Ultrasonik Kullanılarak Bitki Hücrelerinde Genetik Dönüşüm

Sonikasyon Destekli Agrobakteri Aracılı Dönüşüm (SAAT), taşıyıcı olarak Agrobacterium kullanarak bitki hücrelerini yabancı genlerle enfekte etmek için etkili bir yöntemdir. Ultrasonik kavitasyon, bitki dokusunun hedeflenen mikro yaralanması olarak tanımlanabilecek sonoporasyona neden olur. Bu ultrasonik olarak mikro yaralar oluşturur, DNA ve DNA vektörleri hücre matrisine verimli bir şekilde taşınabilir.

sonoporasyon – Ultrasonik Olarak Geliştirilmiş Hücre Dönüşümü

Hücre süspansiyonlarına düşük frekanslı ultrason (yaklaşık 20kHz) uygulandığında, akustik kavitasyonun etkileri hücre dokuları üzerinde geçici bir zar geçirgenliğine neden olur. Bu ultrasonik etki sonoporasyon olarak bilinir ve hücrelere veya dokulara gen transferi için kullanılır.
Ultrasonication avantajları termal olmayan mekanik çalışma prensibine dayanır, bu da sonication genellikle daha çok yönlü ve hücre tiplerine daha az bağımlı hale getirir. Sonoporasyonun çok yönlü uygulaması, karmaşık insan terapötik proteinlerinin biyoüretiminde önemli potansiyele sahip olan transgenik bitkilerin kullanımına olanak sağlar. Bu tür bitki bazlı biyoreaktörler genetik olarak kolayca manipüle edilebilir, insan patojenleri ile potansiyel kontaminasyonu önleyebilir, dönüşüme aracılık eden bakterilere (örneğin Agrobacterium) zarar vermez ve ucuz, etkili bir biyo-sentez yöntemidir.

Ultrasonik Destekli Hücre Dönüşümü

Sonikasyon, çözeltideki parçacıkları çalkalamak, çözeltileri karıştırmak için düşük frekanslı ultrason dalgaları uygulayan, böylece kütle transferi ve çözünme oranını artıran bir tekniktir. Eşzamanlı olarak, sonikasyon sıvılardan çözünmüş gazları çıkarabilir. Bitki dönüşümünde, sonikasyon bitki dokusunda mikro yaraların oluşumuna neden olacak ve çıplak DNA'nın bitki protoplastına verilmesini artıracaktır.

Genetik dönüşüm için, Sonikasyon Destekli Agrobacterium aracılı Dönüşüm (SAAT) tercih edilen yöntemdir ve çıplak DNA ve DNA vektörlerini doğrudan protoplasta aktarmak için kullanılan sonikasyondan önemli ölçüde daha yüksek bir verime sahiptir. Çok sayıda çalışma, sonikasyon destekli Agrobacterium aracılı dönüşümün (SAAT), ultrason dalgaları ve bunun sonucunda ortaya çıkan akustik kavitasyon ile bitki hücrelerinde mekanik bozulma ve yara oluşumunu indüklemek için kullanılabileceğini göstermiştir. Kısa bir ultrasonik tedavi, eksplantların yüzeyinde mikro yaralar oluşturur. Yaralı hücreler, Agrobacterium'un bitki dokularının daha derin kısımlarına nüfuz etmesine izin vereceğinden, bitki hücrelerinin enfekte olma olasılığını artıracaktır. Ek olarak, salgılanan fenolik bileşikler dönüşümü arttırır. Ultrasonik olarak üretilen mikro yaralar, bakteriler tarafından eksplant penetrasyonunu da daha uygun hale getirir. SAAT, özellikle Agrobacterium'a dirençli olduğu düşünülen bitki türlerinde genetik transformasyon için başarıyla kullanılmıştır.
Çok basit ve ucuz bir yöntem olmasının yanı sıra, Agrobacterium aracılı gen transferinin önemli ölçüde artması SAAT'in en büyük avantajlarıdır. Chenopodium rubrum L. ve Beta vulgaris L.'nin transformasyonunda SAAT'in başarılı bir şekilde uygulanmasının yanı sıra, bu yaklaşım, kuşlarda en yüksek sistemik LT-B'ye özgü IgG titrelerinin tespit edildiği Nicotiana tabacum'da rekombinant Escherichia coli vahşi tip ısıya dayanıksız holotoksin ve Escherichia coli mutant LT aşı adjuvanlarının üretiminde de uygulanmıştır.
(bkz. Laere ve diğerleri, 2016; M. Klimek-Chodacka ve R. Baranski, 2014)

Bitki Hücrelerinde Sonoporasyon Yoluyla Gen Transferi için Genel Prosedür

1. Genetik materyalin hazırlanması: Bitki hücrelerine eklemek istediğiniz genetik materyali hazırlayarak başlayın. Bu plazmid DNA, RNA veya diğer nükleik asitler olabilir.
2. Bitki Hücre İzolasyonu: Hedeflemek istediğiniz bitki hücrelerini izole edin. Deneyinize bağlı olarak, bu hücreler bitki dokularından veya kültürlerinden izole edilebilir.
3. Hücre Süspansiyonu: Bitki hücrelerini uygun bir ortamda veya tamponda askıya alın. Bu, hücrelerin sağlıklı ve gen alımına elverişli bir durumda olmasını sağlamak için gereklidir.
4. Sonicator'ınızı kurun: Genlik, zaman, enerji ve sıcaklık gibi parametreleri önceden ayarlayan sonikasyon ile prob tipi sonikatörünüzü hazırlayın. Ultrasonik probu hücre süspansiyonuna daldırın.
5. Sonikasyon: Sonikasyon prosedürünü başlatın. Prob ucunun hızlı salınımı, sıvıda kavitasyon kabarcıkları oluşturur. Bu kabarcıklar ultrasonik dalgalar nedeniyle genişler ve çöker, süspansiyonda mekanik kuvvetler ve mikro akış oluşturur.
6. Sonoporasyon: Kavitasyon tarafından üretilen mekanik kuvvetler ve mikro akış, bitki hücrelerinin zarlarında geçici olarak gözenekler ve delikler oluşturur. Süspansiyonda bulunan genetik materyal, bu gözeneklerden bitki hücrelerine girebilir.
7. Kuluçka: Sonoporasyon tedavisinden sonra, bitki hücrelerini zarlarını iyileştirmelerine ve stabilize etmelerine izin vermek için kuluçkaya yatırın. Bu, hücre sağkalımını ve başarılı gen transferini sağlamak için çok önemli bir adımdır.

Agrobacterium veya Lipozomlar Yoluyla Gen Transferi

Bitki hücresini transfekte etmek için iki yaygın form vardır. Genetik materyalin taşıyıcısı olarak ya bir Gram-negatif bakteri cinsi olan agrobacterium'u ya da lipozomları kullanırlar.

• Agrobakteri Aracılı Sonoporasyon: Agrobacterium tumefaciens, bitki genetik mühendisliğinde yaygın olarak kullanılan bir bakteridir. Bu yöntemde, istenen geni içeren plazmit DNA, daha sonra bitki hücreleri ile karıştırılan Agrobacterium'a verilir. Hücre süspansiyonu, prob tipi bir sonikatör kullanılarak sonoporasyona tabi tutulur. Ultrasonik enerji, genetik materyalin Agrobacterium'dan bitki hücrelerine transferini arttırır. Bu yöntem, bitkilerin genetik modifikasyonu için yaygın olarak kullanılmaktadır.
• Lipozom Aracılı Sonoporasyon: Lipozomlar, genetik materyal taşıyabilen lipid bazlı veziküllerdir. Bu yöntemde, plazmit DNA veya diğer nükleik asitlerle yüklü lipozomlar bitki hücreleri ile karıştırılır. Prob tipi bir sonikatör kullanılarak sonoporasyon, lipozomların bitki hücreleri tarafından alımını kolaylaştırmak için kullanılır. Ultrason, lipozomların lipid çift katmanlarını bozar ve genetik materyali bitki hücrelerine bırakır. Bu yaklaşım, bitki hücrelerinde geçici gen ekspresyonu çalışmaları için yararlıdır.

Sonikasyon Destekli Agrobakteri Aracılı Dönüşümün (SAAT) Bilimsel Olarak Kanıtlanmış Faydaları

Sonikasyon Destekli Agrobakteri Aracılı Dönüşüm (SAAT) çok sayıda bitki türüne uygulanmıştır. Bitki hücre kültürlerinin kısa ve nispeten hafif bir ultrasonik tedavisi, daha sonra gen taşıyıcı olarak Agrobacterium'un derinlemesine nüfuz etmesine izin veren sonoporasyona neden olur. Aşağıda SAAT'in faydalı etkilerini gösteren örnek çalışmaları okuyabilirsiniz.

Ashwagandha'nın Ultrasonik Destekli Dönüşümü

W. somnifera'da (ashwagandha veya kış kirazı olarak bilinir) dönüşüm verimliliğini artırmak için, Dehdashti ve meslektaşları (2016) asetosiringon (AS) ve sonikasyon kullanımını araştırdılar.
Asetosiringon (AS) üç aşamada ilave edildi: Agrobacterium sıvı kültürü, Agrobacterium enfeksiyonu ve eksplantların Agrobacterium ile birlikte kültürü. Agrobacterium sıvı kültürüne 75 μM AS ilavesinin vir genlerin indüksiyonu için optimum olduğu bulundu.
Sonikasyonun (SAAT) ek uygulaması, en yüksek gen ekspresyonu ile sonuçlandı. Tüylü köklerdeki gusA gen ekspresyonunun, yapraklar ve sürgün uçları sırasıyla 10 ve 20 saniye boyunca sonikasyona tabi tutulduğunda en iyi olduğu bulundu. Geliştirilmiş protokolün dönüşüm verimliliği, yaprak ve sürgün ucu eksplantlarında sırasıyla f.5 ve Y.5 olarak kaydedilmiştir. Diğer protokollerle karşılaştırıldığında, bu geliştirilmiş protokolün dönüşüm verimliliğinin yapraklar için 2,5 kat, sürgün uçları için 3,7 kat daha yüksek olduğu bulunmuştur. Southern blot analizleri, W1-W4 hatlarında gusA transgeninin 1-2 kopyasını doğrularken, geliştirilmiş protokol tarafından oluşturulan W5 hattında 1-4 transgen kopyası tespit edildi.

Sonikasyon destekli Agrobacterium aracılı dönüşüm (SAAT) süresinin W. somnifera yaprağı (a) ve sürgün ucu (b) eksplantlarının dönüşüm frekansı üzerindeki etkisi
(çalışma ve grafik: © Dehdashti ve ark., 2016)

Pamuğun Ultrasonik Destekli Dönüşümü

Hussain ve ark. (2007), sonikasyon destekli pamuk dönüşümünün yararlı etkilerini göstermektedir. Düşük frekanslı ultrasonun neden olduğu akustik kavitasyon, bitki dokusunun yüzeyinde ve altında mikro yaralar oluşturur (sonoporasyon) ve Agrobacterium'un bitki dokusu boyunca daha derin ve tamamen hareket etmesine izin verir. Bu yaralama modası, dokuda daha derinde yatan bitki hücrelerini enfekte etme olasılığını artırır. SAAT'in transformasyon etkinliğini değerlendirmek için GUS gen ekspresyonu ölçüldü. GUS raportör sistemi, özellikle bitki moleküler biyolojisi ve mikrobiyolojisinde yararlı olan bir raportör gen sistemidir. Çeşitli SAAT parametreleri ayarlanarak, olgun embriyoların eksplant olarak kullanılmasıyla pamukta GUS geçici ekspresyonu önemli ölçüde arttırılmıştır. GUS ilk olarak eksplantların inkübasyonundan 24 saat sonra tespit edildi ve 48 saat boyunca, GUS ekspresyonu çok yoğundu, bu da sonikasyon destekli Agrobacterium aracılı dönüşümü (SAAT) takiben pamuk eksplantının başarılı dönüşümünün yararlı bir göstergesi olarak hizmet etti. Çeşitli dönüşüm tekniklerinin (yani biyolistik, Agro, BAAT, SAAT), sonikasyon destekli Agrobacterium aracılı dönüşümün (SAAT) karşılaştırılması, dönüşümün en iyi sonuçlarını gösterdi.

GUS'un geçici ifadesi temelinde dönüşüm prosedürünün seçimi. Sonikasyon destekli Agrobacterium aracılı dönüşüm (SAAT), önemli ölçüde daha yüksek bir geçici ifade gösterir.
(çalışma ve grafik: © Hussain ve ark., 2007)

Sonoporasyon ve SAAT için Yüksek Performanslı Ultrasonik Çözümler

Hielscher Ultrasonics, laboratuvarlar, araştırma tesisleri ve çok yüksek verime sahip endüstriyel üretim için yüksek performanslı ultrasonicators geliştirme ve üretiminde uzun süredir deneyimlidir. Mikrobiyoloji ve yaşam bilimleri için Hielscher, belirli dokular ve tedavileri için gerekli olan farklı gereksinimleri karşılamak için çeşitli çözümler sunar. Çok sayıda numunenin aynı anda ultrasonikasyonu için Hielscher, çok kuyulu plakalar, 10 şişeye kadar (örneğin, Eppendorf tüpleri) veya ultrasonik CupHorn'un sonikasyonu için VialTweeter için UIP400MTP sunar. Prob tipi ultrasonicators, laboratuvar homojenizatörleri olarak 50 ila 400 watt arasında mevcuttur, endüstriyel sistemler ise 500 watt ila 16kW güç aralığını kapsar.
Lütfen bizimle iletişime geçin ve başvurunuz ve süreç gereksinimleriniz hakkında bize bilgi verin. Deneyimli personelimiz, biyolojik işleminiz için en uygun ultrasonicator'ı önermekten memnuniyet duyacaktır.
Aşağıdaki tablo size ultrasonicators'ımızın yaklaşık işleme kapasitesinin bir göstergesini verir: