışma prensibine dayanmaktadır. Sonoporasyonun çok yönlü uygulaması, karmaşık insan terapötik proteinlerinin biyoüretiminde önemli potansiyele sahip olan transgenik bitkilerin kullanımına olanak tanır. Bu tür bitki bazlı biyoreaktörler genetik olarak kolayca manipüle edilebilir, insan patojenleri ile potansiyel kontaminasyonu önleyebilir, transformasyona aracılık eden bakterilere (örneğin Agrobacterium) zarar vermez ve ucuz, etkili bir biyosentez yöntemidir.

Ultrasonik Yardımlı Hücre Dönüşümü

Sonikasyon, çözeltideki parçacıkları çalkalamak, çözeltileri karıştırmak, böylece kütle transferi ve çözünme oranını artırmak için düşük frekanslı ultrason dalgaları uygulayan bir tekniktir. Aynı zamanda, sonication çözünmüş gazları sıvılardan çıkarabilir. Bitki dönüşümünde, sonication bitki dokusu üzerinde mikro yaraların oluşumuna neden olacak ve çıplak DNA'nın bitki protoplastına verilmesini artıracaktır.

Genetik dönüşüm için, Sonication Assisted Agrobacterium-aracılı Dönüşüm (SAAT) tercih edilen yöntemdir ve çıplak DNA ve DNA vektörlerini doğrudan protoplasta aktarmak için kullanılan sonikasyondan önemli ölçüde daha yüksek bir verimliliğe sahiptir. Çok sayıda çalışma, sonikasyon destekli Agrobakteri aracılı dönüşümün (SAAT), ultrason dalgaları ve bunun sonucunda ortaya çıkan akustik kavitasyon ile bitki hücrelerinde mekanik bozulma ve yara oluşumunu indüklemek için kullanılabileceğini göstermiştir. Kısa bir ultrasonik işlem, eksplantların yüzeyinde mikro yaralar oluşturur. Yaralı hücreler, Agrobacterium'un bitki dokularının daha derin kısmına nüfuz etmesine izin vereceğinden, böylece bitki hücrelerinin enfekte olma olasılığını artıracaktır. Ek olarak, salgılanan fenolik bileşikler dönüşümü arttırır. Ultrasonik olarak üretilen mikro yaralar, bakteriler tarafından eksplant penetrasyonunu da daha uygulanabilir hale getirir. SAAT, özellikle Agrobacterium'a dirençli olarak kabul edilen bitki türlerinde genetik dönüşüm için başarıyla kullanılmıştır.
Çok basit ve ucuz bir yöntem olmasının yanı sıra Agrobakteri aracılı gen transferinin önemli ölçüde arttırılması, SAAT'in en büyük avantajlarıdır. Bu yaklaşım, Chenopodium rubrum L. ve Beta vulgaris L.'nin dönüşümünde SAAT'in başarılı bir şekilde uygulanmasının yanı sıra, kuşlarda en yüksek sistemik LT-B-spesifik IgG titrelerinin tespit edildiği Nicotiana tabacum'da rekombinant Escherichia coli vahşi tip ısı-labil holotoksin ve Escherichia coli mutant LT aşısı adjuvanlarının üretiminde de uygulanmıştır.
(Bkz. Laere ve ark., 2016; M. Klimek-Chodacka ve R. Baranski, 2014)

Sonication Destekli Agrobacterium-aracılı dönüşümün (SAAT) bilimsel olarak kanıtlanmış faydaları

Sonication-Assisted Agrobacterium-Mediated Transformation (SAAT) çok sayıda bitki türüne uygulanmıştır. Bitki hücre kültürlerinin kısa ve nispeten hafif bir ultrasonik tedavisi, daha sonra gen taşıyıcı olarak Agrobacterium'un derin penetrasyonuna izin veren sonoporasyona neden olur. Aşağıda SAAT'in faydalı etkilerini gösteren örnek çalışmaları okuyabilirsiniz.

Ashwagandha'nın Ultrasonik Destekli Dönüşümü

W. somnifera'daki (ashwagandha veya kış kirazı olarak bilinir) dönüşüm verimliliğini artırmak için Dehdashti ve meslektaşları (2016) asetosyringone (AS) ve sonikasyon kullanımını araştırdılar.
Asetosyringone (AS) üç aşamada eklenmiştir: Agrobacterium sıvı kültürü, Agrobacterium enfeksiyonu ve eksplantların Agrobacterium ile ko-kültürü. Agrobacterium sıvı kültürüne 75 μM AS ilavesinin vir genlerin indüksiyonu için optimum olduğu bulunmuştur.
Sonication (SAAT) ek uygulaması en yüksek gen ekspresyonu ile sonuçlandı. Tüylü köklerdeki gusA gen ekspresyonunun, yapraklar ve sürgün uçları sırasıyla 10 ve 20'li yaşlarda sonikleştirildiğinde en iyisi olduğu bulunmuştur. İyileştirilmiş protokolün dönüşüm verimliliği, yaprak ve sürgün ucu eksplantlarında sırasıyla% 66.5 ve% 59.5 olarak kaydedildi. Diğer protokollerle karşılaştırıldığında, bu geliştirilmiş protokolün dönüşüm verimliliğinin yapraklar için 2,5 kat daha yüksek ve çekim uçları için 3,7 kat daha fazla olduğu bulunmuştur. Güney leke analizleri, W1-W4 hatlarında gusA transgeninin 1-2 kopyasını doğrularken, geliştirilmiş protokol tarafından üretilen W5 hattında 1-4 transgen kopyası tespit edildi.

Sonikasyon destekli Agrobakteri aracılı transformasyon (SAAT) süresinin W. somnifera yaprağı (a) ve sürgün ucu (b) eksplantlarının dönüşüm frekansına etkisi
(çalışma ve grafik: © Dehdashti ve ark., 2016)

Pamuğun Ultrasonik Destekli Dönüşümü

Hussain et al. (2007) sonikasyon destekli pamuk dönüşümünün yararlı etkilerini göstermektedir. Düşük frekanslı ultrasonun neden olduğu akustik kavitasyon, bitki dokusunun yüzeyinde ve altında mikro yaralar oluşturur (sonoporasyon) ve Agrobacterium'un bitki dokusu boyunca daha derin ve tamamen hareket etmesini sağlar. Bu yaralama modası, dokuda daha derinlerde yatan bitki hücrelerini enfekte etme olasılığını arttırır. SAAT'in transformasyon etkinliğini değerlendirmek için GUS gen ekspresyonu ölçüldü. GUS muhabir sistemi, özellikle bitki moleküler biyolojisi ve mikrobiyolojisinde yararlı olan bir muhabir gen sistemidir. Çeşitli SAAT parametrelerinin ayarlanmasıyla, eksplant olarak olgun embriyolar kullanılarak pamukta GUS geçici ekspresyonu önemli ölçüde geliştirilmiştir. GUS ilk olarak eksplantların inkübasyonunu takiben 24 saat tespit edildi ve 48 saat boyunca, GUS ekspresyonu çok yoğundu ve bu da sonikasyon destekli Agrobacterium aracılı dönüşümü (SAAT) takiben pamuk eksplantının başarılı dönüşümünün yararlı bir göstergesi olarak hizmet etti. Çeşitli transformasyon tekniklerinin (yani biyolistik, Agro, BAAT, SAAT), sonikasyon destekli Agrobakteri aracılı dönüşümün (SAAT) karşılaştırılması, dönüşümün en iyi sonuçlarını göstermiştir.

GUS'un geçici ifadesi temelinde transformasyon prosedürünün seçimi. Sonication destekli Agrobacterium-aracılı transformasyon (SAAT) önemli ölçüde daha yüksek bir geçici ifade gösterir.
(çalışma ve grafik: © Hussain ve ark., 2007)

Sonoporasyon ve SAAT için Yüksek Performanslı Ultrasonik Çözümler

Hielscher Ultrasonics, laboratuvarlar, araştırma tesisleri ve çok yüksek verim ile endüstriyel üretim için yüksek performanslı ultrasonicators geliştirme ve üretiminde uzun zamandır deneyimlidir. Mikrobiyoloji ve yaşam bilimleri için, Hielscher belirli dokular ve tedavileri için gerekli farklı gereksinimleri karşılamak için çeşitli çözümler sunmaktadır. Çok sayıda örnek eşzamanlı ultrasonication için Hielscher multiwell plakalar için UIP400MTP, 10 şişe (örneğin, Eppendorf tüpleri) veya ultrasonik CupHorn kadar sonication için VialTweeter sunuyor. Prob tipi ultrasonicators, laboratuvar homojenizatörleri olarak 50 ila 400 watt arasında bulunurken, endüstriyel sistemler 500 watt ila 16kW arasındaki güç aralığını kapsar.
Lütfen bizimle iletişime geçin ve başvuru ve süreç gereksinimleriniz hakkında bize bilgi verin. Deneyimli personelimiz biyolojik süreciniz için en uygun ultrasonicator'ı tavsiye etmekten mutluluk duyacaktır.
Aşağıdaki tablo size bizim ultrasonicators yaklaşık işleme kapasitesinin bir göstergesidir: